hTERT基因转染激活人毛乳头细胞端粒酶的实验研究

目的:明确外源性人端粒酶反转录酶(hTERT)基因转染能否激活体外培养人毛乳头细胞(DPC)的端粒酶.方法:采用脂质体转染法,将空载体质粒pIRES2-EGFP和含有hTERT基因的质粒pIRES2-EGFP-hTERT分别导入体外培养的正常人DPC,经G418筛选得到阳性克隆,连续传代培养.应用反转录(RT)-PCR法检测hTERT mRNA的表达,端粒重复序列扩增(TRAP)-ELISA法检测细胞端粒酶活性.结果:未转染DPC和空载体转染细胞(DPC-EGFP)无hTERT mRNA表达,端粒酶活性为阴性;而外源性hTERT基因转染细胞(DPC-hTERT)稳定表达hTERT mRNA,同时端粒酶活性转为阳性.结论:外源性hTERT基因转染能够激活体外培养人DPC的端粒酶,为建立永生化细胞系奠定基础.     

端粒酶小干扰RNA技术体外抑制Hut78细胞生长及诱导凋亡的研究

目的探讨针对端粒酶逆转录酶（hTERT）基因的小干扰RNA（siRNA）技术对皮肤T细胞淋巴瘤（CTCL）细胞株Hut78端粒酶活性和细胞生长的影响。方法用T7 RNA聚合酶介导的体外转录法合成两对hTERT—siRNA．将合成的siRNA转入Hut78细胞中，用端粒酶重复序列扩增及酶联免疫吸附方法（TRAP-PCR-ELISA）和逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）分别检测Hut78细胞端粒酶活性及hTERT mRNA的表达。用MTT法和流式细胞仪分析细胞增殖及凋亡的变化。结果将合成的siRNA（250ng）转染入Hut78细胞48h后，端粒酶活性被明显抑制，抑制率分别为68％和64％；hTERT mRNA的表达下降。细胞生长抑制作用有明显的剂量依赖性，以1000ng剂量抑制效果最明显。同时观察到细胞凋亡，凋亡率分别为15、86％和11.10％（P〉0．05）。结论体外转录法合成的hTERT-siRNA能明显抑制Hut78细胞端粒酶的活性，降低hTERT基因表达．抑制细胞生长增殖及诱导细胞凋亡。     

白黎芦醇对人表皮样癌细胞端粒酶活性及其增殖、凋亡的影响

目的观察白藜芦醇诱导人表皮样癌A431细胞的凋亡情况,并探讨其对端粒酶活性和hTERT基因蛋白表达的影响。方法以不同浓度的白藜芦醇处理A431细胞,显微镜观察细胞的形态学改变;MTT法检测细胞增殖情况;采用TRAP-PCR-ELISA法测定A431细胞的端粒酶活性;蛋白质印迹法检测A431细胞hTERT蛋白水平。结果在白藜芦醇诱导A431细胞凋亡的过程中对端粒酶活性有显著抑制作用,且随着其浓度增加而抑制作用越强;白藜芦醇能降低A431细胞hTERT蛋白的表达,且呈浓度依赖性。结论白藜芦醇能下调hTERT蛋白表达,抑制A431细胞端粒酶活性,这可能是白藜芦醇抑制A431细胞增殖的重要机制之一。     

hTERT-siRNA及hTR-siRNA的合成及对Hut78细胞端粒酶活性的影响

目的探讨合成端粒酶逆转录酶(hTERT)基因及端粒酶RNA(hTR)的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)对皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)细胞株Hut78端粒酶活性的影响。方法采用体外转录法分别合成两条hTERT—siRNA及hTR—siRNA。采用siRNA直接处理细胞裂解液及磷酸钙共沉淀法将siRNA转染入Hut78细胞两种处理方式,应用端粒酶重复序列扩增聚合酶链反应(TRAP—PCR) 及聚丙烯酰胺凝胶电泳银染检测端粒酶活性的变化。结果体外转录法能高效合成siRNA,产量达 22．4 μg／40μL siRNA合成体系。经250 ng siRNA直接处理细胞裂解液后,可高效降低端粒酶的活性,抑制率达87％左右。30 ng siRNA转染细胞36 h后,可降低端粒酶活性20％左右,而250 ng siRNA可降低 75％左右。结论体外转录法能高效、快速、大量合成siRNA,针对hTERT及hTR基因的siRNA可明显降低Hut78细胞株的端粒酶活性。     

hTERT反义寡核苷酸抑制Hut78细胞端粒酶活性及诱导细胞凋亡的研究

目的 探讨人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因反义寡核苷酸对皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)细胞株端粒酶活性及细胞生长的影响,为CTCL基因治疗提供新的基因靶点。方法 采用脂质体介导的基因转染方法,将不同浓度(10μmol/L、20μmol/L、30μmol/L)的寡核苷酸分别导入CTCL细胞株Hut78中;分别于不同的时间,应用端粒酶重复序列扩增及酶联免疫吸附方法(PCR-ELISA)、逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、流式细胞仪技术等动态观察转染细胞中端粒酶活性、hTERT mRNA表达以及细胞凋亡的变化。结果 经hTERT反义寡核苷酸(AODN)作用72h后,细胞端粒酶的活性明显下降,hTERT mRNA的表达减弱,并可观察到细胞凋亡,凋亡细胞发生率为13.05%。细胞生长抑制作用有明显的时效性,以30μmol/L、72h时下降最明显。而有义寡核苷酸(SODN)组和对照组以上指标均无明显变化(P>0.05)。结论 hTERT反义寡核苷酸可显著抑制CTCL细胞的端粒酶活性,抑制细胞生长增殖,诱导细胞凋亡。     

抗角蛋白自身抗体对体外培养鳞癌细胞端粒酶活性的影响

目的　研究抗角蛋白自身抗体对鳞癌细胞端粒酶活性的影响 ,探讨抗角蛋白自身抗体抑制鳞癌细胞增殖的机制。方法　分别以 4mg/L、8mg/L、16mg/L抗角蛋白自身抗体作用于鳞癌细胞株Tca 3 6h ,应用端粒重复序列扩增 ELISA(TRAP ELISA)和非变性聚丙酰胺凝胶电泳方法检测鳞癌细胞端粒酶活性的改变。结果　TRAP ELISA结果显示体外培养的鳞癌细胞具有较高水平的端粒酶活性 (t=3 .53 7,P <0 .0 1) ,电泳结果显示鳞癌细胞PCR产物为显色较深的多个梯形条带 ;抗角蛋白自身抗体在浓度为 4mg/L、8mg/L、16mg/L时 ,TRAP ELISA显示鳞癌细胞株Tca端粒酶的活性显著降低 ,该抑制作用呈剂量依赖性 (r =-0 .83 58,P <0 .0 1) ,电泳结果显示梯形条带数量减少 ,信号减弱。结论　抗角蛋白自身抗体可以呈剂量依赖的抑制体外培养鳞癌细胞端粒酶的活性 ,可能在抗角蛋白自身抗体抑制鳞癌增殖机制中起着一定的作用     

hTERT基因永生化人毛乳头细胞系的生物学特征

目的研究hTERT基因永生化人毛乳头细胞(DPC)系的生物学特征。方法采用脂质体转染法,将hTERT基因导入体外培养的正常人DPC,经G418筛选得到阳性克隆,连续传代培养。检测转染细胞内hTERT mRNA的表达,并分析转染细胞的生物学特征。结果转染后获得1个阳性细胞克隆,扩大培养后细胞生长良好,现已连续传至65代。检测证实转染细胞稳定表达hTERT mRNA,且此转染细胞具有体外培养正常DPC的生物学特征。结论hTERT基因永生化人DPC系保持了正常DPC的生物学特征。     

粘膜疾病

人内皮抑素基因转染对舌鳞癌Tea8113细胞生长的影响，基质金属蛋白酶2及其抑制剂在口腔鳞癌中的表达，口腔癌血管内皮生长因子和一氧化氦合酶的表达与癌细胞增殖关系的研究，低氧对口腔鳞癌细胞系血管内皮生长因子和MMP2的影响，口腔鳞癌癌周淋巴管生成与颈淋巴结微转移，     

粘膜疾病

20023724 维甲酸对人舌鳞癌细胞株Tca83 Fas/FasL基因表达的影响/关为群(福建医大附属协和医院口腔科)…∥中华口腔医学杂志.-2002,36(3).-215-218采用TUNEL法检测全反式维甲酸(RA)作用下细胞发生凋亡的情况,并应用RT-PCR和细胞免疫组化方法检测药物作用组和对照组Fas蛋白水平和mR-     

COX-2抑制剂NS398对人鳞状细胞癌Tca8113细胞株生长和凋亡的影响

目的 探讨COX-2抑制剂NS398对鳞状细胞癌细胞Tca8113生长及凋亡的影响。方法 细胞培养加入NS398作用后,采用噻唑蓝（MTT） 法观察NS398 对Tca8113细胞增殖的影响,流式细胞仪及透射电镜研究NS398对Tca8113细胞周期和凋亡的作用。结果 MTT比色法显示NS398能抑制Tca8113细胞的生长,呈浓度和时间依赖性。流式细胞仪检测结果显示NS398干预细胞出现典型的亚二倍体"凋亡峰";G0 /G1期细胞比例升高,S期和G2 /M期比例下降。电镜下见典型的凋亡形态学改变。结论COX-2抑制剂NS398在体外可通过诱导凋亡有效抑制Tca8113细胞的生长。     

HSV-tk/GCV系统对NIH3 T3细胞的体外杀伤作用研究

目的　研究HSV tk/GCV系统对NIH3T3细胞系的杀伤作用 ,为与成纤维细胞增殖有关的皮肤病基因治疗提供体外实验依据。方法　应用携带HSV tk基因的重组质粒pPNT tk通过磷酸钙转染传代培养的NIH3T3细胞 ,并经G418筛选 ,获得抗药性细胞集落 ,利用MTT法检测不同浓度GCV对NIH 3T3细胞的杀伤作用。结果　GCV对NIH3T3 /tk细胞有明显的细胞毒性作用 ,当GCV浓度为 10 .0 μmol/L时 ,NIN3T3 /tk细胞的生存抑制率已高达 95 %以上。而在同样药物浓度条件下 ,未转染的对照NIH 3T3细胞的生存抑制率为 11.9% ,与空白对照组相比较 ,差异无显著性。结论　HSV tk/GCV系统对NIH3T3细胞有很好的抑制作用 ,转染后细胞较之未转染细胞对前体药物更昔洛韦的敏感度显著增加 ,且呈剂量依赖性。     

TRP-1编码基因反义核酸对黑素细胞增殖及功能的影响

目的 构建酪氨酸相关蛋白-1(TRP-1)反义真核表达载体并转染TRP-1高表达的黑素细胞及恶性黑素瘤细胞,进一步研究其对黑素细胞及恶性黑素瘤细胞增殖及功能的影响。方法 将TRP-1基因反向亚克隆入真核表达载体pcDNA3.1,转染黑素细胞及恶性黑素瘤细胞。以逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测TRP-1mRNA水平的变化,免疫印迹法检测TRP-1蛋白水平的改变。通过流式细胞仪检测细胞周期的变化,并用L-多巴测定酪氨酸酶活性的改变。结果 成功构建重组反义表达载体pcDNA3.1/TRP-1(-),转染细胞稳定表达TRP-1反义核酸。RT-PCR提示TRP-1mRNA水平显著下降,免疫印迹提示其TRP-1蛋白表达水平降低。流式细胞检测表明反义TRP-1转染细胞发生细胞周期G1期阻滞。转染组黑素细胞及黑素瘤细胞酪氨酸酶活性抑制率分别达46%和54%。结论 TRP-1在黑素细胞及黑素瘤细胞的增殖及功能方面发挥重要作用,TRP-1反义核酸转染细胞细胞周期受到阻滞,酪氨酸酶活性明显降低。     

跨膜型血型A抗原模拟肽疫苗在黑素瘤细胞B16中表达及细胞毒效应检测

目的　建立稳定表达跨膜型血型A抗原模拟肽疫苗的恶性黑素瘤细胞株B16,并检测体外细胞毒活性。方法 采用脂质体转染法将前期构建的模拟肽疫苗稳定转染B16细胞进行表达,RT-PCR 及Western印迹法检测模拟肽/Fas融合基因及巨噬细胞炎症蛋白3β（Mip3β）的 mRNA及蛋白表达。细胞计数试剂盒-8（CCK-8）法检测疫苗介导的补体依赖性细胞毒效应（CDC）及抗体依赖的细胞介导细胞毒效应（ADCC）。结果 RT-PCR 在预期位置检测到特异性条带。Western印迹表明,表达产物具有特异的结合抗血型A抗体活性。析因分析提示不同分组之间CDC效应总体差异有统计学意义（F = 244.522,P < 0.01）,ADCC效应总体差异也有统计学意义（F = 71.593,P < 0.01）。组间比较示M-pIRES组CDC效应与空质粒pIRES组无统计学差异,两组均明显低于P/F-M-pIRES组和P/F-pIRES组;P/F-M-pIRES组、P/F-pIRES组ADCC效应明显强于M-pIRES组与pIRES组,P/F-M-pIRES组ADCC效应明显强于P/F-pIRES组（F = 15.42,P < 0.05）。结论　跨膜型血型A抗原模拟肽疫苗可在B16细胞膜稳定表达,且可通过介导CDC和ADCC发挥对黑素瘤细胞B16的杀伤作用。