突触蛋白I片段促进α-突触核蛋白的聚集

目的 探讨突触蛋白I(Synapsin I,Syn I)被剪切后形成的C83片段对α-突触核蛋白聚集的影响。方法 在稳定表达α-突触核蛋白的HEK293细胞、小鼠原代神经元以及Tau P301S转基因小鼠体内分别过表达Syn I全长及其C83片段,通过细胞免疫荧光染色、蛋白免疫印迹技术以及免疫组织化学染色的方法观察Syn I全长及其C83片段对α-突触核蛋白磷酸化及聚集的影响。结果 Syn I C83片段促进HEK293细胞中α-突触核蛋白的磷酸化、泛素化以及聚集,并诱导小鼠原代神经元以及Tau P301S转基因小鼠体内α-突触核蛋白的磷酸化和聚集。结论 在细胞和动物模型中Syn I C83片段均可以促进α-突触核蛋白的聚集,这可能是Syn I C83片段导致认知功能障碍的重要原因之一。     

铁离子对α-突触核蛋白聚集的诱发作用具有剂量和时间依赖性(英文)

目的帕金森氏病的一个重要标志是胞浆内路易小体的形成。路易小体的主要成分是α-突触核蛋白的聚集体,它和铁的积聚一同存在于黒质区。本实验旨在研究铁和α-突触核蛋白聚集的关系。方法 SK-N-SH细胞在不同浓度的三价铁作用下,分别孵育24h或48h,用MTT法和硫磺素S染色法分别检测细胞存活率、观察α-突触核蛋白的聚集情况。结果随着铁离子浓度的升高,细胞存活率显著下降。其中5mmol/L和10mmol/L三价铁引起的α-突触核蛋白的聚集相较于1mmol/L的三价铁引起的聚集更为严重。此外,在同一浓度的三价铁作用下,孵育48h引起的聚集比孵育24h引起的聚集更严重。结论铁离子诱发的α-突触核蛋白的聚集具有剂量和时间的依赖性,并且α-突触核蛋白的聚集介导了铁的毒性作用。     

α-突触核蛋白病类朊蛋白样发病机制研究进展

突触核蛋白病是具有α-突触核蛋白病理特征的疾病,包括帕金森病、路易体痴呆、路易体变异型阿尔茨海默病、多系统萎缩、单纯性自主神经功能障碍以及脑内铁沉积神经变性病-1型,其共同病理特征是α-突触核蛋白选择性地在易损的神经元和神经胶质细胞中积聚,形成包涵体。近年来多项研究表明错误折叠的α-突触核蛋白是引起这一类疾病的主要原因,而且其具有与朊蛋白相似的作用方式,在细胞内和细胞间发生转移从而在神经系统内播散,导致多种神经变性疾病的发生和进展。本文就α-突触核蛋白病类朊蛋白样发病机制研究进展进行综述。     

α-突触核蛋白的表达与氧化应激水平的相互影响

目的 探讨氧化应激与在稳定转染α-突触核蛋白(α-synuelein)的大鼠嗜铬细胞瘤细胞(PC12细胞)中α-突触核蛋白表达的相互影响.方法 测定末转染、转染空质粒、已稳定转染野生型(WT)及突变型(A53T)α-突触核蛋白的PC12细胞的活性氧(ROS)水平,并以实时定量PCR法和免疫印迹(Western blot...     

姜黄素通过诱导热休克蛋白70保护多巴胺能细胞

目的 探讨姜黄素通过诱导热休克蛋白70(Hsp70)高表达,抑制α-突触核蛋白的异常表达和聚集,促进蛋白酶体系统降解异常α-突触核蛋白对多巴胺能细胞的保护作用.方法 选用大鼠嗜铬细胞瘤细胞株(PCI2细胞),鱼藤酮诱导其损伤建立帕金森病细胞模型,利用姜黄素进行干预:采用MTT法检测细胞活力,荧光酶标仪检测蛋白酶体水解酶活性,Western blot检测Hsp70和α-突触核蛋白的表达,免疫荧光法检测细胞内Hsp70的表达和α-突触核蛋白的聚集.结果 鱼藤酮组PC12细胞活力及蛋白酶体水解酶活性明显降低,Hsp70的表达轻度增加,α-突触核蛋白表达和聚集明显增加,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05).经不同浓度姜黄素预处理4h后与0.1 μmol/L鱼藤酮共同孵育PC12细胞24 h,与鱼藤酮组比较,0.5 μmol/L和1.0 μmol/L姜黄素使细胞活力以及蛋白酶体水解酶活性明显升高,Hsp70表达明显升高,α-突触核蛋白的表达和聚集明显减少,差异有统计学意义(P<0.05);5.0 μmol/L和10 μmol/L姜黄素对鱼藤酮的拮抗作用明显减弱,细胞活力与鱼藤酮组比较差异均无统计学意义(P>0.05),胰蛋白酶、多肽-谷氨酰-多肽水解酶活性与鱼藤酮组比较差异均无统计学意义(P>0.05);10 μmol/L姜黄素组糜蛋白酶样水解酶活性进一步降低,与鱼藤酮组比较差异有统计学意义(P<0.05).结论 低浓度姜黄素能够通过诱导PC12细胞表达Hsp70,诱导蛋白酶体水解酶活性表达,进而抑制α-突触核蛋白的表达和聚集,从而拮抗鱼藤酮诱导的PC12细胞的损伤.     

聚集素蛋白在聚集体形成中的参与机制

目的探讨聚集素蛋白在聚集体形成中的参与机制。方法本实验分为处理组、对照组和未处理组．处理组用100nmol／L鱼藤酮．对照组用0．01％的二甲基亚砜处理多巴胺能SK-N-SH细胞。然后用Trypan Blue法检测细胞存活率．Western blot检测细胞内聚集素蛋白表达的变化。在处理组和对照组中．用HE法检测聚集体的形成．免疫荧光双标检测聚集素蛋白与细胞内聚集体的关系，免疫共沉淀检测α-突触核蛋白与聚集素蛋白的相互作用情况。结果鱼藤酮损伤多巴胺能SK-N-SH细胞，并形成类似Lewy体的聚集体结构．其中聚集素蛋白和α突触核蛋白、波形蛋白和泛素共存在聚集体中。100nmol／L鱼藤酮在6h后．引起聚集素蛋白的表达升高．与α突触核蛋白的相互作用无变化；24h时，聚集素蛋白的表达降低．与α突触核蛋白的相互作用也减弱。结论聚集素蛋白确实存在于聚集体中，可能是通过与α突触核蛋白蛋白相互作用而沉积于聚集体中。     

突触核蛋白病中α-syn聚集及播散的机制研究

正突触核蛋白病(α-synucleinopathy)是一类以大脑中不同类型α-突触核蛋白(α-synuclein,简称α-syn)阳性包涵体为病理特征的神经变性疾病,包括帕金森病、路易体痴呆、多系统萎缩及其他含α-突触核蛋白病理的少见疾病。其中,帕金森病和路易体痴呆的标志是脑干或皮质Lewy小体,而多系统萎缩则表现为少突胶质细胞和神经元的胞浆包涵体[1]。     

Aβ_(1-42)寡聚体对α-syn过表达SHSY5Y~(A53T)细胞自噬功能的影响

目的构建人A53T突变型α-突触核蛋白过表达的SHSY5Y细胞模型,观察Aβ_(1-42)寡聚体对细胞的毒性作用和自噬功能的影响。方法利用慢病毒稳转方法构建A53T突变型α-突触核蛋白过表达的SHSY5Y细胞及空载体对照细胞,RT-qPCR方法检测SHSY5Y细胞中α-突触核蛋白mRNA的表达。用Aβ_(1-42)寡聚体干预两组细胞24 h,CCK-8法检测Aβ_(1-42)寡聚体对细胞增殖的影响,Western Blot检测细胞自噬相关蛋白的表达水平。结果慢病毒转染SHSY5Y细胞后,过表达组细胞内α-突触核蛋白表达水平较正常细胞组及开载体对照组增加,差异有统计学意义(P0.001);人A53T突变型α-突触核蛋白过表达不影响细胞的增殖;不同浓度Aβ_(1-42)寡聚体(0、0.5μmol/L、1.25μmol/L、2.5μmol/L、5μmol/L、10μmol/L)处理细胞24 h后,细胞增殖抑制率成浓度依赖性;Aβ_(1-42)寡聚体处理后,α-突触核蛋白过表达组细胞LC3-Ⅱ,Beclin-1自噬蛋白表达水平较对照组细胞显著降低(P0.05)。结论人A53T突变型α-突触核蛋白过表达不影响的SHSY5Y细胞增殖,Aβ_(1-42)寡聚体对α-突触核蛋白过表达细胞具有显著毒性,对细胞的损伤机制可能通过抑制细胞自噬功能。     

miR-15b对MPP+损伤SH-SY5Y细胞中α突触核蛋白表达的影响

目的研究miR-15b对MPP+(1-甲基-4-苯基-吡啶离子)损伤SH-SY5Y细胞中α突触核蛋白表达的影响以及在帕金森病(Parkinson disease,PD)发病机制中的作用。方法通过CCK-8检测出MPP+诱导SH-SY5Y细胞为PD细胞模型的最适浓度和时间,然后将过表达和沉默miR-15b的质粒转染到PD细胞模型内,再通过Real Time-PCR和Western Blot检测miR-15b和α突触核蛋白的表达量。结果 SH-SY5Y细胞经MPP+诱导后细胞形态发生改变、细胞增殖能力降低,过表达miR-15b后α-synuclein和α突触核蛋白的表达量均降低(P 0. 05),沉默miR-15b后α-synuclein和α突触核蛋白的表达量均升高(P 0. 05)。结论 miR-15b可以抑制PD细胞模型内α-synuclein和α突触核蛋白的表达。miR-15b可能参与了帕金森病患者中脑黑质多巴胺能神经元内α突触核蛋白的富集调节机制。     

帕金森病模型鼠黑质α-突触核蛋白表达升高并集聚

目的观察低剂量1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)对小鼠黑质多巴胺能神经元α-突触核蛋白表达的影响。方法C57BL小鼠腹腔注射MPTP20mg/kg体重,每周注射1次连续3周,观察小鼠行为改变,应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、Western印迹法、免疫组化染色检测α-突触核蛋白表达,荧光双标染色观察多巴胺能神经元内α-突触核蛋白聚集。结果与注射生理盐水组相比,注射MPTP组小鼠出现暂时性躯干震颤、竖毛、动作减少等;α-突触核蛋白基因表达百分比(79·5%±0·8%,生理盐水组为19·2%±3·3%,P<0·05)及蛋白表达百分比(82·2%±4·1%,生理盐水组为18·5%±1·0%,P<0·05)均明显增加;黑质部酪氨酸羟化酶(TH)阳性细胞数减少,α-突触核蛋白阳性细胞数增加;α-突触核蛋白与硫磺素S、TH与硫磺素S复合定位染色的阳性细胞数均升高。结论低剂量MPTP可诱导小鼠行为改变,黑质多巴胺能神经元α-突触核蛋白表达升高,并出现蛋白聚集。     

1-甲基-4-苯基吡啶离子诱导嗜铬细胞瘤细胞自噬应激并导致α-突触核蛋白的自噬性清除障碍

目的 探讨1-甲基-4-苯基吡啶离子(MPP+)所诱导的自噬应激在嗜铬细胞瘤(PC12)细胞损伤中的作用以及MPP+导致α-突触核蛋白自噬性清除障碍及其异常聚集的可能机制.方法 在MPP+处理细胞24 h后,采用四甲基偶氮盐法检测细胞活力,Western blot检测α-突触核蛋白及微管相关蛋白1轻链3-Ⅱ(LC3-Ⅱ)在蛋白水平表达的变化,并用MDC染色和免疫荧光标记观察自噬水平的变化及α-突触核蛋白、LC3-Ⅱ和溶酶体相关膜蛋白-1(LAMP-1)在细胞内的共定位情况.结果 MPP+处理后细胞的活力明显下降;与未处理组相比(PC12组:0.20±0.08;A30P组:0.76±0.09),PC12+MPP+组(0.66±0.07,t=5.7271,P=0.0023)和A30P+MPP+组(1.71 4±0.40,t=8.6100,P=0.0005)α-突触核蛋白表达增加;LC3-Ⅱ蛋白的表达水平及自噬泡的平均数目均增高.另外,MPP+处理后,α-突触核蛋白和LC3-Ⅱ的荧光信号及其共定位增加,尽管LAMP-1标记的溶酶体荧光信号增加,但与LC3-Ⅱ标记的自噬体共定位程度却减小.结论 MPP+导致自噬体与溶酶体的融合出现障碍,引起α-突触核蛋白的自噬性清除障碍与自噬应激的出现,最终导致细胞的损伤甚至死亡.     

唾液细胞外囊泡中α-突触核蛋白寡聚体诊断多系统萎缩-帕金森型的价值

目的研究多系统萎缩-帕金森型(MSA-P)患者唾液细胞外囊泡中是否存在外泌体,并探讨唾液细胞外囊泡α-突触核蛋白寡聚体在诊断MSA-P中的作用。方法选择2016-11-01—2017-12-31就诊于北京天坛医院神经变性病科的MSA-P患者16例(MSA-P组),另招募健康对照者60名,收集两组观察者唾液,运用XYCQ EV Enrichment Kit富集唾液中细胞外囊泡,采用Western blot验证外泌体通用标记物的表达,采用Nanosight 300纳米颗粒跟踪分析仪分析唾液细胞外囊泡粒度大小,采用电化学免疫荧光技术检测唾液细胞外囊泡中α-突触核蛋白寡聚体水平,采用ROC曲线分析唾液细胞外囊泡中α-突触核蛋白寡聚体诊断MSA-P的价值。结果 MSA-P患者唾液细胞外囊泡中存在外泌体通用标记物Alix和CD9表达,囊泡大小为30～400nm;与健康对照组比较,MSA-P组唾液细胞外囊泡α-突触核蛋白寡聚体水平明显升高[(19.32±8.13)pg/ng比(1.37±0.24)pg/ng;t=3.786,P0.01];α-突触核蛋白寡聚体ROC曲线下面积0.947(P0.01),最佳临界值为2.085pg/ng,其诊断MSA-P的敏感性为93%,特异性为86%。结论 MSA-P患者唾液细胞外囊泡中存在外泌体;唾液细胞外囊泡中α-突触核蛋白寡聚体有望成为诊断MSA-P的生物学标记物。     

血浆及唾液中α-突触核蛋白作为帕金森病生物学标记物的研究

目的研究帕金森病(PD)患者血浆及唾液中α-突触核蛋白的浓度能否作为帕金森病的外周生物学标记物。方法选择患者35例(PD组).健康者25例(对照组)。α-突触核蛋白通过ELISA方法检测。结果与对照组比较,PD组血浆α-突触核蛋白浓度较高,而唾液中较低,在血浆中α-突触核蛋白作为PD标记物的诊断中,ROC曲线下面积为0.727(P=0.003),最佳临界值为157.86 ng/L,敏感性为68.6%,特异性为72.0%。而唾液α-突触核蛋白作为诊断指标,ROC曲线下面积为0.785(P=0.00),最佳临界值为211.14 ng/L,敏感性为82.9%,特异性为80.0%。结论血浆及唾液中α-突触核蛋白浓度可作为帕金森病诊断指标,有望成为诊断PD的外周生物学指标。     

唾液α-突触核蛋白和DJ-1蛋白水平对帕金森病的诊断价值

目的探讨唾液α-突触核蛋白和DJ-1蛋白水平在帕金森病(Parkinson disease,PD)诊断中的应用价值。方法纳入临床确诊的原发性帕金森病患者27例,健康对照组27例。收集一般临床资料,采用HohnYahr分期、帕金森病统一评定量表(UPDRS)-Ⅱ/Ⅲ、嗅觉得分、蒙特利尔认知评估量表(Mo CA)、简易精神状态评价量表(MMSE)进行病情评估。酶联免疫吸附实验(ELISA)方法定量测定唾液中α-突触核蛋白和DJ-1蛋白含量,所得数据与对照组进行统计学差异分析,并分析与年龄、性别、病程之间的相关性。结果 PD组的α-突触核蛋白浓度(1269.02±16.09 pg/m L)和DJ-1浓度(6.07±3.23 ng/m L)均明显低于对照组的α-突触核蛋白浓度(1350.51±25.79 pg/m L)和DJ-1浓度(8.43±4.33 ng/m L),且差异均具有统计学意义(P值分别为0.010、0.027)。对于区别PD和正常对照组,α-突触核蛋白和DJ-1蛋白水平的敏感度分别为55.56%、77.8%,特异度分别为89.19%、55.6%。PD患者的年龄、性别、UPDRS-Ⅱ/Ⅲ评分、Hohn-Yahr分期、嗅觉得分、MMSE评分、Mo CA评分与唾液中α-突触核蛋白、DJ-1蛋白浓度均无显著相关(P0.05)。结论检测唾液α-突触核蛋白和DJ-1蛋白水平可能是PD的一种辅助诊断手段。     

安颤灵对泛素-蛋白酶体通路损伤细胞模型的保护作用

目的 利用中药血清药理学方法探讨安颤灵含药血清对lactacystin诱导PC12细胞损伤的保护作用及其可能机制. 方法 按照血清药理学实验方法制备安颤灵含药血清,将含药血清分为大、中、小剂量组(分别按7.3 g/kg、3.65 g/kg、1.83 g/kg添加药物),用lactacystin建立PC12细胞泛素-蛋白酶体系统(UPS)损伤模型.MTT方法检测各组的细胞活力.将对数生长期的PC12细胞分为正常组(DMEM+10%空白鼠血清)、损伤组(DMEM+10%空白鼠血清+10 μmol/Llactacystin)、安颤灵中剂量组(含DMEM+10%中剂量安颤灵含药血清+10 μmol/L lactacystin),通过免疫组化方法,观察各组细胞α-突触核蛋白、酪氨酸羟化酶(TH)表达的情况. 结果 与大、小剂量组相比,中剂量组细胞的存活率明显升高,差异有统计学意义(P＜0.05);与正常组相比,损伤组细胞α-突触核蛋白阳性细胞数增多,而TH阳性细胞明显减少,差异有统计学意义(P＜0.05);与损伤组相比,安颤灵中剂量组细胞α-突触核蛋白阳性细胞数减少,TH阳性细胞明显增加,差异有统计学意义(P＜0.05). 结论 安颤灵含药血清能改善细胞UPS的功能,降低细胞内α-突触核蛋白的聚集并上调TH表达,从而起到提高细胞存活率,保护神经元的作用.     

蛋白酶体抑制剂诱导帕金森病PINK1蛋白聚集物的形成与特征

目的研究在蛋白酶体抑制剂作用下，帕金森病PINK1蛋白聚集物的形成及其特征。方法应用PCR从胎脑cDNA文库扩增全长PINK1基因，亚克隆至增强型绿色荧光蛋白载体（pEGFP-N1），经测序证实载体构建正确。PINK1-pEGFP-N1表达载体转染非洲绿猴。肾细胞株（COS-7细胞），应用MG-132抑制蛋白酶体活性，Western blot检测PINK1蛋白表达量，荧光染色观察PINK1蛋白是否形成蛋白聚集物，免疫荧光观察构成Lewy小体的两种主要成分：泛素和α-突触核蛋白是否存在于蛋白聚集物中。结果应用MG-132诱导后PINK1蛋白表达量明显增加，PINK1蛋白形成了蛋白聚集物，泛素和α-突触核蛋白与PINK1蛋白聚集物共定位。结论在蛋白酶体抑制剂作用下，PINK1蛋白可形成蛋白聚集物，泛素和α-突触核蛋白是其组成成分。     

α-突触核蛋白致病机制研究进展

细胞内错误折叠的α-突触核蛋白(α-synuclein,α-syn)在中枢神经系统及外周神经系统的沉积导致了帕金森病、路易体痴呆及多系统萎缩等突触核蛋白病的发生,而其病理传播机制尚不完全清楚。最近的研究表明具有神经毒性的寡聚体α-syn的细胞间传播是大脑区域之间疾病传播的主要模式。本综述回顾了不同模式的寡聚体α-syn细胞分泌和再摄取的现有证据,包括细胞间直接转移、朊蛋白样传播、外泌体分泌和内吞作用、纳米隧道及小胶质细胞介导作用,以便更详细地了解突触核蛋白病理学在整个大脑中传播的模式,为防止疾病进展的治疗提供新靶点。     

α-突触核蛋白聚集及传播模型的构建

目的 建立α-突触核蛋白(α-synuclein,α-syn)聚集及传播的细胞和动物模型,为帕金森病的发病机制研究提供基础。方法 亲和层析法纯化α-syn蛋白,体外诱导其聚集成为α-syn纤维(Preformed fibrils,PFFs); 培养稳定表达GFP-α-syn的HEK293细胞系及原代神经元,转导α-synPFFs后免疫荧光染色法观察细胞内α-syn聚集情况; 小鼠立体定位注射α-syn PFFs,免疫组织化学法检测内源性α-syn的聚集及传播情况。结果 纯化的α-syn可在体外聚集形成聚集体; 在细胞及动物水平观察到α-syn PFFs可诱导内源性蛋白的聚集和传播。结论 本研究建立了α-syn聚集及传播的细胞和动物模型,为帕金森病的相关研究打下了基础。     

肠道微生物参与帕金森病发生发展的研究进展

帕金森病是一种由多种因素导致的临床综合征,主要表现为多巴胺能神经元丢失和α-突触核蛋白异常聚集两方面。肠道微生物异常代谢产物可作为炎症因子通过循环途径进入大脑引起线粒体功能障碍,导致多巴胺神经元丢失,也可作为信号因子通过脑-肠-微生物组轴损伤中枢神经系统,并造成α-突触核蛋白错误折叠。本文综述了肠道微生物及其代谢产物在帕金森病中的临床应用和研究进展,以期为帕金森病患者的治疗提供新的思路。