不同浓度5-氮胞苷体外诱导人骨髓间充质干细胞转化为心肌样细胞

为确定5-氮胞苷诱导人骨髓间充质干细胞（MSCs）转化为心肌细胞的合适浓度,取人肋骨来源的骨髓,分离、提纯、培养MSCs,应用0、2．5、5、10、20、40、80μmol／L5-氮胞苷对第2代的MSCs诱导24h,于诱导后1、2、3、4周进行细胞形态学观察;于诱导后2周进行免疫组化鉴定及心肌样细胞转化率的计算和比较。结果表明,5-氮胞苷诱导24h后,小于10μmol／L组仅有少量细胞死亡,其余组约30％细胞死亡;2～3周,相邻细胞间胞膜有接触,逐渐相连呈肌管状;同期未经诱导的MSCs没有出现类似改变。诱导后2周MSCs免疫组化染色,对照组与2．5μmol／L组cTnI表达为阴性,其它组cTnI表达呈阳性。心肌样细胞转化率10μmol／L、20μmol／L、40μmol／L、80μmol／L组之间无明显差异,均明显高于5μmol／L组（P〈0．05）。结论：在体外5-氮胞苷可诱导人MScs转化为心肌样细胞,10μmol／L可能是一种合适的诱导浓度。     

骨髓间质干细胞向心肌样细胞分化的研究

目的：诱导骨髓间质干细胞（BMSCs）向心肌样细胞分化，为 BMSCs 心肌再生移植治疗提供基础。方法取第5代的 BMSCs，5-氮杂胞苷诱导24 h，显微镜下进行形态学观察，3周后通过 RT - PCR 检测心肌蛋白 desmin 和αMHC 的表达。结果 BMSCs 经5-氮杂胞苷诱导后，细胞形态发生变化，出现肌管结构，RT - PC R 检测结蛋白（desmin ）和αMHC 的表达阳性。结论在体外成功诱导 BMSCs 分化成为心肌样细胞。     

人骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞的研究

目的：研究人骨髓间充质干细胞（hMSCs）在体外分离纯化、培养扩增和向心肌样细胞诱导分化的条件。方法：体外分离培养hMSCs,纯化传代至第三、四代,加入不同浓度5-氮杂胞苷（5-Aza）进行不同时间的孵育,用MTT测定细胞的生长活性,确定最佳的浓度和孵育时间。4周后行电镜,免疫组化染色及逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）检测。结果：诱导后细胞呈心肌样细胞改变,电镜下可见肌丝形成,免疫组化显示部分细胞胞浆α-横纹肌肌动蛋白（α-sarcomeric actin）、肌钙蛋白-T（troponin-T）阳性。RT-PCR检测显示心肌特异转录因子GATA-4、Nkx2.5有表达。结论：hMSCs是骨髓来源的具有多向分化潜能的干细胞,在5-Aza的诱导下可向心肌样细胞分化,可成为心肌损伤移植治疗的理想细胞材料。     

多种中药成分诱导大鼠骨髓间质干细胞转变为神经元样细胞

目的　体外定向诱导大鼠骨髓间质干细胞 (MSCs)分化为神经元样细胞。方法　通过贴壁法分离大鼠MSCs,体外扩增培养 ,流式细胞仪检测其表面抗原表达 ,中药成分定向诱导MSCs分化为神经元样细胞。光镜下观察细胞形态 ,免疫细胞化学法检测神经细胞特异性抗原标志。结果　大鼠MSCs可通过贴壁法成功分离并可在体外大量扩增。流式细胞仪检测结果显示CD1 4、CD1 1α、CD34、CD38、CD45、CD80、CD86为阴性 ,CD2 9、CD44、CD90、CD1 0 5、CD1 66呈阳性。黄芪、天麻、人参、当归、脑新舒、人参蜂王浆等多种中药诱导 1～ 3h后大部分MSCs转变为神经元样细胞 ,出现胞体和突起 ,免疫细胞化学染色神经元特异性烯醇酶 (NSE)、巢蛋白 (nestin)呈阳性 ,胶质纤维酸性蛋白 (GFAP)阴性。结论　多种传统中药成分及中药制剂体外能诱导大鼠MSCs分化为神经元样细胞     

抗坏血酸体外诱导人胚胎生殖细胞向心肌细胞分化

目的 探讨抗坏血酸作为诱导剂诱导人胚胎生殖细胞(hEGC)体外分化为心肌细胞.方法 取5～10周人胚胎生殖腺嵴,进行组织块体外培养,用直接悬浮法使hEGC形成拟胚体(EBs),用不同浓度抗坏血酸的培养基对其进行诱导分化.然后取不同时间的细胞做免疫细胞化学染色,鉴定细胞的心肌特异转录因子GATA-4和心肌肌钙蛋白T(cTnT)表达情况.结果 抗坏血酸诱导hEGC分化为心肌细胞的最佳浓度为0.1 mg/ml,诱导第3周时分化率达(85.2±1.8)%,显著高于不添加任何诱导剂的对照组.诱导后细胞形态变成梭形,4周时细胞突起相互连接成条索状,且排列方向趋于一致;诱导后1周即开始出现GATA-4弱表达,第3周时表达最强;诱导后2周,细胞内开始表达cTnT,3周强阳性表达,4周表达明显增强.结论 抗坏血酸能够促进hEGC向心肌细胞分化,可用以建立体外诱导hEGC分化为心肌细胞的方法.     

碱性成纤维生长因子联合丹酚酸B诱导间充质干细胞向心肌样细胞分化

目的探讨碱性成纤维生长因子(FGF-2)、丹酚酸B(SalB)以及二者联合诱导(FGF-2+SalB)对骨髓间充质干细胞(MSC)定向分化为心肌样细胞的影响。方法取SD大鼠四肢骨骨髓,分离培养MSC,对第2代MSC定向诱导,依次为FGF-2组、SalB组、FGF-2+SalB组以及空白对照组,相差显微镜观察细胞形态变化;免疫细胞化学技术检测诱导4周BMSC结蛋白,α-横纹肌肌动蛋白、心肌肌钙蛋白T(cTnT)及心肌连接蛋白43(Cx43)的表达;透射电镜对分化细胞进行鉴定;以半定量RT-PCR法在诱导后7,14和28 d检测细胞心肌早期转录因子GATA-4,Nkx2.5的表达。结果诱导各组的BMSC均可见结蛋白、α-横纹肌肌动蛋白、cTnT及Cx43的阳性细胞,其中联合诱导组的阳性率均最高。诱导各组与对照组上述四标记物的阳性率均具有显著性差异(P<0.05)。透射电镜观察:分化细胞的胞质内可见平行排列的肌丝,多靠近细胞膜,并富含内质网、线粒体、糖原和核糖体。RT-PCR结果显示,诱导组细胞GATA-4和Nkx2.5于诱导后7 d弱表达,14 d表达增强,28 d表达减弱。结论 FGF-2,SalB以及二者联合,均可将MSC诱导为心肌分化表型,其中FGF-2+SalB组各蛋白阳性表达率最高,其心肌样细胞的转化率亦高于其他组。     

骨髓间充质干细胞自体移植对心功能影响的超声观测

目的应用彩色多普勒超声心动图评价骨髓问充质干细胞（MSCs）自体移植对急性心肌梗死成年兔左心室形态及收缩功能的影响。方法22只日本大耳白兔。通过结扎左冠状动脉前降支，建立息性心肌梗死模型；随机分成实验组与对照组。将经过培养的MSCs经溴氮胞苷（BruD）标记后，直接注射到实验组动物左心室游离壁正常心肌组织与梗死组织交界处的心肌内。于术前1周，术后2、4周分别行彩色多普勒超声心动图检查，观测左心室内径及左心室收缩功能。术后4周处死动物，进行组织学与α-横纹肌动蛋白免疫组织化学染色。结果术后2周时，实验组与对照组比较心功能参数差异无显著性（P〉0．05），术后4周，与对照组比较，心功能改善（P〈0．05）。缺血心肌内可见部分BruD标记的移植细胞已与宿主心肌细胞相连接，并分化为具有典型的肌小节和表达α-横纹肌动蛋白阳性的心肌细胞样的横纹肌细胞，其排列方向与宿主心肌细胞排列方向平行。结论自体移植的MSCs可在急性梗死心肌内生长、发育、分化，并逐渐分化为心肌细胞取代瘢痕组织，影响左心室重构，改善心功能。     

干预NRG-1/ErbB通路对大鼠脂肪干细胞向类窦房结细胞分化的影响

目的探讨在大鼠脂肪干细胞(ADSCs)向心肌样细胞分化的一定时期内,通过干预NRG-1/ErbB通路是否可调控其向类窦房结样细胞或工作肌样细胞分化。方法分离培养大鼠ADSCs,免疫荧光测定细胞相关表面抗原鉴定其干细胞特性。取3代ADSCs加入含10μmol.L-15-氮胞苷(5-Aza)和10μg.L-1bFGF的培养基处理24 h后分3组向心肌样细胞诱导分化,包括对照组、AG1478组、神经调节蛋白-1(NRG-1)组,取正常培养的为ADSCs组。诱导3周后,通过RT-PCR检测各组NKx2.5、HCN4、TBX3、TBX2基因,Westernblot检测TBX3蛋白,膜片钳检测各组动作电位的表达差异。结果 ADSCs加5-Aza诱导3周后表达心脏早期转录因子Nkx2.5及肌钙蛋白,证明5-Aza可以将ADSCs诱导成心肌样细胞。而AG1478组起搏相关基因(HCN4、TBX3、TBX2)的表达明显强于对照组及NRG-1组(P<0.05),TBX3蛋白也强于对照组(P<0.05),并能产生窦房结样动作电位。而NRG-1组Nkx2.5的表达高于对照组及AG1478组(P<0.05),亦能检测到心室肌样动作电位。结论在大鼠AD-SCs向心肌样细胞分化的一定时间内通过干预NRG-1/ErbB通路可使其定向分化为起搏样细胞或工作肌样细胞,这为今后干细胞生物起搏研究做了有益探讨。     

5-氮胞苷诱导心肌组织中c-kit~+干细胞分化的实验研究

目的:创建小鼠心肌干细胞(cardiac stem cells,CSC)分离、培养的方法,借助干细胞表面标记c-kit纯化CSC,并用5-氮胞苷诱导CSC分化为心肌细胞。方法:用酶定时消化方法分离提取小鼠心脏组织中的细胞,进行体外培养;免疫磁珠法纯化c-kit阳性细胞,并用流式细胞仪检测纯化后细胞表面标记c-kit、lin和CD34的表达;以免疫细胞化学染色法检测诱导后心肌特异性蛋白T、连接蛋白-43、心肌细胞特异性结蛋白;结合形态学变化,分析不同诱导条件作用结果之间的差异。结果:从C57BL小鼠心肌组织中分离消化所得的细胞中,含有一种小而圆形、折光性强的细胞,经传代培养的细胞增殖速度比原代细胞明显为快,存在较多的类似于干细胞增殖和形态学特点的细胞。用免疫磁珠法可以分选出高纯度的c-kit+CSC,这种CSC基本不表达CD34和lin。在不同诱导条件下,此种CSC可以分化为搏动的细胞,并能表达心肌特异性蛋白。结论:从C57BL小鼠心肌组织中可以获得CSC,用免疫磁珠法可以分选出表型为c-kit+-CD34--lin-高纯度的CSC,经5-氮胞苷诱导或改变CSC生长的微环境后,此种细胞可以分化成心肌细胞,且能形...     

体外诱导骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化的机制研究

目的体外诱导成人骨髓间充质干细胞(MSCs)向神经元样细胞分化,并探讨分化过程中多效蛋白(PTN)mRNA的表达,以了解MSCs向神经元样细胞分化的特性和机制。方法密度梯度离心加贴壁培养法分离成人MSCs,原代和传代培养。取第6代MSCs设对照和试验组进行诱导,诱导后30 min至3 d,观察细胞形态并计数。免疫细胞化学法和反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法测定分化后细胞神经细胞特异性表面标志神经元烯醇化酶(NSE)、微管相关蛋白(MAP)-2,胶原酸性蛋白(GFAP)和诱导前、诱导后12 h PTN mRNA的表达。结果接种24 h后MSCs开始贴壁,呈圆形或椭圆形。3 d后可见梭状细胞呈集落状生长,10～14 d融合。第5～6代时呈现较均一的成纤维细胞样形态。诱导后胞体向胞核收缩;出现双极及多极细胞。12 h变形细胞增多,细长突起相互连接。24 h后变形细胞增多不明显。诱导后12 h大部分细胞表达NSE(64.79±0.07)%、MAP-2(60.05±0.09)%,未检测到GFAP的表达,RT-PCR半定量检测有NSE mRNA的表达(0.66±0.15)。实验组诱导后12 h细胞有PTN mRNA的表达(0.689±0.017)。结论建立了稳定的成人MSCs培养增殖体系,MSCs可体外诱导分化为神经元样细胞,在分化过程中有外观形态变化和特异性标志物NSE和MAP-2的表达,同时有PTN mRNA的表达,提示PTN可能参与调控了MSCs向神经元样细胞的分化。     

黄芪甲苷通过激活Sirt3抑制血管紧张素Ⅱ诱导的心肌肥大及氧化应激

目的研究Sirt3在黄芪甲苷抑制血管紧张素Ⅱ诱导的心肌肥大和氧化应激中的作用。方法α-actinin染色检测心肌细胞大小;MitoSOX染色检测ROS;Real time PCR检测心肌肥大标记物ANP、BNP和β-MHC的mRNA水平;Western blot法检测心肌细胞肥大信号通路蛋白水平。结果100nmol·L-1血管紧张素Ⅱ处理心肌细胞48 h,心肌细胞面积与ANP、BNP、β-MHC mRNA水平显著增加,ROS水平及NOX-2、NOX-4表达显著增加,Sirt3表达显著降低;黄芪甲苷预处理心肌细胞1 h显著抑制血管紧张素Ⅱ诱导的上述效应。Sirt3-siRNA干预Sirt3蛋白水平,显著抑制黄芪甲苷的心肌肥厚抑制作用以及抗氧化作用,上调ROS水平,促进心肌肥大。结论黄芪甲苷通过激活Sirt3抑制血管紧张素Ⅱ诱导的心肌肥大以及氧化应激。     

丹参注射液诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞的研究

目的:探讨丹参注射液在体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)向神经元样细胞分化的作用。方法:采用差速贴壁法体外分离培养大鼠MSCs,流式细胞仪检测其表面标志,经碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)预诱导24h,采用含丹参注射液的无血清L-DMEM培养液诱导MSCs,倒置显微镜下观察细胞形态的变化,免疫荧光细胞化学检测巢蛋白、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、神经丝蛋白(NF-M)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达。结果:体外培养的大鼠MSCs表达CD29、CD44、CD105、CD166。丹参注射液诱导后MSCs胞体收缩,突起伸出,较密的部分神经元拉成网状,免疫细胞化学显示巢蛋白、NSE、NF-M表达阳性,阳性率分别为(58.68±4.50)%、(61.23±5.72)%、(63.47±6.38)%,GFAP阳性细胞率(1.47±0.23)%。结论:丹参注射液在体外可以将大鼠MSCs诱导分化为神经元样细胞。     

人脐血MSCs的分离培养及向神经的诱导分化

目的探讨人脐血中分离所得到间充质干细胞（MSCs）向神经组织细胞诱导分化的实验条件。方法淋巴细胞分离液分离正常人脐血单个核细胞,利用差速消化法通过多次传代得到MSCs,流式细胞仪测定细胞表型。取2至4代的MSCs加入含有维甲酸（RA）与神经生长因子（NGF）的诱导分化培养基将其定向诱导,免疫细胞化学染色检测诱导后的MSCs神经元和神经胶质细胞标志的表达。结果脐血MSCs每传一代,细胞数量增加约2～3倍。流式细胞仪检测,脐血MSCs不表达CD34,表达CD25、CD29、CD105、CD106。诱导后的细胞不仅形态类似神经元和神经胶质细胞,而且表达神经丝蛋白200（NF）、神经元特异性烯醇化酶（NSE）和胶质原纤维酸性蛋白（GFAP）。结论从人脐血中可以分离得到与骨髓相似的MSCs,并且能够在体外分化为神经元样和神经胶质细胞样细胞。     

5-氮胞苷诱导的心脏成纤维细胞移植修复心肌损伤

目的 探讨5-氮胞苷诱导的大鼠心室成纤维细胞(CFs)植入急性心肌梗死(AMI)区的心肌损伤修复作用.方法 取SD大鼠乳鼠心室CFs体外培养、扩增,取第三代细胞加5-氮胞苷10 μmol/L诱导,并行5-溴脱氧尿嘧啶核仟(BrdU)标记,收集(0.8～1.2)×106个细胞用于移植.SD大鼠20只,结扎冠状动脉前降支建立大鼠AMI模型,2周后,治疗组(10只)将诱导后的CFs注入梗死区及周边,对照组(10只)予等量不含CFs的培养液接种.6周后处死所有动物,获取心肌标本,HE,及免疫组化染色观察CFs分化和转归.结果 治疗组HE染色梗死区可见敞在带横纹的肌肉组织,电镜下移植细胞及移植细胞与宿主细胞之间均未见闰盘连接;免疫绀化染色这些细胞BrdU、β肌球蛋白重链(β-MHC)、肌钙蛋白Ⅰ(cTn1)及连接蛋白43(Cx43)呈阳性;对照组梗死区为均匀一致的纤维瘢痕组织.结论 5-氮胞苷诱导的CFs植入AMI区可分化、转归为带横纹肌细胞,修复心肌损伤.     

不同细胞移植对大鼠心肌梗死后修复的影响

目的 观察骨髓间充质干细胞(MSCs)和MSCs诱导后分别移植对急性心肌梗死(AMI)修复的影响,比较不同细胞移植的作用.方法 获取、培养大鼠骨髓MSCs;5-氮胞苷(5-aza)诱导MSCs,免疫细胞化学法和RT-PCR检测诱导后MSCs特性.结扎大鼠左冠状动脉前降支,建立急性心肌梗死模型,分三个组.对照组:梗死部位中央及四周移植磷酸盐缓冲液(PBS),50μl/点;MSCs移植组和MSCs诱导组:在上述部位分别移植MSCs、诱导的MSCs,2×106个/50μl/点.3周后,超声观察心室腔大小、室壁厚度及运动幅度,检测左室射血分数(EF%)、短轴缩短率(FS%);血流动力学测定左室收缩压(LVSP)、舒张末压(LVEDP)、压力变化最大速率(±dp/dtmax)等指标;免疫组化分析心肌组织中移植细胞情况.结果 诱导的MSCs对心肌肌钙蛋白T(cTnT)、连结蛋白43(Cx-43)表达阳性.MSCs移植组、MSCs诱导组与对照组相比,左室前壁运动增强,FS%、LVSP、±dp/dtmax均升高、LVEDP降低(P＜0.05),MSCs诱导组改变更明显(P＜0.05).MSCs移植组、MSCs诱导组心肌组织中移植细胞对cTnT、Cx-43表达阳性.结论 MSCs移植、MSCs诱导后移植对大鼠AMI均有修复作用,MSCs诱导后移植对AMI心功能的改善作用更明显.     

体外"心肌样"环境下5-氮胞苷诱导大鼠骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化

目的探讨在体外"心肌样"环境下5-氮胞苷(5-Aza)诱导能否促进骨髓间充质干细胞(BMSCs)向心肌样细胞分化。方法(1)分离、纯化大鼠BMSCs,分组后用5-Aza诱导部分BMSCs。(2)BMSCs标记后与乳鼠心肌细胞共培养。(3)免疫荧光法鉴定BMSCs的肌球蛋白重链(MHC)和心肌特异性肌钙蛋白I(cTnI)。结果免疫荧光结果显示5-Aza单次诱导组与未诱导组比较MHC、cTnI阳性率显著增加,且5-Aza双次诱导组较单次诱导组MHC、cTnI阳性率显著增加。结论(1)体外"心肌样"环境下5Aza能够促进BMSCs向心肌样细胞分化。(2)5-Aza双次诱导较单次诱导效果更好。     

23-羟基白桦酸对阿霉素所致H9c2心肌细胞损伤的保护作用及抗氧化机制研究

目的:基于细胞水平研究23-羟基白桦酸(23-HBA)对阿霉素(DOX)心肌损伤的保护作用并探讨其抗氧化机制.方法:采用H9c2心肌细胞,考察对照组、DOX组、23-HBA组及23-HBA联合DOX组给药后心肌细胞形态学变化,测定细胞体积及蛋白含量,Real time-PCR测定心钠素(ANP)、脑钠素(BNP)的mRNA水平.考察心肌细胞内Caspase-3活性及Hoechst荧光染色后细胞核形态从而评价细胞凋亡水平.利用DCFH荧光探针测定细胞ROS水平,同时检测细胞内脂质过氧化物(MDA)生成量,评价细胞氧化损伤水平,寻找23-HBA心肌保护的可能机制.结果:5 μmol/L DOX诱导心肌细胞肥大,表现为细胞体积增大,蛋白含量增多,并显著上调细胞内ANP与BNP的mRNA水平,提高细胞内Caspase-3活性,导致细胞凋亡.23-HBA与DOX联合用药后,浓度依赖地降低DOX给药后心肌细胞内ROS水平,清除脂质过氧化物MDA,逆转DOX诱导的心肌肥大、心肌损伤标志物上调、心肌细胞凋亡等过程.结论:23-HBA可通过其抗氧化作用降低DOX所致的心肌损伤.     

超声观察骨髓间充质干细胞移植对兔心肌梗死心功能的影响

目的应用超声评价体外不同处理方式兔骨髓间充质干细胞（MSCs）移植于缺血心肌后对心脏功能的影响。方法采用结扎冠状动脉左前降支的方法建立心肌梗死模型,2周后分别将自体MSCs、经5-aza诱导的MSCs、骨髓单个核细胞（BMMNCs）,Dil标记后用微量注射器注射于兔缺血心肌内,并以无血清培养基注射动物为对照组。分别在术前、细胞移植前、细胞移植后2、4周之后行M型超声心动测量：左室收缩末内径（LVESD）、左室舒张末内径（LVEDD）,计算左室射血分数（LVEF）、左室短轴缩短率（LVFS）等指标。结果细胞移植后2、4周,超声心动检查发现MSCs组和5-aza诱导的MSCs组的兔心功能（LVEF、LVFS值）比对照组显著升高（P〈0.05）,而BMMNCs组仅在移植后4周明显改善（P〈0.05）;LVESD、LVEDD细胞移植组与对照组相比无显著差异（P〉0.05）。结论 MSCs、经5-aza诱导的MSCs、BMMNCs均能存活于梗死心肌中,从而改善缺血心肌后左室收缩功能。     

体外培养成人脂肪间充质干细胞生物学特性及诱导分化为心肌细胞的研究

目的通过分离、培养脂肪间充质干细胞观察其生物学特性及诱导分化为心肌细胞,为心肌再生提供良好的干细胞来源。方法胶原酶消化分离成人脂肪来源的间充质干细胞并进行传代培养,倒置相差显微镜观察细胞形态,流式细胞仪测定CD29、CD31、CD34、CD44及细胞周期,MTT绘制细胞生长曲线。用第3代细胞进行诱导分化,观察不同浓度5-氮杂胞苷(5-Aza,1,3,5,10,15,20μmol/L)及不同作用时间(12,24,48,72h)诱导其向心肌细胞分化的差别,采用最佳浓度10μmol/L,最佳作用时间24h进行实验,分别在第7,14,21,28天用免疫细胞荧光染色鉴定心肌细胞α-横纹肌、肌球蛋白重链(MHC)、心肌肌钙蛋白I(cTnI)表达,第14天反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测心肌发育相关基因NKX2.5的表达。结果倒置相差显微镜下观察原代细胞,可见细胞呈梭型、核圆形或椭圆形,偶见双核。传代细胞核原代细胞形态相似,排列有了一定的方向性。流式细胞仪检测结果显示,第1、3、5代细胞均高表达CD29和CD44;而CD31始终表达很弱,可认为呈阴性表达;CD34在第1、3代细胞弱表达,在第5代细胞表达逐渐减弱为阴性。细胞生长曲线显示前3d处于细胞潜伏状态,第4天进入对数生长期,第10天达到顶峰。细胞周期检测结果显示G1期细胞为85.93%,S期为7.24%,G2期为6.83%。10μmol/L5-Aza诱导后7d进行免疫细胞荧光染色,未见有α-横纹肌、MHC、cTnI表达。14d少量细胞α-横纹肌和MHC阳性表达,cTnI阴性表达。21d表达α-横纹肌和MHC的细胞数量增多,并可见少量cTnI阳性表达。28dα-横纹肌、MHC、cTnT阳性表达数目均增多,RT-PCR结果显示NKX2.5呈阳性表达。结论成人脂肪中可以分离出脂肪间充质干细胞并且可以在体外培养传代,经过5-Aza的诱导可以向心肌细胞分化,为干细胞移植治疗和组织工程学种子细胞提供了更多的选择。     

三叶苷调控miR-539-5p表达保护缺氧缺糖心肌细胞损伤研究

摘要：目的:探讨三叶苷对缺氧缺糖心肌细胞损伤的保护作用及机制。方法:采用不同浓度的三叶苷作用于缺氧缺糖诱导的心肌细胞H9C2,试剂盒检测丙二醛（MDA）含量、乳酸脱氢酶（LDH）和超氧化物歧化酶（SOD）活性,流式细胞术、蛋白质印记（Western blot）检测细胞凋亡以及B细胞淋巴瘤-2（Bcl-2）和Bcl相关X蛋白（Bax）蛋白表达,实时荧光定量PCR（RTq PCR）检测miR-539-5p表达。转染miR-539-5p模拟物至H9C2细胞,检测过表达miR-539-5p对缺氧缺糖诱导的H9C2细胞损伤的影响。结果:三叶苷作用于缺氧缺糖诱导的H9C2细胞后,细胞中MDA含量、LDH释放量、细胞凋亡率和Bax蛋白表达水平显著降低,SOD活性、Bcl-2蛋白和miR-539-5p表达水平显著升高（P<0.05）。过表达miR-539-5p后,缺氧缺糖诱导的H9C2细胞中MDA含量、LDH释放量、细胞凋亡率和Bax蛋白表达水平显著降低,SOD活性、Bcl-2蛋白表达水平显著升高（P<0.05）。抑制miR-539-5p表达可减弱三叶苷对缺氧缺糖诱导的H9C2细胞MDA含量、LDH释放量、SOD活性、凋亡,以及Bax和Bcl-2蛋白表达的影响。结论:三叶苷可有效降低缺氧缺糖诱导的心肌细胞损伤,其机制与上调miR-539-5p表达有关。