外源性hbFGF cDNA导入人角朊细胞及其表达

目的：观察外源性人碱性成纤维细胞生长因子（ｈｂＦＧＦ）基因导入正常角朊细胞后,能否表达及分泌ｈｂＦＧＦ,并探讨其机理;为开展临床创面基因治疗提供实验依据和奠定物质基础。方法：采用脂质体包埋ｈｂＦＧＦ ｃＤＮＡ的真核表达质粒ｐｃＤＮＡ３－ｈｂＦＧＦ转染培养的人角朊细胞,经Ｇ４１８筛选、克隆、扩大及传代培养含转基因的角朊细胞。用特异性ｎｅｏ探针原位杂交显示转基因角朊细胞内含有拟转入的ｐｃＤＮＡ３－ｈｂ     

人碱性成纤维细胞生长因子基因真核表达质粒的构建

目的：构建人碱性成纤维细胞生长因子（ｈｂＦＧＦ）基因真核表达质粒,为深入研究ｈｂＦＧＦ在组织修复中的分子调节机制及临床应用提供物质基础。方法：含ｈｂＦＧＦ ｃＤＮＡ的ｐＵＣ１８－ｈｂＦＧＦ质粒于大肠杆菌ＪＭ１０９内扩增;提取及纯化ｐＵＣ１８－ｈｂＦＧＦ质粒;经ＤＮＡ序列分析所含ｈｂＦＧＦ ｃＤＮＡ;限制性酶切ｈｂＦＧＦ ｃＤＮＡ片段,连接酶连接到真核表达质粒ｐｃＤＮＡ３－ｎｅｏ内,克隆出真核表达质     

血小板源生长因子-AB对成纤维细胞周期及DNA合成的影响

目的：探讨血小板源生长因子（ＰＤＧＦ）－ＡＢ在创面愈合及瘢痕增生过程中的作用机制;方法：取第３代～６代体外培养的人正常皮肤成纤维细胞（ＮｓＦｂ）及增生性瘢痕成纤维细胞（ＨＴｓＦｂ）,经ＰＤＧＦ－ＡＢ作用后,用＾３Ｈ－ＴｄＲ参入法测定ＤＮＡ合成的变化,用汉式细胞术测定细胞周期的变化。结果：ＰＤＧＦ－ＡＢ作用后,两种细胞ＤＮＡ民均明显增加,Ｓ期细胞数百分比均明显增高,Ｇ１期细胞不断进入Ｓ期,但作用有划     

黑色素细胞培养上清液对增生性瘢痕成纤维细胞的生物学 …

目的 观察正常的黑色素细胞（ＭＣ）对增生性瘢痕成纤维细胞（ＨＳＦｉｂ）的生物学效应。方法 收集ＭＣ的上清液按不同的浓度加入培养的ＨＳＦｉｂ中,ＭＴＴ法测定细胞的增殖率,＾３Ｈ－ＴｄＲ参入法测定细胞ＤＮＡ合成率。结果 加入ＭＣ上清液的ＨＳＦｉｂ,培养４８ｈ后,较正常对照组,实验组细胞增殖明显（Ｐ〈０．０５（,ＤＮＡ合成率各实验组（ＭＣ１组外）与对照组相差显著（Ｐ〈０．０１）,但高浓度组（７５％）的合     

牙龈成纤维细胞与牙周韧带细胞在二种玻璃离子水门汀上附着及增？…

目的 比较人类牙龈成纤维细胞（ＨＧＦ）与牙周韧带细胞（ＰＤＬＣ）在两种玻璃离子水门汀（ＧＩＣ）上的附着及增殖情况。方法 利用体外细胞培养技术及＾３Ｈ－ＴｄＲ掺入法检测ＨＧＦ及ＰＤＬＣ在两种ＧＩＣ上的附着及ＤＮＡ合成。结果 ＨＧＦ与ＰＤＬＣ在培养板上的附着及ＤＮＡ合成差异无显著性（Ｐ〉０．０５）,但ＨＧＦ在ＧＩＣ上的附着及ＤＮＡ合成明显强于ＰＤＬＣ（Ｐ〈０．０５）。结论 Ｋｅｔａｃ Ｆｉｌ和Ｆｕｊｉ     

低密度脂蛋白活化人肾小管上皮细胞促进肾间质成纤维细胞生？…

目的 观察低密度脂蛋白（ＬＤＬ）对近曲肾小管上皮细胞（ＨＫ－２）的作用;探讨经ＬＤＬ活化的ＨＫ－２对肾间质成纤维细胞（ＲＩＦＢ）生物学表型的影响。方法 用＾３Ｈ－ＴｄＲ掺入和细胞计数法评价细胞增殖：Ｎｏｒｔｈｅｒｎ和Ｗｅｓｔｅｒｎ杂交方法检测α－平滑肌肌动蛋白（α－ＳＭ－ａｃｔｉｎ）;间接竞争抑制酶联免疫吸附法测定纤粘连蛋白和蛋粘连蛋白含量;＾３Ｈ－脯氨酸掺入法测定细胞总胶原成分的合成;逆转录聚合     

生长因子网络调节对骨形成作用的研究——Ⅳ.多种生长因子？…

研究转化生长因子（ＴＧＦ－β）、胰岛素样生长因子Ⅱ（ＩＧＦ－Ⅱ）、碱性成纤维细胞生长因子（ｂＦＧＦ）及血小板衍生性生长固子（ＰＤＧＦ）等四种生长因子（ＰＤＧＦ）等四种生长因子中,三种生长因子交互应用和四种生长因子联合应用对人胚成骨样细胞增殖 化的影响。在不同的实验期间检测成骨样细胞＾３Ｈ－胸腺嘧啶脱氧核苷（＾３Ｈ－ＴｄＲ）、＾３Ｈ脯氨酸（＾３ＨＰｒｏｌｉｎｅ）的掺入量和碱性磷酸酶的含量。结果显示：     

三螺旋结构寡核苷酸序列对DHBV基因的连接及封锁抑制作用 …

目的 筛选与鸭乙肝病毒（ＤＨＢＶ）－ＤＮＡ Ｘ／Ｃ区目标基因特异连接的三螺旋结构寡核苷酸（ＴＦＯ）,探讨ＴＦＯ对ＤＨＢＶ－ＤＮＡ的特异连接及抑制作用。方法 将人工合成的ＴＦＯ与目标基因片断和含（ＤＨＢＶ）ＤＮＡ的重组细胞反应,用电泳转移印迹、ＰＣＲ和鸭肝原代细胞培养等技术观察ＴＦＯ对相应基因的连接以及对细胞内ＤＨＢＶ－ＤＮＡ复制的抑制效应。结果 在所设计的多条ＴＦＯ中,（３）ＴＦＯ和（５）ＴＦＯ在     

人aFGF cDNA的次级克隆及其重组产物的纯化

目的：为使ａＦＧＦ表达产量提高，以便于纯化，将载有人酸性成纤维细胞生长因子（ａＦＧＦ）全编码区ｃＤＮＡ的ＰＫＫ２２３－３质粒自ＤＨ５α细菌转入ＪＭ１０５细菌。方法：采用超声法和溶菌酶破碎法裂解扩增的ＪＭ１０５细菌，通过ＨｅｐａｒｉｎＳｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ－６Ｂ亲和层析法提纯表达的重组产物。结果：ＳＤＳ－ＰＡＧＥ的结果表明，纯化重组产物的分子量约为１８０００。结论：人重组酸性成纤维生长因子在大肠杆菌中得到表达及鉴定     

瘢痕成纤维细胞的MMP-3 mRNA表达及其基因转染

目的：探讨增生性瘢痕组织中细胞外间质（ＥＣＭ）的过度沉积机制，并探索其基因治疗途径。方法：体外培养瘢痕成纤维细胞（ＨＳＦ），构建间质溶解素１（ＭＭＰ－３）逆转录病毒载体，利用基因转染技术将ＭＭＰ－３基因转入ＨＳＦ，核酸分子杂交检测ＭＭＰ－３的ｍＲＮＡ表达水平。ＤＮＰ－多肽降解法检测间质金属蛋白酶（ＭＭＰｓ）活性，辅以正常皮肤成纤维细胞作对照。结果：ＨＳＦ表达ＭＭＰ－３ｍＲＮＡ水平及降解ＤＮＰ－多肽     

黑色素细胞培养上清液对增生性瘢痕成纤维细胞的生物学效应

目的　观察正常的黑色素细胞 ( MC)对增生性瘢痕成纤维细胞 ( HSFib)的生物学效应 .方法　收集 MC的上清液按不同的浓度加入培养的 HSFib中 ,MTT法测定细胞的增殖率 ,3H- Td R参入法测定细胞 DNA合成率 .结果　加入MC上清液的 HSFib,培养 48h后 ,较正常对照组 ,实验组细胞增殖明显 ( P<0 .0 5 ) .DNA合成率各实验组 (除 MC1组外 )与对照组相差显著 ( P<0 .0 1) ,但高浓度组 ( 75 % )的合成率有下降趋势 .结论　 MC细胞可能分泌活性物质促进 HSFib细胞 DNA合成及殖增 ,可能与烧伤后瘢痕形成及色素形成有关     

人碱性成纤维细胞生长因子基因真核表达载体的构建

目的:构建人碱性成纤维细胞生长因子bFGF基因真核表达载体,探讨bFGF基因转移治疗视网膜病变的方法.方法:将bFGF和GFP基因克隆到真核表达载体pcDNA3中.结果:酶切及琼脂糖电泳分析 pcFG中含有bFGF和GFP基因.结论:成功的构建了含有绿色荧光蛋白的人碱性成纤维细胞生长因子基因的真核表达载体.     

抑癌基因MTS1对卵巢癌细胞增殖的影响

目的：探讨多肿瘤抑制基因１（ＭＴＳ１）对卵巢癌细胞系增殖的影响。方法;绘制细胞生长曲线图,比较卵巢癌细胞系ＨＯ－８９１０（无ｐ１６基因的表达）与８９１０－ｐ１６（转染ｐ１６基因）,８９１０－ｐｃＤＮＡ３（转染空载体ｐｃＤＮＡ３）的生长特性;采用＾３Ｈ－ＴｄＲ掺入实验比较３种细胞的ＤＮＡ合成情况。结果：８９１０－ｐ１６细胞在转染ｐ１６基因后其增殖特性受到抑制,ＤＮＡ８９１０－ｐ１６细胞在转染ｐ１６基     

利用昆虫杆状病毒载体表达人碱性成纤维细胞生长因子

目的利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统,将人碱性成纤维细胞生长因子(human basic fibroblast growth factor,hbFGF)基因进行表达,并检测重组蛋白的特异性及生物学活性。方法将人bFGF的cDNA克隆至杆状病毒转座载体pFastBacHTb中,并转化到含穿梭载体Bacmid的感受态细菌DH10Bac中,获得重组Bacmid/bFGF;纯化DNA后,转染昆虫细胞Sf21,PCR鉴定重组病毒;进一步将重组病毒感染Sf21细胞,在Sf21细胞中进行表达,对表达产物进行SDS-PAGE电泳、Western bloting分析;MTT法检测表达产物的生物活性。结果重组Bacmid/bFGFDNA直接转染昆虫细胞得到重组病毒rAcV-Bac-bFGF,病毒滴度MOI值≈8。重组病毒在感染后48h开始出现一相对分子质量为23000大小的特异带,感染后72h蛋白量明显增加,96h蛋白量达到最大,120h蛋白量开始减少。在正常昆虫Sf21细胞的对照中未见该蛋白带。Western bloting显示目的蛋白条带与人bFGF抗体发生特异反应。MTT结果显示重组蛋白能明显促进3T3细胞的分裂增殖。结论利用杆状病毒表达系统可成功表达具有生物学活性的bFGF蛋白。     

正常人皮肤成纤维细胞不同培养条件下的生物学特性

目的 观察成纤维细胞在不同培养条件下生长,增殖,代谢及蛋白质合成等情况,探讨成纤维细胞的最佳培养模型。方法 将正常皮肤中的成纤维细胞（NsFb）分离出来并进行原代及继代培养,之后建立不同的成纤维细胞培养系统,分别利用绘制细胞生长曲线,^3H-胸腺嘧啶（^3H-TdR）掺入及^3H-脯氨酸掺入等方法观察细胞的增殖,DNA代谢及胶原合成等情况,研究细胞在不同条件下的生物学特性。结果 成纤维细胞在单层及纤维蛋白胶中培养时细胞的增殖,代谢及蛋白质合成等生物学功能均明显强于两种胶原凝胶中培养时的情况。结论 以纤维蛋白胶为支架的三维培养系统能更好地模拟生理条件下创面愈合时成纤维细胞的生物学特性。     

人碱性成纤维细胞生长因子cDNA的克隆及在毕赤酵母中的表达

目的：克隆和表达人碱性成纤维细胞生长因子(hbFGF),以便进一步研究其功能。方法：从人神经胶质瘤细胞中提取总RNA,采用RT-PCR方法,扩增出hbFGF cDNA片段,与pMD18-T载体连接后作DNA序列分析,并用亚克隆的方法构建pPICZα-hbfFGF,将测序正确的重组质粒用SacI线性化后电转化至毕赤酵母X-33,经PCR法、SDS-PAGE和Western blotting分析表达产物,从而筛选出能够稳定、高效分泌表达hbFGF的酵母工程菌。结果：经测序证实获得的hbFGF序列与GenBank（登录号NM002006）报道的完全一致,甲醇诱导表达后培养液上清的SDS-PAGE凝胶电泳显示在相对分子质量约18 000有一蛋白条带,Western blotting结果显示表达产物与抗人碱性成纤维细胞生长因子抗体产生特异性条带,证明rhbFGF蛋白的表达。结论：成功克隆了hbFGF 基因,并在毕赤酵母体系中进行了表达。     

血管活性肠肽真核表达质粒的构建及鉴定

目的:构建一种具有生物学活性的血管活性肠肽(VIP)的真核表达质粒.方法:利用RT-PCR从小鼠胸腺淋巴细胞中克隆有信号肽序列的VIP cDNA,插入真核表达载体pcDNA3.1,构建含VIP的重组质粒pcDNA3.1-VIP,转染COS-7细胞,用ELISA和Western blot鉴定表达的蛋白,细胞因子释放抑制法测定生物学活性.结果:经酶切和基因测序证实,克隆的基因片段为带有信号肽序列的VIP基因;经转染的COS-7细胞表达VIP蛋白,并能有效地抑制巨噬细胞的TNF-α释放.结论:成功构建了能够表达具有生物学活性的真核表达质粒pcDNA3.1-VIP.     

Trappin-2对HaCaT细胞及银屑病跨膜模型增殖的抑制作用

目的 构建Trappin-2的真核表达体系,初步探讨Trappin-2对HaCaT细胞及银屑病跨膜模型增殖的影响.方法 采用DNA重组技术构建Trappin-2的表达载体pIRES2-EGFP-Trappin-2,通过脂质体法转染入宫颈癌HeLa细胞.将Trappin-2高表达上清加入HaCaT细胞及银屑病跨膜模型中,通过3H-TdR掺入法、MTT法、流式细胞术及组化染色Ki67检测对增殖的影响.结果 Trappin-2作用后MTY和cpm值变化率显示Trappin-2可抑制HaCaT细胞的代谢与DNA合成,同时可使HaCaT细胞G2 S期细胞比例下降,而G1期细胞比例增加.Trappin-2可下调银屑病皮损Ki67表达水平.结论 成功将Trappin-2基因转染HeLa细胞,并进行有效表达,初步证实Trappin-2具有抑制HaCaT细胞及银屑病跨膜模型增殖的特性.     

亮氨酸脑啡肽对缺氧时肺动脉平滑平细胞增殖的影响

目的：研究缺氧对肺动脉平滑肌细胞（ＰＡＳＭＣ）增殖、ＤＮＡ合成和细胞周期的作用,并观察亮氨酸脑啡肽（Ｌ－Ｅｎｋ）和阿片受体阻断剂纳洛酮（Ｎａｌ）的影响．方法：离体培养兔ＰＡＳＭＣ,采用四唑盐比色试验（ＭＴＴ）,３Ｈ－ＴｄＲ参入技术和流式细胞仪分析细胞周期等方法,观察ＰＡＳＭＣ增殖、ＤＮＡ合成和细胞周期的变化．结果：ＰＡＳＭＣ缺氧培养１２ｈ,２４ｈ后,ＭＴＴ的Ａ值和３Ｈ－ＴｄＲ参入量分别为（１７９±１９．１）％,（１８５±２０．３）％和（１５８±１３．６）％,（１６７±１７．４）％,比常氧对照组（１００％）显著增加（Ｐ＜０．０１）．缺氧培养２４ｈ后,在Ｇ２,Ｍ期的细胞比例显著升高,Ｇ０,Ｇ１期的细胞比例显著减少（Ｐ＜０．０１）．Ｌ－Ｅｎｋ（１×１０－４ｍｏｌ／Ｌ）可明显抑制缺氧促进ＰＡＳＭＣ增殖和ＤＮＡ合成的作用（Ｐ＜０．０１）,该抑制作用可被Ｎａｌ阻断．结论：Ｌ－Ｅｎｋ可抑制缺氧时ＰＡＳＭＣ的增殖和ＤＮＡ的合成作用,该抑制效应是通过阿片受体介导的．