互补于hTERT关键区段的反义RNA抑制肝癌细胞

目的研究针对人类端粒酶催化亚单位(hTERT)调控区C-MYC结合位点的反义RNA抑制肝癌细胞生长。方法细菌内同源重组构建反义RNA腺病毒(rAd-asmycb),转染HepG2.2.15肝癌细胞,流式细胞术检测细胞凋亡,透射电镜下观察凋亡细胞形态,聚合酶链反应-酶联免疫分析(PCR-ELISA)、逆转录-PCR(RT-PCR)分别检测细胞端粒酶活性及mRNA水平上hTERT表达。结果反义RNA抑制肝癌细胞生长,细胞凋亡率为40.7%,显示特征性凋亡细胞形态,能够显著降低细胞端粒酶活性,在mRNA水平上抑制hTERT表达。结论hTERT调控区C-MYC结合位点可能是肝癌基因治疗的有效靶位。     

反义端粒酶RNA对SMMC7721细胞P16、P21表达的增强作用

目的 观察反义端粒酶RNA对SMMC7721细胞周期的影响,检测P16和P21的表达,探讨端粒酶与细胞期调控间的关系及反义端粒酶RNA在肝癌基因治疗中的意义。方法 经脂质体介导,将反义端粒RNA真核表达载体pBBS212－hTR导入SMMC7721细胞中。细胞克隆转移扩大培养后,采用流式细胞仪、TRAP－PCR－ELISA及免疫组化技术,结合图像分析,在检测SMMC7721／pBBS212－hTR细胞端粒酶活性的同时,检测P16和P21的表达。结果 与对照组相比较,反义端粒酶RNA在抑制SMMC7721／pBBS212－hTR细胞端粒酶活性的同时,检测P16和P21的表达。结果 与对照组相比较,反义端粒酶RNA在抑制SMMC7721细胞端粒酶活性的同时,P16和P21蛋白的表达水平显著增高。结论 转染反义端粒酶RNA在封闭细胞端粒活性表达的同时,伴发P21与P16表达水平的升高。本实验研究为探讨肝癌发病机制及治疗提供了一定的依据。     

逆转录病毒载体介导的端粒酶抑制基因促胰腺癌细胞凋亡

目的研究逆转录病毒载体介导的端粒酶反义RNA促进胰腺癌细胞Can-pan-2凋亡的作用。方法通过电穿孔法将携带正反义端粒酶RNA基因的逆转录病毒载体导入PT67包装细胞,G418筛选抗性细胞,获取稳定表达病毒的产病毒细胞株,以病毒上清感染Can-pan-2细胞,G418筛选获得稳定转染细胞集落并扩增培养,PCR鉴定端粒酶RNA基因的表达,TRAP-PCR-ELISA法检测端粒酶活性,免疫荧光化学检测不同处理组细胞的增殖情况,流式细胞仪(FCM)检测细胞凋亡。结果两种逆转录病毒上清的滴度分别为0.95×106CFU/mL和1.1×106CFU/mL,PCR法可于约500bp处观察到目的基因的表达,反义端粒酶RNA作用后,Can-pan-2细胞端粒酶活性和细胞增殖受到明显抑制,并出现明显的细胞凋亡。结论反义端粒酶RNA可抑制胰腺癌细胞端粒酶活性,促进胰腺癌细胞的凋亡。     

端粒酶RNA反义核酸降低鼻咽癌细胞p53蛋白表达水平

目的:研究端粒酶活性抑制后鼻咽癌细胞p53蛋白表达水平的变化。方法:脂质体介导端粒酶反义寡核苷酸转染鼻咽癌CNE1和CNE2Z细胞株,MTT法检测细胞增殖能力,流式细胞术检测细胞凋亡,免疫组化法检测端粒酶逆转录酶(hTRT)和p53蛋白表达水平。结果:端粒酶RNA反义寡核苷酸可抑制CNE1和CNE2Z细胞的增殖并呈剂量依赖性,流式细胞仪检测出现凋亡峰,反义寡核苷酸组hTRT和p53蛋白表达水平显著低于其它处理组及空白对照组(P＜0.01)。结论:端粒酶RNA反义寡核苷酸抑制鼻咽癌细胞端粒酶活性后可降低p53蛋白表达水平。     

LMP1促鼻咽癌细胞生长与端粒酶活性

为探讨EB病毒潜伏膜蛋白 1(LMP1)促鼻咽癌细胞生长作用与端粒酶活性的关系 ,用LMP1基因真核表达质粒转染鼻咽癌CNE1细胞 ;脂质体介导端粒酶反义核酸处理转染细胞 ;MTT法检测细胞增殖能力 ;原位杂交法检测端粒酶逆转录酶 (hTERT)mRNA表达 ;免疫组化法检测LMP1蛋白表达。结果显示 :转染LMP1基因的细胞增殖能力和hTERTmRNA表达水平均显著高于未转染和转染空载质粒的细胞 (均P <0 0 1)。经端粒酶反义核酸作用 4 8h ,LMP1基因转染细胞的细胞增殖能力、hTERTmRNA和LMP1蛋白表达水平均显著低于空白对照组 (均P <0 0 1) ,反义核酸和脂质体处理组上述各指标无显著变化 ;反义核酸组LMP1基因转染细胞的增殖能力和hTERTmRNA表达水平仍均显著高于未转染细胞和转染空载质粒的细胞 (均P <0 0 1)。以上结果提示 :EB病毒LMP1的促鼻咽癌细胞生长作用与端粒酶活性密切相关。     

人类端粒酶逆转录酶基因转染对足叶乙甙诱导Raji细胞凋亡的影响

探讨人类端粒酶逆转录酶 (hTERT)基因转入Raji细胞后足叶乙甙 (VP 16 )对细胞凋亡的影响。采用脂质体介导的转染方法将重组的hTERT基因转入Raji细胞 ,G4 18筛选 ;采用间接免疫荧光标记法及端粒酶聚合酶链反应 酶联免疫测定法检测hTERT蛋白表达水平和端粒酶活性的变化 ;姬姆萨染色及流式细胞仪观测细胞凋亡。结果发现 :转染hTERT入Raji细胞后 ,其表达hTERT的蛋白及端粒酶活性显著增加 (P <0.0 5 )。 10 μmol/LVP 16作用转染hTERT的Raji细胞 4 8h、72h对细胞生长抑制作用不如转染空载体组及未转染组明显 (P <0 .0 5 )。 10 μmol/LVP 16作用转染hTERT的Raji细胞 72h ,光镜下仅可见到很少量的细胞出现凋亡 ,流式细胞仪测定的细胞凋亡率 (4.34±1.0 3) %显著降低 ,分别与转染空载体组 (33.2 1± 3.12 ) %及未转染组 (31.6 3± 3.0 6 ) %比较 ,P <0.0 5。表明端粒酶活性过表达可使Raji细胞对VP 16产生抗凋亡作用     

RNA干扰MAGEA3对人肝癌细胞凋亡的影响

目的:探讨小发夹RNA(shRNA)载体介导抑制人肝癌细胞中黑色素瘤相关抗原A3(MAGEA3) 的表达和对肝癌细胞凋亡的影响。 方法:构建pSilencer－MAGEA3短发夹状siRNA真核基因表达载体，采用脂质体介导的方法将其转染到人肝癌细胞(mel-ed1)中，用Western印迹法、RT-PCR检测MAGEA3基因在肝癌细胞中的表达；通过原位末端标记TUNEL法、DNA片段化及Annexin V /PI双标记法检测，观察其对肝癌细胞凋亡的影响。 结果:成功构建pSilencer－MAGEA3短发夹状siRNA真核基因表达载体，转染特异性小发夹RNA质粒表达载体的MEL-ED1细胞中MAGEA3基因表达显著抑制(90%)。与对照组比较, pSilencer-MAGEA3转染组肝癌细胞培养 48 h 后,DNA片段化检测出“DNA ladder”、TUNEL法显示细胞典型凋亡特征, Annexin V /PI双标检测转染组细胞凋亡率为21.41%±1.98%,明显高于pSilencer-neo 空载体转染组和未转染组(P<0.01)。 结论:MAGEA3小发夹RNA质粒载体可显著抑制MEL-ED1细胞中的MAGEA3基因的表达,促进肝癌细胞的凋亡, MAGEA3基因具有抑制凋亡的作用。该研究为应用RNAi进行肿瘤的基因治疗提供了实验依据。     

端粒酶RNA基因在白细胞中表达的研究

用RT－PCR的方法钓取端粒酶RNA（hTR）基因的cDNA，将hTR基因克隆到逆转录病毒载体（pLNCX）构建哺乳动物细胞表达质粒，然后经脂质体介导转染人体正常的外周血白细胞中表达。结果表明端粒酶RNA基因的表达，不能激活或重建白细胞的端粒酶活性，流式细胞技术分析结果显示，外源hTR基因的表达不能延长白细胞的寿命，反而抑制白细胞的增殖并促进其凋亡，这可能是因为外源hTR基因的表达一定程度上阻碍了细胞内端粒酶RNA同端粒酶催化亚基的结合，同时也阻碍了端粒酶RNA模板区与端粒DNA之间的结合，从而影响端粒酶活性，抑制了细胞的增殖。     

hTERT反义寡核苷酸促进紫杉醇诱导Hut78细胞凋亡

目的：探讨转染人端粒酶逆转录酶基因（hTERT)反义寡核苷酸后能否增强紫杉醇诱导皮肤T细胞淋巴瘤细胞株Hut78凋亡。方法:采用脂质体介导的基因转染技术将hTERT反义寡核苷酸（AODN)、正义寡核苷酸（SODN)导入Hut78细胞株中，应用端粒酶重复序列扩增及酶联免疫吸附方法（TRAP-PCR-ELISA)、逆转录-聚合酶链反应、四甲基偶氮唑蓝法（MTT)、台盼蓝拒染法和流式细胞仪分析测定联合应用紫杉醇后对细胞端粒酶活性、hTERT mRNA表达、细胞增殖及凋亡的影响。结果:转染hTERT基因反义寡核苷酸并联合应用紫杉醇，48 h后Hut78细胞增殖即被明显抑制，端粒酶活性下降，hTERT mRNA表达降低，分别同SODN联合紫杉醇组及单用紫杉醇组进行比较，有显著差异（P<0.05)； MTT结果显示，紫杉醇对AODN组、SODN组及空白对照组细胞的IC50值分别为(81.10 ± 1.68) nmol/L，(138.70±1.80) nmol/L和(139.40± 5.50) nmol/L，差异显著（P< 0.05)；经流式细胞仪检测，AODN联合紫杉醇组凋亡率明显高于SODN联合紫杉醇组和单用紫杉醇组。结论:hTERT反义寡核苷酸与紫杉醇有协同抗肿瘤效应，并能增加Hut78细胞对紫杉醇的敏感性，促进紫杉醇诱导Hut78细胞凋亡。     

反义DcR3 RNA转染诱导肝癌细胞凋亡的作用

目的研究DcR3反义mRNA在肝癌细胞凋亡中的作用。方法构建pVAXⅠ-as-DcR3反义表达载体，转染肝癌细胞，Western blot法观察DcR3蛋白合成有无降低，流式细胞术、TUNEL等方法观察凋亡变化。结果Western blot证实反义重组体可有效阻滞DcR3表达，同时转染了pVAXⅠ-as-DcR3的肝癌细胞凋亡较对照组增多。结论DcR3反义RNA可使肝癌细胞凋亡增多。     

反义RNA抑制肝癌细胞株端粒酶活性与p16、p21表达的关系

目的：观察反义端粒酶ＲＮＡ对ＳＭＭＣ７２２１细胞的作用,并检测ｐ１６、ｐ２１的表达情况,探讨端粒酶在肝癌发生过程中的可能作用及反义端粒酶ＲＮＡ在肝癌治疗中的意义。方法：经脂质体介导的方法将ｐＢＢＳ２１２－ｈＴＲ（反义端粒酶ＲＮＡ真核表达载体）导入ＳＭＭＣ７７２１细胞中,细胞克隆转移扩大培养后,采用流式细胞仪、ＴＲＡＰ－ＰＣＲ－ＥＬＩＳＡ、电镜、免疫组化技术结合图像分析,在检测ＳＭＭＣ７７２１／ｐＢ     

Bcl-2核酶诱导SMMC7721细胞凋亡与p16,p21蛋白表达的关系研究

目的　观察bcl 2核酶对人肝癌细胞株SMMC 772 1细胞的作用 ,并检测 p16和 p2 1的表达情况。探讨bcl 2核酶在肝癌治疗中的意义。方法　经脂质体介导的方法 ,将PMTr neo (正向bcl 2核酶真核表达载体 )导入SMMC772 1细胞中。细胞克隆转移扩大培养后 ,采用TUNEL法、免疫组化技术结合图像分析 ,在检测SMMC772 1/PMTr neo细胞凋亡的同时 ,检测 p16 ,p2 1的表达。结果　与对照组相比较 ,在bcl 2核酶诱发SMMC772 1细胞发生凋亡的同时 ,p16和 p2 1基因的表达水平显著增高。结论　bcl 2核酶通过封闭bcl 2的表达可促进SMMC772 1细胞凋亡 ,同时伴发 p2 1和 p16表达水平的增高     

端粒酶反义核酸对乳腺癌细胞生长的抑制作用

为了探讨针对人类端粒酶RNA（hTR）基因的反义寡核苷酸（AS－ODN）对乳腺癌细胞系MCF－7的影响，将AS－OND作用于细胞。进行细胞计数，MTT比色法测细胞生长抑制率，PCR－ELISA法测端粒酶活性，流式细胞仪测细胞周期与凋亡。结果表明该AS－ODN能抑制MCF－7细胞生长，降低端粒酶活性并诱导细胞凋亡。针对hTR的AS－ODN对治疗恶性肿瘤有潜在意义。     

VEGFsiRNA对肝癌SMMC 7721细胞株VEGF表达和增殖的抑制作用

目的：探讨VEGFsiRNA对肝癌SMMC 7721细胞株VEGF表达和增殖的抑制作用。 方法： 采用siRNA设计法则并用计算机辅助设计9条VEGFsiRNA序列，长度为19个核苷酸；体外构建9条VEGFsiRNA序列，通过脂质体介导转入肝癌SMMC 7721细胞株，培养72 h，采用CCK8试验分析VEGFsiRNA（25nmol/L）对细胞增殖的抑制效果，用ELISA法检测培养液中VEGF蛋白水平，流式细胞仪检测细胞周期的改变。 结果： VEGFsiRNA1-VEGFsiRNA 9序列对肝癌细胞的增殖有明显抑制作用，与脂质体对照组和空白对照组相比均有显著差异（P<0.05）；其中，VEGFsiRNA 2、VEGFsiRNA 4、VEGFsiRNA 6、VEGFsiRNA 7、VEGFsiRNA 8、VEGFsiRNA 9对细胞增殖的抑制效果均强于反义寡核苷酸组。VEGFsiRNA1- VEGFsiRNA 9序列均能下调肝癌细胞VEGF蛋白的表达水平，以VEGFsiRNA 7和VEGFsiRNA2的效果最强，抑制率分别为52.65%和50.43%。VEGFsiRNA将肝癌细胞阻滞在S期，但未引起细胞凋亡现象。 结论： 成功地设计和合成VEGFsiRNA。后者能有效地抑制肝癌细胞的增殖，降低VEGF蛋白的表达量。     

反义人端粒酶RNA对胃癌细胞生长的抑制效应

目的 探讨反义人端粒酶ＲＮＡ（ｈＴＲ）对胃癌细胞的生长抑制作用。方法 将反义ｈＴＲ真核表达载体经脂质体介导转染入胃癌细胞系ＳＧＣ７９０１,体外培养及接种裸鼠观察其基因转染细胞的细胞周期、超微结构变化、生长速率及致瘤性。结果 反义ｈＴＲ在潮霉素筛选的阳性克隆中稳定表达,正义ｈＴＲ表达下调,并出现凋亡改变。基因转染细胞体外传代培养的生长速率大多减慢,在裸鼠皮下的致瘤性明显降低。荷瘤鼠存活时间延长。结论     

ING4基因真核表达载体的构建及其功能

目的：构建真核表达载体pcDNA3.0-ING4,观察ING4基因对人肝癌SMMC7721细胞周期及凋亡的影响。方法：小鼠肝组织经RT-PCR扩增,构建真核表达载体pcDNA3.0-ING4,分别用双酶切、PCR、基因测序进行鉴定,将其转导进入人肝癌SMMC7721细胞,检测ING4基因的表达情况及其对细胞周期的影响,应用荧光显微镜和激光扫描共聚焦显微镜观察细胞凋亡情况。结果：RT-PCR产物为约750bp的条带,基因测序正确,转导进入人肝癌细胞株SMMC7721后可延长G2期,其凋亡率（23.66％）明显高于对照组（13.75％）。结论：成功分离得到了小鼠ING4基因并成功构建真核表达载体pcDNA3.0-ING4,该质粒转染人肝癌SMMC7721细胞后可延长G2期并可促使细胞凋亡。     

反义hTERT基因对白血病细胞端粒酶表达及活性的抑制作用

目的探讨反义hTERT基因体外对白血病细胞端粒酶基因表达及其活性的抑制作用。方法采用基因重组技术设计并构建了针对端粒酶活性蛋白催化亚单位mRNA的5’端序列的反义pcDNA-hTERT真核表达载体,通过SuperFect(QIAGEN)将其瞬时转染人早幼粒白血病细胞株Hk及人红白血病细胞株K562,并运用流式细胞术测定其细胞凋亡与细胞周期的变化,同时运用实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应方法对其端粒酶蛋白催化亚单位基因的表达水平进行了检测,端粒酶活性的检测则采用了非放射性TRAP-银染法。结果成功地构建了反义pcDNA-hTERT真核表达载体,并将其转染至K562和HL60白血病细胞株。结果与空载体组、空白组相比,反义pcDNA-hTERT组体外显示出明显有效地抑制端粒酶的基因表达及其活性的作用;在细胞凋亡与细胞周期方面,反义组能引起细胞周期左移,增殖分裂能力降低,同时伴有细胞凋亡数的增加。结论研究构建的反义hTERT基因体外确实能明显有效地下调白血病细胞端粒酶的基因表达及其活性,在抗肿瘤基因治疗中具有特异的靶向性和潜在应用的广谱性。     

端粒酶反义腺病毒载体对乳腺癌细胞MCF-7端粒酶的抑制作用

端粒酶ＲＮＡ的反义地人乳腺癌细胞系ＭＣＦ－７细胞端粒酶活性的影响。方法用重组腺病毒转移并表达端粒酶ＲＮＡ的反义ｃＤＮＡ,采用基因重组腺脂质体共转当闰酶反义重组病毒,用Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交鉴定病毒的整合功能,用ＴＲＡＰ－ 染法检测端粒酶活性。结果ＭＣＦ－７细胞是恶性乳腺癌的典型细胞系。对对照组ＭＣＦ－７、ＭＣＦ－７、ｖＡｄ－ＡＡＶ细胞相比,反义病毒感染后的细胞是恶性乳腺癌的典型细胞系。与对照组ＭＣＦ     

维生素D3受体mRNA在肝细胞增殖和肝癌发展中的作用

目的：探讨维生素D3受体mRNA在肝细胞增生和肝癌发展中的作用。方法：体外培养肝癌细胞株SMMC－7721和HCC－T细胞，培养时添加1000nmol/L、100nmol/L、10nmol/L 1，25-(OH)2D3作用1、3、6天后，用四唑盐比色试验（MTT）检测细胞的存活和生长；用反转录PCR（RT－PCR）检测维生素D3受体mRNA的表达。结果：1.25-(OH)2D3可以抑制维生素D3受体mRNA表达阳性的SMMC－7721细胞增生并且有剂量效应关系；对维生素D3受体mRNA表达阴性的HCC－T细胞没有抑制作用。9例肝癌组织标本维生素D3受体mRNA表达均为阳性。结论：1，25－（OH）2D3对于人肝癌细胞株SMMC－7721的增殖具有显著的抑制作用，其机械可能是通过维生素D3受体来实现的。