HPV16E7E6重组腺病毒的构建及免疫效果评价

目的 构建用于宫颈癌治疗的HPV16E7E6重组腺病毒并评价其免疫效果.方法 根据哺乳细胞使用密码子的偏嗜性设计HPV16E7E6融合蛋白表达优势密码子基因序列并合成.将合成的E7E6基因插入腺病毒重组穿棱质粒pCD316后,与Ad5腺病毒骨架质粒共转染293细胞,重组病毒经单斑纯化并进行目的基因插入及表达的鉴定.扩增纯化重组病毒后免疫小鼠,评价其免疫活性.结果 PCR试验证明E7E6密码子优化基因成功插入Ad5病毒;Western blot检测结果表明重组腺病毒中E7E6优化基因能高效表达,该重组腺病毒免疫C57小鼠后,可诱发强特异性T细胞免疫应答,在小鼠体内能完全抑制5×104 TC-1移植瘤细胞的生长.结论 重组HPV16E7E6腺病毒可作为治疗HPV慢性感染或宫颈癌的候选疫苗.     

HPV16型E7重组蛋白的表达及其多克隆抗体的制备

目的制备人乳头瘤病毒(HPV)16型E7原核表达蛋白及其多克隆抗体。方法用PCR方法从宫颈癌组织中扩增HPV16 E7基因,克隆至pET21a(+)载体并构建pET21a(+)/HPV16 E7重组质粒,测序鉴定;将重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3),经异丙基硫代-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导后表达重组蛋白,用Ni-NTA亲和层析法纯化并经SDS-PAGE及Western blot分析鉴定;纯化的HPV16 E7重组蛋白免疫日本大耳白兔制备多克隆抗体,用ELISA检测多克隆抗体的效价,并用Western blot法及免疫荧光技术分析多克隆抗体的特异性。结果 HPV16 E7重组蛋白可通过原核表达系统进行表达和纯化;通过兔免疫后可制备特异性的多克隆IgG抗体,效价达1∶30 000;经Western blot法和免疫荧光染色结果证实兔多克隆抗体可特异性识别HPV16 E7蛋白。结论成功进行了HPV16 E7原核表达并制备了HPV16 E7兔多克隆抗体。     

含密码子优化型HPV16 L1基因重组腺病毒的构建及其免疫效果的研究

目的 构建含密码子优化型HPV16L1基因的重组腺病毒,对其经不同接种途径所诱导的系统性及黏膜免疫效果进行研究.方法 使用Admax系统包装重组腺病毒,纯化的腺病毒以不同方式免疫C57BL/6小鼠,间接ELISA及体外中和实验检测免疫小鼠血清及阴道分泌物中的特异性抗体.结果 重组腺病毒滴鼻接种可同时诱导特异性的系统性及黏膜免疫反应,重组腺病毒肌注免疫仅能诱导系统性免疫反应,而阴道黏膜接种不能有效诱导系统性及黏膜免疫反应.结论 成功构建了含密码子优化型HPV 16 L1基因的重组腺病毒,重组腺病毒肌注可诱导高滴度的血清中和抗体,滴鼻接种可同时诱导特异性的系统性及黏膜免疫反应.     

含HPV16L1基因重组腺病毒和1型重组AAV载体联合免疫效果的研究

目的 对表达HPV16L1抗原的重组腺病毒及1型重组AAV载体联合免疫效果进行研究.方法 分别构建含密码子优化型HPVl6LI基因重组腺病毒rAd-mod.HPV16L1及1型重组从V载体rAAV1-mod-HPV 16L1,将纯化的重组AAV病毒载体以肌注及滴鼻途径单独及联合免疫C57BL/6小鼠,使用体外中和实验检测各组小鼠血清中特异性中和抗体.结果 rAAV1-med-HPV16L1单独及与rAd-mod-HPV16L1联合肌注可诱导高滴度的血清中和抗体,在初免后第16周抗体滴度显著高于其他免疫组,联合肌注组诱导的抗体滴度高于单独肌注组;重组病毒联合滴鼻虽能产生一定的免疫加强作用,但抗体滴度仍显著低于rAAV1-mod-HPV16L1单独及联合肌注组.结论 型重组从V载体联合重组腺病毒以初免.加强模式肌注可诱导更高滴度的血清中和抗体.     

HPV18E2蛋白CTL表位多肽的构建与表达

目的分析HPV18E2蛋白的CTL表位,合成并纯化这些表位多肽,构建表达HPV18E2蛋白的靶细胞,检验特异性CTL对靶细胞的杀伤效果,为进一步研制人乳头瘤病毒18型（HPV18）基因工程疫苗打下基础。方法以重组质粒（pBR322-HPV18）为模板,利用PCR方法扩增HPV18E2 DNA片段,将HPV18E2 DNA与加强绿色荧光质粒（pIRES2-EGFP）重组构建重组质粒（pIRES2-HPV18E2-EGFP）。用酶切电泳及测序检查质粒重组后序列正确性。重组质粒转染Hela细胞。51^Cr释放实验评估CTL杀伤能力。结果克隆重组质粒pIRES2-HPV18E2-EGFP酶切后显示的酶切图谱与预期相同,而且测序验证插入片段全序列无改变。转染并用G418筛选后,在荧光显微镜下可见绿色荧光细胞的表达。三条候选多肽特异性杀伤能力分别为60.00%、71.29%和80.00%。结论三条备选肽段都具有明显的杀伤效应,均为HPV18E2蛋白的有效CTL表位。     

HPV与宫颈癌关系及疫苗研究进展

流行病学和病原学研究表明,人乳头瘤病毒(HV)感染是妇女发生宫颈癌重要的原因之一.HPV是无包膜的小型双链环状DNA病毒,不同基因型病毒对细胞的转化能力不同,其中HPV-16、18与子宫颈癌关系最密切.HPV诱发官颈癌的主要机制,是其E6和E7蛋白基因在宫颈细胞中的表达增加,产生的E6和E7蛋白两个癌蛋白分别与抑癌蛋白p53和pRb结合而诱导后两者降解.HPV疫苗包括预防性疫苗和治疗性疫苗两大类.本文对HPV感染与宫颈癌发生的关系、疫苗研究进展进行了系统的阐述.     

人EPO基因重组腺病毒载体的构建及表达

目的:制备表达人促红细胞生成素基因(hEPO)的重组腺病毒。方法:将hEPO基因亚克隆到穿梭质粒pAdTrack-CMV上,采用细菌内同源重组"两步转化法"构建携带hEPO基因的重组腺病毒载体。获得的重组腺病毒载体线性化后转染HEK293细胞,包装、扩增出重组腺病毒,氯化铯梯度离心法进行纯化,PCR和电镜负染鉴定重组腺病毒,荧光显微镜观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达并检测重组腺病毒的滴度。继而用纯化的重组腺病毒感染HeLa细胞,测定转染效率,以Western blot检测hEPO蛋白的表达。结果:成功构建了携带hEPO基因的重组腺病毒载体pAd-hEPO,PCR、透射电镜和绿色荧光鉴定证实病毒包装成功,并且具有感染力,病毒的滴度可达1.8×1010pfu/mL。Western blot检测表明RAd-hEPO感染的HeLa细胞中hEPO基因能够有效表达。结论:制备的RAd-hEPO可成功表达hEPO基因,为后续开展RAd-hEPO治疗缺血性心脏病的研究奠定基础。     

11型HPV E7蛋白的表达及其多克隆抗体的制备

目的构建人11型乳头瘤病毒(HPV 11)E7蛋白的原核表达载体,表达纯化后制备抗HPV11E7蛋白的多克隆抗体。方法构建pGEX-4T2-HPV11E7原核表达载体,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导大肠杆菌表达可溶性融合蛋白GST-HPV11E7,纯化获取11型HPVE7蛋白。将HPV11E7蛋白免疫新西兰大白兔获得抗HPV11E7的多克隆抗体,用蛋白G琼脂糖纯化获得IgG型多克隆抗体。Western blot法及免疫荧光染色检测该抗体的效价及特异性。结果 SDS-PAGE结果显示,经IPTG诱导6 h后可表达出高水平可溶性GST-HPV11E7融合蛋白。纯化后免疫新西兰大白兔获得抗HPV11E7的血清,纯化获得了IgG型多克隆抗体。Western blot及免疫荧光染色结果显示,兔抗HPV11E7 IgG具有效价高和特异性强的特点。结论成功表达了HPV11E7蛋白并制备了效价较高、特异性较好的IgG型兔抗HPV11E7蛋白多克隆抗体。     

HPV16预防性疫苗的相关研究动态

人类乳头瘤病毒１６型（ＨＰＶ１６）在宫颈癌患者中检出率高达９０％。近年来通过基因工程方法对ＨＰＶ的晚期基因（Ｌ１和Ｌ２基因）编码的外壳蛋白产物的研究很多，发现主要壳蛋白（Ｌ１）可自我组装成病毒样颗粒（ＶＬＰ），并可用途预防性疫苗；基于次要壳蛋白（Ｌ２）的预防性疫苗和核酸水平的预防性疫苗也很有前途。本文就近几年的研究进展及趋势作一综述。     

人LIGHT基因的克隆及其重组腺病毒载体的构建

目的 克隆人LIGHT基因，构建其重组腺病毒载体，以研究LIGHT过表达与腺病毒感染对细胞生长的影响。方法 用RT-PCR法从人外周血单个核细胞（PBMC）中克隆人的LIGHT全长基因。将LIGHT cDNA克隆到穿棱载体pAdTrack-CMV-LIGHT重组质粒中，经酶切线性化后，将重组质粒pAdTrack-CMV-LIGHT和骨架质粒pAdEasy-1，以电穿孔法共转染大肠杆菌BJ5183，获得重组腺病毒质粒。最后，将线性化的重组腺病毒质粒转染293细胞包装获得重组腺病毒，用荧光显微镜、PCR及Western blot分析LIGHT基因的表达。结果 用RT－PCR法从人的PBMC中，扩增出723bp的cDNA，测序证实为人LIGHT基因。荧光显微镜、PCR及Western blot证实，LIGHT重组腺病毒可感染293细胞，并在293细胞内进行有效的复制。结论 成功地克隆了人LIGHT基因，并构建了其重组腺病毒载体，为进一步研究LIGHT基因的功能提供了条件。     

人乳头瘤病毒18型L1-E6、L1-E7嵌合基因表达载体的构建及表达

目的 构建HPV 18 L1－E6，L1－E7嵌合基因的表达载体，并在CHO细胞中表达。方法 克隆HPV18 L1－E6和L1－E7基因，插入中介载体pGEMT-Easy中并测序鉴定。采用PCR定点突变法，突变L1－E6，L1－E7基因序列中与转化作用相关的位点，分别与L1基因连接后插入真核表达载体pVAX1，构建真核表达质粒pVAX-1L1 E6Mxx,L1E7Mxx。用磷酸钙沉淀法，转染CHO细胞，以抗HPV－18L1，抗E6和抗E7特异性单克隆抗体（mAb)做ELISA和免疫细胞化学法检测。结果 ELISA检测显示，转染各种pVAX1-LIE6Mxx-L1E7Mxx融合蛋白表达质粒的细胞提取物的P－N值均＞2．1；免疫细胞化学检测，在胞浆，胞核可见棕黄色颗粒。结论 我建的pVAX1-L1E6Mxx-E7Mxx融合蛋白质表达质粒，可在转当细胞内表达相应的L1－E6Mxx和L1－E7Mxx蛋白，为今后进行DNA疫苗的研究奠定了基础。     

Identification of novel E6-E7 sequence variants of human papillomavirus 16

The rate of evolution of the human papillomavirus 16 (HPV16) genome is low. However, the ability of the E6 oncoprotein to interact with distinct p53 variants causes selective pressure on the E6 gene. In addition, intratypic recombination events in the HPV16 E6 and E7 genes have been characterized as extraordinary phenomena during the evolutionary history of virus. In the present study, we identified two new sequence variants through nucleotide analysis of the E6-E7 region of the HPV16 genome. Maximum-likelihood and empirical Bayesian methods were used in order to identify positive selection at particular residues of the E6 and E7 genes. Using the single recombination breakpoint (SBP) method, we found evidence of recombination events in the E6 ORF. Nucleotide sequence analysis showed that the new sequence variants are phylogenetically distant from the other members of the population. Our results indicate that new evolutionary intermediates of HPV16 might be formed either though positive selective pressure or through recombination events by multiple infections with distinct HPV16 variants.     

表达HPV18E7E6的重组痘苗病毒构建及免疫效果的初步研究

目的 构建表达HPV18E7E6融合蛋白的重组痘苗病毒,并对E7E6蛋白的免疫原性进行研究.方法 将去除了转化活性的HPV18E6、E7基因融合,插入痘苗病毒重组质粒,通过同源重组构建表达HPV18E7E6的重组痘苗病毒,观察其免疫效果.结果 构建了表达E7E6融合蛋白的重组痘苗病毒,PCR鉴定及测序表明融合基因序列与设计相符,正确插入到痘苗病毒TK区域;Western-Blot检测表明该重组病毒能表达HPV18E7E6融合蛋白.免疫后的小鼠可产生E6、E7特异性抗体,但ELISPOT没检测到E7肽库刺激小鼠脾细胞产生分泌IFN-丫的阳性反应.结论 构建了一株表达HPV18E7E6融合蛋白的重组痘苗病毒,可以有效诱发小鼠产生针对E6、E7的体液免疫,但不能诱发产生相应的细胞免疫,为进一步研究不同动物模型中HPV18E6E7的细胞免疫特点提供了实验基础.     

稳定表达人乳头瘤病毒(HPV)58型E6E7融合基因的B16细胞系的建立

目的:构建pIRES-neo-HPV58E6E7真核表达载体,稳定转染入小鼠黑色素瘤B16细胞,建立稳定表达HPV58E6E7基因的B16细胞系。方法:采用PCR方法扩增出HPV58E6E7融合基因的全长序列,利用DNA重组技术将其定向插入到真核表达载体pIRES-neo中,并加入酶切位点和6×his标签,构建重组真核表达质粒pIRES-neo-HPV58E6E7。利用阳离子脂质体介导法将其转染入小鼠黑色素瘤B16细胞,经G418加压筛选出稳定转染的阳性克隆。利用Western blot、流式细胞术、免疫荧光等检测方法验证HPV58E6E7融合基因在稳定转染的B16细胞株中的表达。结果:经PCR、限制性内切酶鉴定及测序分析,pIRES-neo-HPV58E6E7重组质粒构建正确,转染B16细胞株后,经过Western blot、流式细胞术和免疫荧光等检测显示B16细胞株能够稳定、高效表达HPV58E6E7融合基因,表明B16-HPV58E6E7稳定转染细胞系构建成功。结论:成功构建了pIRES-neo-HPV58E6E7真核表达载体,建立了可以高效、稳定表达HPV58E6E7融合基因的B16细胞系。该稳定转染细胞系的建立为进一步研究HPV58治疗性基因疫苗的功能提供了良好的靶细胞,为其在肿瘤免疫治疗中的应用奠定了研究基础。     

重组大鼠脑源性神经营养因子腺病毒的构建及体外表达分析

目的构建含有大鼠脑源性神经营养因子(BDNF)基因的重组腺病毒(AD)载体,并分析其体外表达情况。方法将采用RT-PCR技术获取的大鼠BDNF的cDNA基因定向克隆入穿梭质粒pAdTrack-CMV中。通过与腺病毒骨架载体pAdeasy-1在细菌内同源重组形成重组腺病毒质粒pAd-BDNF,转染人胚肾293细胞后包装成有感染能力的重组腺病毒颗粒(Ad-BDNF)。重组病毒感染体外培养的Hela细胞后,用RT-PCR、Western blot及免疫细胞化学检测细胞BDNF基因及蛋白表达情况。结果 pAd-BDNF测序结果和预期一致,同源重组并经293细胞包装后形成重组腺病毒Ad-BDNF,重组病毒感染Hela细胞后能高水平表达BDNF。结论成功制备了重组腺病毒Ad-BDNF,感染细胞证实其呈分泌表达,为将其进一步应用于神经系统损伤性疾病治疗的研究打下了基础。     

共表达HPV16L1、L2、E6、E7蛋白的重组非复制型痘苗病毒构建及鉴定

目的构建共表达人乳头瘤病毒16型(HPV16)L1、L2、E6、E7蛋白的非复制型重组痘苗病毒人用疫苗株。方法以痘苗病毒为载体、利用同源重组技术筛选共表达HPV16L1、L2、E6、E7蛋白的重组痘苗病毒并对其进行鉴定。结果该病毒在CEF细胞上连续传至第15代,经斑点杂交结果表明重组病毒基因组中有L1、L2、E6、E7基因插入;经WesternBlot检测,重组病毒能稳定表达HPV16L1、L2、E6、E7蛋白。结论非复制型重组痘苗病毒NTVJE6E7CKL1L2可作为预防和治疗HPV16相关肿瘤及其癌前病变候选疫苗。     

人乳头瘤病毒16型L1-E7c嵌合基因的构建表达及免疫学效应的研究

目的 构建人乳头瘤病毒16型(HPV16)L1-ETc嵌合基因并表达融合蛋白,以期获得防治HPV16感染及相关肿瘤的疫苗.方法 以HPV16型的中国人野毒株为模板,利用PCR克隆技术制备HPV16 L1-E7c嵌合基因,并转入原核表达载体pET28a( ),获得pET28a( )-L1-E7c表达质粒.以Western blot方法鉴定融合蛋白与HPV16 L1和E7抗体的特异性结合.应用蛋白纯化仪纯化HPV16 L1-E7c融合蛋白,经过复性后,电镜观察病毒样颗粒(cVLP)的形态结构.纯化的蛋白免疫动物,测定疫苗抗肿瘤的细胞免疫及抗体产生情况.结果 经过序列分析和酶切鉴定表明成功构建了HPV16L1-E7c嵌合基因,并在大肠杆菌中可高效表达L1-E7c融合蛋白.此融合蛋白具有HPV16 L1和E7的抗原性,纯化的蛋白复性后可形成嵌合病毒样颗粒(cVLP),纯化的蛋白免疫动物后,产生特异性细胞和体液免疫反应,具有抗肿瘤活性.结论 构建的嵌合基因HPV16L1-E7c可有效表达HPV16 L1-E7c重组蛋白并形成cVLP.此蛋白在动物实验中具有疫苗的免疫保护作用,为HPV16疫苗的研究奠定了实验基础.     

Photodynamic therapy with recombinant adenovirus AdmIL-12 enhances anti-tumour therapy efficacy in human papillomavirus 16 (E6/E7) infected tumour model

Immunotherapy with photodynamic therapy (PDT) offers great promise as a new alternative for cancer treatment; however, its use remains experimental. Here we investigated the utility of adenoviral delivery of interleukin-12 (AdmIL-12) as an adjuvant for PDT in mouse tumour challenge model. PDT was performed by irradiating Radachlorin in C57BL/6 mice transplanted with TC-1 cells. PDT plus AdmIL-12 treatment for tumour suppression as well as specific immune responses were evaluated with the following tests: in vitro and in vivo tumour growth inhibition, interferon-gamma (IFN-gamma) and tumour necrosis factor-alpha (TNF-alpha) assay, and cytotoxic T lymphocyte (CTL) assay. Direct intratumoral injection of AdmIL-12 resulted in a significant suppression of tumour growth compared to the control group. Treatment of PDT along with AdmIL-12 further enhanced antitumour effects significantly higher than either AdmIL-12 or PDT alone. This combined treatment resulted in complete regression of 9-mm sized tumour in every animal. We also evaluated immune responses induced by these treatments. Combined treatment significantly increased the production level of IFN-gamma and TNF-alpha compared with that by AdmIL-12 or PDT alone. PDT plus AdmIL-12 enhanced antitumour immunity through increased expansion of the CTL subset mediated by CD8+ T cells. Taken together, these results indicate that the high anti-cancer activity of PDT with AdmIL-12 is a powerful tool against cancer therapy and is a promising subject for further investigation.