豚鼠耳蜗微血管内皮细胞的体外通透性

目的　研究豚鼠耳蜗微血管内皮细胞的体外通透性特征。方法　 (1)用小池技术建立起内皮细胞通透性的体外模型 ;(2 )研究该体外模型耳蜗微血管内皮细胞的跨细胞电阻及对12 5I 牛血清白蛋白的通透曲线 ,并与脑及肺的内皮细胞通透性进行对照。结果　 (1) 3种内皮细胞的体外模型中加入12 5I 牛血清白蛋白后 ,贝克 时间变化图均呈抛物线型上升曲线 ,其通透性从小到大依次为脑、耳蜗、肺内皮细胞 ,各组间相差显著 (P <0 .0 1) ;(2 )耳蜗、脑及肺 3种内皮细胞在培养增殖过程中其跨细胞电阻呈动态增加过程 ,以 5× 10 4/cm2 的细胞密度接种时 ,7d左右电阻均到达峰值 ,其跨细胞电阻峰值大小分别为脑 (2 4 4 .7± 4 6 .9Ω/cm2 ) >耳蜗 (118.9± 18.5Ω/cm2 ) >肺 (4 6 .6± 5 .9Ω/cm2 ) ,且各组间相差显著 (P <0 .0 1)。结论　该模型下耳蜗微血管内皮细胞的通透性与其活体时的通透性特征基本一致。     

改良豚鼠耳蜗微血管内皮细胞的分离与体外培养

目的 探寻耳蜗微血管内皮细胞的分离与体外培养新方法。方法 选取豚鼠4只，无菌条件下分离其耳蜗血管纹和螺旋韧带，37℃下，Ⅳ型胶原酶(0．5mg／ml)消化3h，将消化获得的细胞接种后用内皮细胞条件培养液进行培养，反复刮除杂细胞。用ABC免疫酶染色法检测Ⅷ因子相关抗原来鉴定培养的内皮细胞，设阳性对照、阴性对照和空白对照。结果 所培养的耳蜗微血管内皮细胞纯度极高，胞浆内均含有内皮细胞特有的Ⅷ因子相关抗原。结论 本实验培养获得了纯净的耳蜗微血管内皮细胞，其方法简便、可操作性强，为血迷路屏障的体外研究奠定了坚实的基础。     

豚鼠耳蜗微血管内皮细胞的分离培养与鉴定

目的：建立稳定可靠的耳蜗微血管内皮细胞分离培养方法。方法：采用 显微解剖法分离出耳蜗血管纹,组织块培养法进行体外培养。结果：按种后2d,部分组织块边缘有散在的细胞生长,之后细胞数逐渐增多,10d左右以组织块为中心可见成片细胞组成的细胞集落。倒置显微镜下,单个培养细胞多呈长梭形,而融合成片状单层的培养细胞排列紧密,有内皮细胞培养时典型的“铺路石样”外观。经纯化后,95％以上的培养细胞第VIII因子相关抗原显示阳性反应。结论：本研究方法能够获取体外培养的耳蜗微血管内皮细胞。     

豚鼠微血管通透性变化在内耳缺血性损伤中的作用

目的　研究豚鼠耳蜗微循环障碍动物模型的耳蜗微血管通透性变化特点 ,了解耳蜗微血管通透性变化在内耳缺血性损伤中的可能作用。方法　①光化学法建立豚鼠耳蜗微循障碍动物模型 ;②改良伊文思蓝荧光法定量研究其耳蜗微血管通透性变化特点 ;③记录CAPN1阈值研究其听力损伤。结果　豚鼠耳蜗发生微循环障碍后 2h和 4h ,伊文思蓝通过耳蜗微血管的渗出量分别为 ( 1 .70 9± 0 .76 9) μg/只和 ( 2 .849± 0 .6 5 3) μg/只 (P <0 .0 1 ) ;CAPN1阈值分别增加 ( 2 4.44± 7.2 7)dBpeSPL和 ( 38.33± 7.91 )dBpe SPL(P <0 .0 1 )。结论　豚鼠耳蜗发生微循环障碍后其耳蜗微血管通透性明显增高并随时间的延长而加重 ,可能是微循环障碍致内耳听力损伤的重要机制之一     

豚鼠内耳微血管内皮细胞的跨细胞电阻

目的　研究豚鼠内耳微血管内皮细胞跨细胞电阻的动态变化及峰值大小。方法　①胶原酶消化法分离培养豚鼠内耳及脑微血管内皮细胞 ,免疫组化法进行鉴定 ;②建立起内皮细胞通透性的体外模型 ,研究该模型下内耳内皮细胞的跨细胞电阻 ,并与脑及肺内皮细胞进行比较。结果　①培养细胞致密融合时具有内皮细胞培养时典型的“铺路石样”外观 ,与肺内皮细胞株的形态一致 ,经免疫组化检测其内皮细胞标志性抗原Ⅷ因子 ,95 %以上的培养细胞的胞浆中呈棕黄色阳性反应 ;②三种内皮细胞在培养增殖过程中其跨细胞电阻值呈动态变化过程 ,以 5× 10 4 cm2 的细胞密度接种时 ,7d左右电阻到达峰值 ,内耳、脑及肺三种内皮细胞的跨细胞电阻峰值大小分别为 (118 9± 18 5 )Ω cm2 ,(2 44 7± 46 9)Ω cm2 ,(4 6 6± 5 9)Ω cm( n =6) ,三者相差非常显著 (P <0 0 0 1)。结论　内耳微血管内皮细胞跨细胞电阻峰值小于脑内皮而大于肺内皮细胞 ,证明了三者通透性的差别。     

豚鼠血迷路屏障通透性的体外模型

目的 研究豚鼠血迷路屏障通透性体外模型的建立方法及其通透性特征。方法 （1）用组织块贴壁培养法分离培养豚鼠耳蜗微血管内皮细胞，免疫组化法进行鉴定；（2）用小池技术建立起内皮细胞通透性的体外模型，并研究该模型中耳蜗、脑及肺3种内皮细胞对^125I-牛血清白蛋白的通透性；（3）研究豚鼠血迷路屏障对^125I-牛血清白蛋白的通透性。（3）研究豚鼠血迷路屏障对^125I-牛血清白蛋白的通透性。结果 （1）培养细胞致密融合对具有内皮细胞培养时典型的“铺路石样”外观，经免疫组化检测其内皮细胞标志性抗原Ⅷ因子，95％以上的培养细胞的胞质中呈棕黄色阳性反应；（2）耳蜗、脑及肺3种内皮细胞的体外模型中加入^125I-牛血清白蛋白后，贝克－时间变化图均呈抛物线型上升曲线，90min内几乎呈直线；（3）豚鼠血迷路屏障对^125I－牛血清白蛋白的通透性曲线与体外模型相似。结论 血迷路屏障的体外模型能大体反映在体时的通透性特征。     

氧自由基对豚鼠耳蜗微血管内皮细胞凋亡的影响及其机制

目的 研究氧自由基诱导豚鼠耳蜗微血管内皮细胞凋亡及其可能机制.方法 以黄嘌呤氧化酶作用于黄嘌呤而产生氧自由基.不同浓度氧自由基作用于豚鼠耳蜗微血管内皮细胞,用流式细胞术检测凋亡细胞的百分比;用免疫细胞化学法检测Bax及Bcl-2蛋白表达;用RT-PCR方法检测Bax及Bcl-2 mRNA的表达.结果 氧自由基作用后,与空白对照组相比,各个浓度的氧自由基作用组豚鼠耳蜗微血管内皮细胞凋亡率均明显升高(均P<0.01),同时,BaxmRNA及蛋白的表达均显著增强(P<0.05或P<0.01),Bcl-2 mRNA及蛋白的表达明显减弱(均P<0.01).结论 氧自由基可诱导豚鼠耳蜗微血管内皮细胞发生凋亡,其发生机制与其调节Bax/Bcl-2 mRNA及蛋白的表达有关.     

卡波金对豚鼠耳蜗微血管的影响

目的：探讨卡波金（体积分数为95％氧气和体积分数为5％二氧化碳混合气体，carbogen）间断吸入对豚鼠耳蜗微血管的影响。方法：30只健康纯白红目琢鼠随机分为3组：对照组（不做任何处理）；纯氧组（给予间断吸入纯氧）；卡波金组（给予间断吸入卡波金）。用电生理技术测定其听阈；血气分析方法测定氧分压、二氧化碳分压和pH；螺旋韧带管纹铺片技术和电镜观察耳蜗外侧壁微血管和血管纹变化。结果：卡波金组与其他2组比较具有增加血氧含量，扩张耳蜗微血管的作用，ABR及镜下变化比较，差异无显著性。结论：卡波金改善耳蜗微循环和增加耳蜗血氧供应，其效果优于纯氧吸入。提示卡波金对内耳微循环障碍引起的疾病如突发性聋等具有一定的治疗意义。     

TNF-α对体外培养豚鼠耳蜗血管纹微血管内皮细胞通透性的影响

目的 研究TNF-α对体外培养豚鼠耳蜗血管纹微血管内皮细胞通透性的影响.方法 体外分离培养豚鼠耳蜗血管纹微血管内皮细胞并建立耳蜗血管纹微血管内皮细胞通透性体外模型,实验分TNF-α组和对照组.依据作用时间和浓度不同,检测其对伊文思蓝的通透率变化.结果 TNF-α能显著增加耳蜗血管纹微血管内皮细胞的通透性,使伊文思蓝的通透率显著升高(P＜0.01),且随TNF-α浓度升高和作用时间的延长而升高.结论 TNF-α可以显著的增加耳蜗血管纹微血管内皮细胞的通透性.     

烟曲霉对肺微血管内皮细胞通透性的影响及可能机制

目的 探讨烟曲霉对肺微血管内皮细胞通透性的影响及其机制。方法 利用激光共聚焦扫描显微镜检测人肺微血管内皮细胞肌动蛋白（F-actin）和细胞跨膜电阻仪测定细胞跨膜电位,以观察细胞通透性的改变,并利用p38 MAPK抑制剂、ROCK抑制剂和蛋白激酶C抑制剂探讨其机制。结果 烟曲霉处理后肺微血管内皮细胞F-actin染色的荧光强度显著下降（P<0.01）,烟曲霉处理组也出现细胞跨膜电阻值的显著下降（P<0.01）。与单独烟曲霉处理组比较,SB203580（20μmol/L, p38 MAPK抑制剂）干预组、Y27632（20μmol/L, ROCK抑制剂）干预组以及LY317615（10μmol/L,蛋白激酶C抑制剂）干预组的跨膜电阻值均显著上升（P<0.05）。结论 烟曲霉处理致肺微血管内皮细胞通透性增加,其机制可能涉及p38 MAPK、ROCK激酶以及蛋白激酶C通路。     

人循环内皮祖细胞的分离培养和诱导分化

目的研究人循环内皮祖细胞（EPCs）分离、培养、分化及鉴定。方法采用Ficoll密度梯度离心法从人外周血中分离单个核细胞,接种于含血管内皮生长因子（VEGF）及优质胎牛血清的M199培养液中,对其进行体外诱导分化培养,以免疫组化、细胞荧光化学法及流式细胞检测法鉴定贴壁细胞的内皮细胞特异性标志。结果人外周血单个核细胞（MNCs）经体外培养,表达内皮细胞的特异性抗原,包括VWF、CD31和CD34,并显示出能内吞乙酰化低密度脂蛋白（ac-LDL）,结合UE小1等内皮细胞特性,提示这些细胞具有内皮细胞的表面蛋白特性和具有内皮细胞功能。结论人外周血中存在具有分化增殖能力的EPCs,在一定培养条件下可分化为血管内皮细胞。     

脐血内皮细胞对脐血早期造血细胞的体外扩增作用

目的:观察脐血内皮细胞联合细胞因子组合通过非接触方式对脐血早期造血细胞的扩增作用.方法:采用优化的内皮细胞培养基培养脐血内皮细胞;实验组分为细胞因子组合组(SCF IL-3 IL-6 GM-CSF,CKs组)和脐血内皮细胞联合CKs非接触脐血CD34 细胞培养组(noncontact组).MiniMACS磁珠分选脐血CD34 细胞;检测CKs组与nocontact组培养7d后脐血早期造血细胞的扩增倍数.结果:noncontact组和CKs组都能扩增早期造血细胞, noncontact组对早期造血细胞的扩增倍数显著优于CKs组的扩增倍数.结论:脐血内皮细胞联合CKs非接触培养对脐血早期造血细胞的扩增作用显著优于CKs组.     

建立体外血脑脊液屏障模型方法学研究

目的：采用原代分离培养Sprague-Dawley（SD）大鼠脑微血管内皮细胞（brain microvascular endothelial cells,BMECs）和星形胶质细胞（astrocyte,As）建立相对简单可靠、重复性好、接近在体状态的体外血脑脊液屏障（blood-cerebrospinal fluid barrier,blood-CSF barrier）模型。方法：原代分离、纯化和培养BMECs 和As,通过细胞形态学和免疫细胞化学染色方法鉴定原代培养的细胞;通过培养在具有特殊质材和孔径的Transwell 小室上建立体外血脑脊液屏障实验模型,采用倒置显微镜观察细胞形态结构,经跨内皮电阻值（trans endothelialelectrical resistance,TEER）、4 h 液面试漏实验、两种特征性酶检测、荧光素钠通透性（sodium fluorescent,Na-FLU）评价模型的屏障功能。结果：原代培养的BMECs 具有典型的“铺路石”样外观,Ⅷ因子鉴定细胞纯度在95% 以上;As 有细长突触,胞质较浅,胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic portein,GFAP）鉴定细胞纯度在95% 以上。通过测定TEER 值共培养模型组显示高电阻值（378.97±11.38） Ω·cm2;4 h 液面试漏试验阳性;γ- 谷氨酰转肽酶（γ-glutamyltranspeptidase,γ-GT）和碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）表达分别为（30.88±2.87） μmol·min-1·mL-1 和（2.51±0.88）金氏单位·100 mL-1;Na-FLU 跨膜渗透系数（2.228±0.85）×106 cm·s-1。结论：建立的体外血脑脊液屏障模型在形态学、电阻和通透性方面具备了血脑脊液屏障的基本特性。     

心钠素在豚鼠耳蜗微血管的分布

目的:观察在豚鼠耳蜗微血管中心钠素(ANP)免疫反应产物的分布,为研究ANP在豚鼠耳蜗微循环中的作用提供形态学基础.方法:采用免疫组织化学ABC法检测ANP在正常豚鼠耳蜗微血管中的分布特征.结果:在耳蜗1～4转的血管纹、蜗轴螺旋动脉主干及底转分支均发现有ANP反应阳性产物;蜗轴螺旋动脉在2～4转的分支为阴性.结论:ANP在内耳微循环的血流量调节方面可能具有重要作用,其分布特点与功能密切相关.     

小鼠骨髓源性内皮祖细胞的体外培养及标志物鉴定

［摘要］目的: 探讨小鼠骨髓来源的血管内皮祖细胞（endothelial progenitor cells,EPCs）的体外培养、诱导分化及表面标志物的鉴别。方法： 收集ICR小鼠骨髓EPCs,Ficoll分离单核细胞,使用含有血管内皮生长因子（VEGF）、成纤维细胞生长因子(FGF)的培养基培养。分别在细胞培养5,10,15及20 d后检测细胞表面的内皮细胞标志物。结果： 培养5 d后细胞开始出现上皮细胞的形态,有伪足出现;培养10 d,细胞开始增殖,成圆形,出现梭形细胞;培养15 d,细胞出现较为典型的内皮细胞形态,铺路石状;培养20 d,细胞出现长梭形拉网状,即类似成熟内皮细胞形态。免疫荧光染色及流式定量检测结果显示,CD34在EPCs中的表达随培养时间延长有渐变减弱的趋势;血管内皮生长因子受体 2（VEGFR-2）在EPCs的表达随培养时间延长有渐变增强的趋势。结论： 骨髓EPCs在特定诱导条件下可分化出典型的成熟内皮细胞,取材方便,扩增能力较强。     

谷氨酸钠对新生豚鼠耳蜗螺旋神经节的毒性损伤

目的研究谷氨酸钠不同用药剂量对新生豚鼠耳蜗螺旋神经节细胞及听力的影响,探索稳定而可靠的谷氨酸钠耳聋模型.方法豚鼠随机分成四组,每组(G0,G1,G2,G4)分别按0,1,2,4 g*kg-1*d-1,ip.给予谷氨酸钠(Glutamate,G),连续7d,停药后饲养35d. 测耳廓反射以及脑干听觉诱发电位;后取耳蜗,纵向石蜡切片,焦油紫染色、观察.结果 G0组死亡率为0/10,听阈为43.5±3.4 dB,平均细胞密度为4345.7±241.4个/mm2;G1组死亡率为2/10,听阈为43.8±9.4 dB,细胞密度为4215.4±295.2个/mm2;G2 组死亡率为4/10,听阈为67.3±23.3 dB,细胞密度为1997.5±1019.8个/mm2 ;G4组死亡率为20/20 .经方差分析,G2组与其他组比较,差异显著,P<0.01,GO组与G1组,差异无显著性,P>0.05.结论谷氨酸钠对新生豚鼠毒性损伤存在剂量依赖关系,2g*kg-1*d-1,ip.可引起均匀一致的耳蜗螺旋神经节细胞的消失,伴明显听力下降,死亡率较低.     

双室体描仪测定豚鼠气道阻力和气道反应性

目的 建立应用双室体描仪测定豚鼠气道阻力和气道反应性的方法,为哮喘的研究提供有效手段.方法 应用双室体描仪分别测定乙酰甲胆碱(Mch)激发后豚鼠气道阻力的回复时间;于实验的第1、15天分别测定正常对照组豚鼠气道阻力和气道反应性2次,每次间隔2 h,验证测定结果的重复性;观察OVA致敏豚鼠OVA激发前后气道阻力和气道反应性的变化情况.结果 PC100浓度的Mch雾化后,豚鼠在1 h内气道阻力回到基线水平.正常对照组豚鼠在第1、15天分别测量两次的基础气道阻力sRaw为(3.25±0.67)cmH2O·s、(3.33±0.58)cmH2O·S、(3.30±0.56)cmH2O·S、(3.32±0.75)cmH2O·S,气道反应性(log2PC100)值分别为8.48±0.94、8.64±1.04、8.56±0.67、8.64±0.60,气道阻力和气道反应性两两比较.差异无统计学意义(P>0.05).致敏豚鼠OVA激发后气道阻力和气道反应性均较激发前显著提高.sRaw分别为(7.08±1.82)啪H2O·s和(2.87±0.53)cmH2O·s(P<0.01),log2PC100值分别为6.64±1.26和8.48+1.17(P<0.01).结论 成功建立了应用双室体积描记法测定豚鼠气道阻力和气道反应性的实验方法.