Bcl-x基因shRNA表达质粒的构建和鉴定

目的:构建含人Bcl-x基因不同位点的一系列shRNA真核表达质粒,为以Bcl-x基因为靶点的基因治疗肿瘤研究奠定基础.方法:将人工合成的针对Bcl-x基因6个不同位点和一个混乱序列的正反链DNA序列经基因重组定向克隆插入到真核表达质粒载体pmU6qa,通过酶切检测确定重组结果,并进行测序加以鉴定.结果:各对DNA序列均按正确方向插入pmU6质粒.结论:成功构建了含人Bcl-X基因6个不同位点的shRNA真核表达质粒.     

新凋亡抑制因子Livin的表达及其临床意义的研究

以前,人们仅认为肿瘤是由于异常细胞过度增殖而形成的,治疗的主要手段局限以杀死肿瘤细胞为着眼点的放化疗.但经临床实践证明,肿瘤的放化疗选择性不高,毒副作用大.随着细胞凋亡的研究深入,发现肿瘤不仅是细胞增殖异常的疾病,同时也是一种凋亡异常的疾病.所以,靶向治疗是提高治疗效果的一条重要的途径,特别是基因治疗和免疫治疗.Livin是一种新近发现的细胞凋亡因子,以其为靶点的抑制物及反义Livin能够保护细胞不进行凋亡,具有广谱和低毒的副作用,为肿瘤治疗提供了新的研究方向.     

RNA干扰靶向cyclin D1基因对K562细胞增殖、细胞周期及凋亡的影响

目的 利用RNA干扰（RNAi）技术体外观测其对K562细胞cyclin D1基因的沉默效应及对细胞增殖、细胞周期及凋亡的影响。方法 通过壳聚糖介导转染K562细胞、Westernblot分析检测转染前后CyclinD1蛋白表达变化；集落形成实验检测细胞增殖能力；流式细胞仪检测细胞周期分布及凋亡率的影响。结果 构建靶向cyclin D1基因的shRNA表达质粒（pshRNA-419和pshtNA-575）经壳聚糖转染后．能显著抑制cyclin D1基因表达；抑制K562细胞增殖，影响其集落形成能力；影响K562细胞周期分布，诱导细胞凋亡。而设计一碱基突变的序列所构建的质粒并无上述生物学效应。结论 cyclin D1基因表达下调可抑制K562细胞生长，并诱导细胞凋亡。提示cyclin D1基因可能是白血病治疗的一个有效靶点的。     

Livin基因和Survivin基因联合靶向siRNA抑制大肠癌细胞增殖的作用

采用1个载体编码2个shRNA技术, 构建Livin基因和Survivin基因联合靶向的siRNA重组表达载体, 研究其对人大肠癌细胞生长协同抑制的增效作用。构建Livin基因和Survivin基因联合靶向的siRNA重组表达载体并转染大肠癌细胞, 通过RT-PCR和Western blotting方法检测Livin基因与Survivin基因的表达, 利用流式细胞仪检测处理后细胞的凋亡效应。经酶切鉴定和测序分析证实Livin基因和Survivin基因联合靶向的siRNA重组表达载体构建成功, 它对大肠癌细胞Livin和Survivin mRNA的抑制率分别为27.90%和32.24%, 对Livin和Survivin蛋白表达的抑制率分别为22.28%和40.86%, 诱导肿瘤细胞凋亡率为 (11.69 ± 1.37) %, 但协同干扰作用比单独干扰Livin基因或Survivin基因弱。Livin基因和Survivin基因联合靶向的siRNA重组表达载体构建成功并能抑制Livin基因和Survivin基因的表达, 但协同抑制作用比单独干扰Livin基因或Survivin基因弱。     

DEAD?box解螺旋酶 46基因沉默对乳腺癌细胞增殖和凋亡的影响

目的分析短发夹 RNA(shRNA)介导 DEAD?box解螺旋酶 46(DDX46)基因沉默对乳腺癌细胞增殖和凋亡的影响。方法采用实时荧光定量逆转录 PCR(RT?qPCR)和蛋白质印迹法(Western Blot)测定人正常乳腺上皮细胞系和乳腺癌细胞系中 DDX46表达差异。以慢病毒介导的 shRNA敲低乳腺癌 SK?BR?3细胞中 DDX46的表达，实验分为空白对照组、阴性对照组和 sh?DDX46组。 RT?qPCR检测各组细胞 DDX46 mRNA的表达水平，蛋白质印迹法检测 DDX46蛋白和凋亡相关蛋白的表达水平，克隆形成和四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法(MTT法)检测细胞生长增殖，流式细胞仪检测细胞凋亡。结果 DDX46 mRNA在各乳腺癌细胞系中的表达量均高于正常乳腺上皮细胞(P＜0.05)。 sh?DDX46组细胞 DDX46 mRAN和蛋白表达水平均明显低于空白对照组和阴性对照组(P＜0.05)。 sh?DDX46组的细胞生长增殖能力明显低于两对照组(P＜0.05)。空白对照组、阴性对照组和 sh?DDX46组 SK?BR?3细胞凋亡率分别为(4.21±1.65)%、(5.36±1.23)%和(10.21±2.39)%，与空白对照组和阴性对照组相比， sh?DDX46组 SK?BR?3细胞凋亡率明显增加(P＝0.007；P＝0.016)。沉默 DDX46后凋亡通路蛋白 B细胞淋巴瘤 /白血病 ?2(Bcl?2)的表达量明显降低(P＜0.05)Bcl?2相关 X蛋白(Bax)和半胱氨酸蛋白酶 ?3剪切体(cleaved Caspase?3)表达明显增高(P＜0.05)。结论 DDX46在乳腺癌中高表达，沉默 DDX46基因能够抑制乳腺癌细胞增殖并促进凋亡，凋亡信号细胞，通路可能是其作用机制之一。     

天麻素对胶质瘤细胞增殖和凋亡的影响

目的 研究天麻素(GAS)对胶质瘤细胞增殖和凋亡的影响及其作用机制.方法 用含体积分数10％ 胎牛血清的DMEM培养基于37℃、体积分数5％CO2的细胞培养箱中培养T98G细胞,实验分为0,2.5,5.0,10μmol·L-1天麻素组和control组、GAS组、GAS+Vector组、GAS+HOTAIR组.以细胞计...     

基因转移FasL诱导人脑胶质瘤细胞凋亡的体外实验研究

目的：探讨体外基因转移Fas配体（Fas-Ligand,FasL)对恶性人脑胶质瘤细胞凋亡的影响，方法：用携带人FasL cDNA的缺陷型重组腺病毒载体（Ad-FL)，在体外转导5株人脑胶质瘤细胞，并使其表达，通过流式细胞仪，RT－PCR，TUNEL法及荧光显微镜分别进行Fas/FasL表达检测和相关凋亡检测，分析，结果：RT－PCR和流式细胞仪检测5株胶质瘤细胞表达均表达Fas，不表达FasL,而Ad-FL转导的5株胶质瘤细胞均能表达FasL,Fas表达水平与抗Fas抗体诱导胶质瘤细胞凋亡敏感性无相关性，Ad-FL能显著诱导5株胶质细胞瘤在体外凋亡或抑制其生长，结论：重组腺病毒FasL在体外诱导人脑胶质瘤凋亡效果显著。     

抗凋亡蛋白Livin在急性白血病中的表达

目的 研究Livin在急性白血病中的表达,探讨其临床意义.方法 采用半定量逆转录-聚合酶链反应(RT PCR)检测40例急性白血病(AL)患者(AL组)Livin mRNA的表达水平,其中初治患者16例(初治亚组)、复发患者11例(复发亚组)、完全缓解患者13例(缓解亚组).另选10例健康人(对照组)的标本作正常对照.结果 初治亚组中Livin mRNA的表达较对照组明显升高(P＜0.05),治疗缓解后的表达水平下降(P＜0.05),复发时又再次升高;初治亚组Livin阳性的患者缓解率(14.3%)低于表达阴性的患者(77.8%)(P＜0.05).Livin mRNA的表达与AL患者性别、年龄无关(P＞0.05).结论 Livin基因的过度表达参与了AL的发病,并且是AL复发的高危因素.Livin基因的高表达是判断AL预后不良的指标之一.     

抗凋亡蛋白Livin在急性白血病中的表达

目的研究Livin在急性白血病中的表达,探讨其临床意义。方法采用半定量逆转录—聚合酶链反应(RT-PCR)检测40例急性白血病(AL)患者(AL组)LivinmRNA的表达水平,其中初治患者16例(初治亚组)、复发患者11例(复发亚组)、完全缓解患者13例(缓解亚组)。另选10例健康人(对照组)的标本作正常对照。结果初治亚组中LivinmRNA的表达较对照组明显升高(P<0.05),治疗缓解后的表达水平下降(P<0.05),复发时又再次升高;初治亚组Livin阳性的患者缓解率(14.3%)低于表达阴性的患者(77.8%)(P<0.05)。LivinmRNA的表达与AL患者性别、年龄无关(P>0.05)。结论 Livin基因的过度表达参与了AL的发病,并且是AL复发的高危因素。Livin基因的高表达是判断AL预后不良的指标之一。     

Effects of hispolon on glioblastoma cell growth

Hispolon is a polyphenolic compound isolated from Phellinus linteus which exhibits antitumor activity. Here, we explored the effects of hispolon on human glioblastoma cells U87MG. Cell viability was examined by MTT assay. Growth was investigated by incubating cells with various concentrations of hispolon (25 and 50 µM) for 24, 48 or 72 h and daily cell count. Cell cycle and apoptosis assay were assessed by flow cytometry. Hispolon decreased cell viability in a dose‐ and time‐dependent manner. The cell cycle distribution showed that hispolon enhanced the accumulation of the cells in G2/M phase. Hispolon decreased the expression of G1–S transition‐related protein cyclin D4 but increased the expression of CDK inhibitor p21. Additionally, hispolon enhanced the expression of p53. Moreover, hispolon treatment was effective on U87MG cells in inhibiting cell viability and inducing cell apoptosis. Our results indicate that hispolon inhibits the cell viability, induces G2/M cell cycle arrest and apoptosis in glioblastoma U87MG cells, and p53 should play a role in hispolon‐mediated antitumor activity.     

短发夹RNA沉默YAP表达对肝癌细胞SMMC-7721增殖和凋亡的影响

目的本实验通过短发夹RNA(shRNA)抑制Yes相关蛋白(YAP)基因的表达,并观察其对肝癌细胞SMMC-7721的增殖、凋亡和周期影响。方法以人YAP mRNA编码区中的4条序列作为RNA干扰靶点,分别构建4个真核表达载体质粒YAP-shRNA-1、YAP-shRNA-2、YAP-shRNA-3、YAP-shRNA-4,用阳离子聚合物转染法瞬时转染,筛选出2个干扰效果较好的质粒,将它们瞬时转染肝癌细胞SMMC-7721,应用实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)和蛋白印迹法检测SMMC-7721细胞中YAP在mRNA和蛋白水平表达的变化。噻唑蓝(MTT)法检测转染后细胞增殖能力,流式细胞术检测细胞凋亡和周期的变化。结果转染后293T细胞中shRNA-YAP-2组与shRNA-YAP-4组YAP mRNA表达明显降低,在SMMC-7721中shRNA-YAP-2组与shRNAYAP-4组的YAP mRNA及蛋白表达水平分别为(0.871±0.081,0.106±0.013)和(1.010±0.097,0.192±0.013),与未转染组(2.399±0.148,0.372±0.007)比较差异有统计学意义(P<0.01)。MTT显示,shRNA-YAP-2、shRNA-YAP-4组细胞生长明显抑制,但未出现阻滞;流式细胞仪分析显示,shRNA-YAP-2组和shRNA-YAP-4组细胞凋亡率分别为(12.0±0.81)%和(5.03±1.01)%,明显高于空质粒组的(2.89±0.08)%(P<0.01)。细胞被阻滞在G2期,G0/G1期出现DNA亚二倍体峰。结论运用shRNA干扰技术,可以有效地干扰肝癌SMMC-7721细胞YAP的表达并能降低YAP的生成,抑制SMMC-7721细胞的增殖和促进细胞的凋亡。     

黄芪对喉癌细胞增殖和凋亡的影响

目的体外观察黄芪对人喉癌细胞系Hep-2的抑制增殖和诱导凋亡作用并探讨其作用机制。方法用20、100、200μg/mL的黄芪作用于Hep-2细胞24 h,MTT法检测细胞抑制率,流式细胞仪检测细胞凋亡率,光学显微镜观察细胞形态学变化。结果 MTT结果显示,黄芪可显著抑制Hep-2细胞增殖且存在剂量依赖性;流式细胞仪检测发现,细胞凋亡率随着黄芪浓度增高逐渐升高,各实验组之间及其与对照组之间比较差异有统计学意义(P<0.05);用药后光镜观察细胞数量减少,荧光显微镜观察可见典型细胞凋亡。结论黄芪可调控喉癌细胞周期,形成G2/M期阻滞,通过抑制增殖和促进凋亡发挥其抗癌作用。     

丙戊酸对人脑胶质母细胞瘤细胞株抑制增殖及诱导凋亡作用研究

目的研究丙戊酸(2-propylpentanoic acid,VPA)体外对人脑胶质母细胞瘤细胞株增殖抑制、诱导细胞周期阻滞及促进凋亡的作用,为临床治疗提供理论依据。方法 MTT比色法检测VPA对胶质母细胞瘤细胞株的杀伤作用;流式细胞术检测其对细胞周期及凋亡的影响作用;Western blot法检测乙酰化组蛋白H3(acetyl-Histone H3)、乙酰化组蛋白H4(acetyl-histone H4)表达量变化情况。结果 VPA对胶质瘤母细胞瘤细胞株SF295、U87具有抑制增殖作用,诱导细胞周期阻滞于G2/M期,乙酰化组蛋白H3、H4表达量呈时间依赖性增加。大剂量可以诱导出现凋亡。结论 VPA能够在体外抑制胶质瘤细胞生长,诱导细胞周期阻滞及促进细胞凋亡,其机制可能与促进组蛋白乙酰化有关。     

小剂量化疗药物对胶质瘤母细胞U87的生长抑制作用

目的 研究体外小剂量化疗药物尼莫司汀(ACNU)、顺铂(CDDP)、卡铂(cap)(均抗癌药)持续给药对人胶质母细胞瘤株U87的生长抑制作用.方法 不同浓度的ACNU、CDDP、CBP分别作用于U87,24 h后撤药(A组)和持续作用于U87 72 h(B组),用MTT法在24、48、72 h分别检测药物的2种作用方式对U87细胞的生长抑制率.结果 不同浓度ACNU的2种方式,作用48、72 h对U87的生长抑制率差异无显著性(P>0.05);不同浓度CDDP和CBP持续作用48、72 h(B组)对U87的生长抑制率显著高于24 h撤药组(A组),2组比较差异性显著(P<005).结论 小剂量化疗药物在一定的浓度范围内持续作用,对U87的体外生长抑制作用与药物浓度和作用时间成正比.     

核因子p65蛋白对胶质瘤细胞增殖和糖代谢的影响

目的 探讨小分子RN A干扰(siRN A )沉默p65基因的表达对胶质瘤细胞生长和糖代谢的影响.方法 应用RNA干扰技术降低p65表达后 ,用四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法和流式细胞术检测胶质瘤细胞的增殖和周期 ,Western blot检测p65下游功能蛋白的变化.结果 抑制p65的表达后 ,U87和U251细胞生长受抑制 ,细胞生长阻滞在G1 期且细胞糖代谢水平下降 ,下游的功能蛋白周期素D1和丙酮酸激酶M 2 (PK M 2 )表达水平降低.结论 干扰 p65的表达可以抑制胶质瘤细胞的生长和糖代谢水平.     

子宫内膜癌中livin蛋白的表达与细胞增殖凋亡的关系

目的:探讨凋亡抑制因子livin在子宫内膜癌中的表达与细胞增殖、凋亡的关系.方法:选取45例子宫内膜癌、8例子宫内膜非典型增生、10例单纯性增生及8例增生期子宫内膜石蜡标本,采用免疫组织化学EliVision两步法检测Livin、ki-67、bcl-2的表达.结果:livin在子宫内膜癌中的表达显著高于子宫内膜不典型增生及良性子宫内膜,livin表达与子宫内膜癌的分化程度有关(P<0.001);livin的表达与bcl-2(r=0.662,P<0.001)和细胞增殖指数(r=0.572,P<0.001)呈显著正相关.结论:livin与子宫内膜癌的分化、增殖有关,还可能和bcl-2协同参与细胞凋亡的调控,可作为反映子宫内膜癌生物学行为的肿瘤标记物,为子宫内膜癌的基因治疗提供新靶点.     

骨化三醇体外诱导人肝癌细胞IGFBP-3的表达及细胞凋亡的实验研究

目的:探讨骨化三醇[2β-(3一hydro-)-calcitriol]对人肝癌细胞HepG2增殖和凋亡的影响及其作用机制。方法:应用MTT比色法观察骨化三醇对HepG2的生长抑制作用,以荧光显微镜和流式细胞仪观察HepGz的凋亡,RT-PCR检测骨化三醇处理前后HepG2细胞中胰岛素样生长因子受体结合蛋白-3(IGFBP- 3)mRNA表达水平的变化。结果:骨化三醇显著抑制HepG2细胞的体外增殖,并诱导细胞凋亡。不同浓度的骨化三醇(10-8,10-7,10-6,10-5mol·L-1)作用HepG2 48 h细胞凋亡率分别达(27.3±s 2．3)％,(33±6)％,(35±5)％,(48±7)％,明显高于对照组(8±4)％(P<0．05)。RT-PCR结果显示骨化三醇处理HepG2 24 h后IGFBP-3 mRNA表达水平明显升高。结论:骨化三醇体外显著抑制HepG2增殖并促进其凋亡,其作用机制可能与通过激活细胞内IGFBP-3 mRNA的表达有关。     

黄连小檗碱对人肠癌Caco-2细胞凋亡和细胞周期的影响

目的探讨黄连小檗碱对人肠癌细胞株Caco-2细胞周期和细胞凋亡的影响及其作用机制。方法采用MTT法,检测不同时间点不同浓度黄连小檗碱对Caco-2细胞的增殖抑制作用;应用流式细胞术(Annexin V-FITC/PI双染法),检测不同浓度黄连小檗碱对Caco-2细胞周期和凋亡的影响。结果不同浓度的黄连小檗碱干预肠癌细胞Caco-2不同时间后,均具有一定的增殖抑制作用,在一定浓度范围内,可以剂量和时间依赖性的抑制Caco-2细胞增殖。黄连小檗碱干预细胞24 h后,可使Caco-2细胞停滞在G2/M期,诱导细胞凋亡(P<0.05)。结论黄连小檗碱可以显著抑制Caco-2细胞增殖,其作用机制可能与阻滞细胞周期从而诱导细胞凋亡有关。     

Evaluation of effect of triterpenes and limonoids on cell growth, cell cycle and apoptosis in human tumor cell line

Six triterpenes and eight limonoids were evaluated for their capacity to inhibit the growth of three human tumour cell lines, breast adenocarcinoma (MCF-7), non-small cell lung cancer (NCI-H460) and melanoma (A375-C5). The mechanisms involved in the observed cell growth arrest of the four most potent compounds were carried out by studying their effect in cell cycle profile and programmed cell death. The results showed that one triterpene (odoratol) and two limonoids (gedunin and cedrelone) caused cell cycle arrest while only the limonoids gedunin and cedrelone were found to be very potent inducers of apoptosis.