黏附肽改性纯钛表面成骨细胞的早期黏附能力研究

目的 对纯钛表面钝化态氧化膜进行生物化学活化改性,探讨生物化学改性对钛表面成骨细胞黏附的影响.方法 24个纯钛试件打磨抛光后均分为4组,每组6个;纯钛组不处理,碱-热处理组行碱-热处理,溶胶涂层组行碱-热处理+溶胶涂层处理,黏附肽组行碱-热处理+溶胶涂层+黏附精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丝氨酸肽(Glycine-Tyrosine-Arginine-Glycine-Asparticacid-Serine,GYRGDS)处理.使用X射线光电子能谱(X-ray photoelectron spectroscopy,XPS)、傅里叶变换红外光谱计(Fourier transform infrared spectrometer,FTIR)分析各组钛表面化学元素及功能基团组成;在各组钛试件表面接种成骨细胞,经2.05 Pa流体剪切力作用30 min、1 h、2 h,计算细胞残留率.结果 碱-热处理组钛表面富含大量活性羟基,溶胶涂层组钛表面富含大量羟氧基团.黏附肽组钛表面经XPS及FTIR分析检测到酰胺峰,显示GYRGDS肽成功固定于钛表面.流体剪切力作用30 min、1 h和2 h后黏附肽组钛表面的成骨细胞残留率(分别为93.0%、54.4%、34.4%)均高于相应时间点其他组.结论 GYRGDS肽修饰后的钛表面成骨细胞黏附稳定性均优于非GYRGDS肽修饰组.     

RGD肽修饰的纯钛种植材料表面成骨细胞黏附增殖能力

目的:评价精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)肽修饰纯钛表面对细胞早期黏附增殖影响. 方法:利用分子自组装技术氨基化纯钛表面,化学接枝GYRGDS肽,计算不同时点材料表面黏附细胞数;不同浓度RGD肽液预处理接种前细胞,计算材料表面细胞黏附率;MTT法和扫描电镜分别检测材料表面细胞的增殖、生长.结果:RGD肽修饰的纯钛表面细胞早期黏附率、增殖活性和生长情况在各时点均优于未修饰组,高浓度肽液预处理对RGD肽修饰组表面细胞有较强黏附抑制作用.结论:采用分子自组装技术可将活性RGD肽稳定的化学接枝于纯钛表面,修饰后材料的细胞早期黏附增殖等生物学行为有明显改善.     

生物活性氧化锆对成骨细胞粘附、增殖及矿化的影响

目的 观察精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸三肽复合体修饰的氧化锆材料对小鼠成骨细胞粘附、增殖及矿化的影响。 方法 采用等离子喷涂的方法在钛片表面制备氧化锆涂层,经羟基化、硅烷化后在其表面连接精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸三肽复合体（Arg-Gly-Asp tripeptide complex,RGD）,并培养小鼠成骨细胞。使用激光共聚焦显微镜观察材料表面成骨细胞的粘着斑分布,并在培养24、48、72 h后进行细胞计数评价细胞增殖水平,用蛋白质印迹法检测成骨指标：碱性磷酸酶及骨钙素评价细胞矿化水平。 结果 带有RGD的氧化锆涂层表面成骨细胞形成更多粘着斑,增殖活性高,并且碱性磷酸酶及骨钙素表达水平升高。 结论 带有RGD的生物活性氧化锆涂层对成骨细胞的粘附、增殖及矿化具有促进作用。     

MinTBP-1-PRGDN双靶向融合肽对成骨细胞粘附影响的比较研究

目的：以胎牛血清（Fetal bovine serum,FBS）涂层为标准对照,研究minTBP-1-PRGDN双靶向融合肽对成骨细胞粘附的影响。方法：对商用纯钛进行minTBP-1-PRGDN双靶向融合多肽涂层,以无涂层的钛表面及胎牛血清涂层的钛表面分别作为空白对照和阳性对照,比较不同涂层处理对成骨细胞附着及伸展的影响。结果：成骨细胞粘附1h后,minTBP-1-PRGDN融合肽涂层的钛片上的细胞附着数量最多,FBS涂层表面次之,无涂层的钛片表面细胞数量最少、且与minTBP-1-PRGDN组比较有统计学差异（P〈0.05）;经形态计量学分析：FBS组细胞伸展面积最大,minTBP-1-PRGDN组次之,无涂层组细胞伸展最小。结论：minTBP-1-PRGDN融合肽涂层能提高成骨细胞在钛表面的附着和伸展能力。     

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目的    探讨精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）肽修饰纯钛表面对人牙龈成纤维细胞（human gingival fibroblasts，HGF）和上皮细胞（human gingival epithelial cells，HGE）初期黏附行为的影响。方法    应用羰基二咪唑（1，1′-carbonyldiimidazole，CDI）活化法将含RGD的短肽共价连接到纯钛表面，免疫荧光法检测钛表面RGD肽。评价RGD接枝与未接枝纯钛表面对HGF和HGE初期黏附的影响。结果    RGD肽可以通过CDI活化方法接枝到纯钛表面，HGF和HGE在RGD接枝钛表面黏附和增殖的细胞数量显著高于未接枝钛表面，差异有统计学意义（P < 0.01）。结论    生物活性肽RGD接枝纯钛表面可有效促进HGF和HGE在其表面的黏附。     

流体剪切力作用下喷砂酸碱处理钛表面对原代成骨细胞Wnt/β-catenin信号通路关键蛋白mRNA表达的影响

目的探讨流体剪切力及喷砂酸碱处理钛表面在不同时相对原代成骨细胞Wnt/β-catenin信号通路关键蛋白表达的影响。方法制备抛光处理纯钛钛片(P组)、喷砂酸碱处理纯钛钛片(S组),取新生第一天SD大鼠颅骨进行原代成骨细胞培养并分别接种于玻片(G组)、P组钛片、S组钛片表面,培养72h后,置于流体加载系统中,在0dynes/cm2(静止组)和12dynes/cm2(受力组)大小的流体剪切力下分别作用0h、0.25h、0.5h、1h、2h、4h,通过实时荧光定量聚合酶链反应检测低密度脂蛋白受体相关蛋白5(low-density lipoprotein receptor-relat-ed protein5,LRP5)和β-连环蛋白(β-catenin)的mRNA表达变化。结果 3种表面受力组LRP5和β-catenin的mRNA表达水平均比静止组高(P<0.05)。LRP5的mRNA表达水平在S组最高(P<0.05);细胞受力时G组在1h、P组和S组在0.5h时LRP5的mRNA表达量达到最高峰。β-catenin的mRNA表达水平在S组最高(P<0.05);细胞受力时表达量最高峰在3种表面均出现在0.5h。结论适宜大小的流体剪切力以及喷砂酸碱处理钛表面均能促进成骨细胞Wnt/β-catenin信号通路的激活,并且喷砂-酸碱处理钛表面提高了成骨细胞Wnt/β-catenin信号通路对流体剪切力刺激的敏感性。     

RGD多肽表面修饰对HA-TCP生物陶瓷细胞相容性的影响

目的：了解精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（Arg-Gly-Asp,RGD）多肽表面修饰对羟基磷灰石-磷酸三钙（hydroxyapatite-tricalcium phosphate,HA-TCP）细胞相容性的影响。方法：以骨髓基质于细胞（marrow stromal stem cells,MSCs）复合RGD多肽表面修饰的HA-TCP或单纯材料培养制备组织工程骨,用倒置相差显微镜和扫描电镜观察MSCs的粘附和生长情况、检测细胞活力和碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）活性、流式细胞仪分析细胞周期。结果：MSCs在材料表面和孔隙内均可粘附和生长,粘附于RGD多肽修饰HA-TCP的细胞活力和ALP活性明显高于未经RGD多肽修饰组（P〈0．01,P〈0．05）。各组细胞周期未见明显变化,未见异倍体细胞。结论：RGD多肽表面修饰对HA-TCP材料的细胞相容性有明显的优化作用。     

粘附肽精氨酸—甘氨酸—天冬氨酸促进小鼠成骨细胞在材料表面的附着和铺展

目的：研究粘附肽RGD（精氨酸－甘氨酸－天冬氨酸）对对小成骨细胞夺材料表面附着和铺展的影响,为使用粘附肽对肿有面修提供外体实验依据。方法：采用自组装单层结构法将含有RGD的粘附肽片段RGDC以共价键固定在材料表面,小鼠成骨细胞体外培养4h,细胞计数分析其对材料的附着。FITC标记免疫荧光染色观察培养4h后细胞内肌动蛋白的分布。结果：RGD可以使细胞对材料表面的附着密度显著提高,体外培养4h,细胞在RGD材料表面具有良好的铺展形态,结论：表面固定RGD可以促进细胞对材料表面的附着和铺展。     

RGD序列与种植体骨整合

RGD序列由精氨酸、甘氨酸和天冬氨酸组成,存在于多种细胞外基质中,可与11种整合素特异性结合,能有效地促进细胞对生物材料的粘附。将RGD序列固定于钛或钛合金种植体表面,可以促进成骨细胞对钛或钛合金表面的粘附,进一步促进种植体骨整合,提高种植义齿的成功率。RGD序列的空间结构、修饰密度、周围序列对其活性都有一定影响。本文就RGD序列的生物学效应和它在种植体骨整合中的应用及其影响因素作一综述。     

钛纳米管表面RGD修饰工艺的初步研究

目的：通过在TiO2纳米管表面构建RGD（Arg—Gly—Asp）活性肽阵列,掌握钛纳米管表面制备活性肽阵列的工艺方法。方法：通过阳极氧化法在纯钛表面制备TiO2纳米管阵列,通过扫描电镜、原子力显微镜和荧光显微镜研究化学偶联法将RGD组装在钛纳米管表面的工艺。结果：采用3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES）对钛纳米管预处理2h,然后用交联剂N-琥珀酰亚胺3-马来酸亚胺丙酸酯（SMP）连接钛纳米管上的氨基和RGDC中的硫醇基将RGDC组装在钛纳米管上。结论：使用化学偶联的方法,可将RGD短肽共价连接钛纳米管表面构成RGD生物活性涂层。     

细胞骨架完整陛在流体剪切力诱导成骨细胞COX-2基因表达中的作用

目的探讨细胞骨架完整性在流体剪切力诱导成骨细胞COX-2基因表达中的作用。方法原代培养BALB／c小鼠颅骨成骨细胞,采用细胞松弛素D（CD）破坏细胞骨架完整性：以12dyne／cm2的流体剪切力对成骨细胞加载1．5h;分别应用实时荧光定量巢式PCR和免疫荧光的方法检测COX-2基因mRNA和蛋白的表达水平．并对结果进行双因素方差分析。结果采用CD破坏细胞骨架完整性．可以对流体剪切力诱导成骨细胞COX-2mRNA和蛋白的表达起拮抗作用（P〈0．05）：在无流体剪切力加载条件下,CD处理对COX-2mRNA和蛋白的表达水平无显著影响（P〉0．05）;流体剪切力加载1．5h能使成骨细胞COX-2mRNA和蛋白的表达水平显著升高（P〈0．05）;CD处理可显著降低流体剪切力诱导成骨细胞COX-2mRNA和蛋白的表达水平（P〈0．05）。结论保持细胞骨架完整性是流体剪切力诱导成骨细胞COX-2基因表达过程中所必需的。     

细胞骨架完整性对流体剪切力诱导成骨细胞c-fos基因mRNA和蛋白表达的影响

目的 研究细胞骨架完整性在流体剪切力诱导成骨细胞c-fos基因mRNA和蛋白表达中的作用,为进一步探索骨组织力传导机制提供依据.方法 原代培养BALB/c小鼠成骨细胞,将原代培养的成骨细胞分为对照组和细胞松弛素 D组,细胞松弛素D组使用细胞松弛素D破坏细胞骨架.每组一半细胞加载1.2 Pa的流体剪切力,另一半不加载.分别用实时荧光定量聚合酶链反应(real-time PCR)和免疫荧光检测c-fos基因mRNA和蛋白、细胞骨架蛋白的表达水平,并对结果进行双因素方差分析和成组t检验.结果 无论是对照组还是细胞松弛素D组,流体剪切力加载均可使成骨细胞c-fos基因mRNA相对水平(分别为0.1637±0.0303和0.0104±0.0070)和蛋白荧光强度(分别为177.14±9.37和150.95 ±6.17)升高,与未加载流体剪切力的对照组和细胞松弛素D组细胞(mRNA相对水平分别为0.0057±0.0021和0.0032±0.0014,蛋白荧光强度分别为117.96±4.11和119.77±5.19)相比,差异均有统计学意义(P＜0.05).流体剪切力加载下,细胞松弛素D组细胞c-fos基因mRNA和蛋白的表达均低于对照组,差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 细胞松弛素D对流体剪切力诱导成骨细胞c-fos基因mRNA和蛋白的表达起拮抗作用.保持细胞骨架的完整性是流体剪切力诱导成骨细胞c-fos基因表达过程中的重要条件.     

生物材料表面固定粘附肽调节小鼠成骨细胞骨钙素的表达

目的：观察材料表面固定粘附肽RGD对小鼠成骨细胞骨钙素mRNA表达的影响。方法：采用自组装单层结构法含RGD的粘附肽PGDC共价结合在试件表面,建立RDGC和空白对照组。接种小鼠原代成骨细胞,分别收集培养第10,15,21天的细胞,提取总RNA,Northen印迹杂交法检测骨钙素mRNA的表达。结果：RGD组第15天即开始出现明显的骨钙素基因表达,对照组的基因表达出现在第21天。结论：材料表面固定RGD有促进骨钙素基因表达,影响小鼠成骨细胞分化的功能。     

Physical stability of arginine-glycine-aspartic acid peptide coated on anodized implants after installation

PURPOSE

The aim of this study was to evaluate the stability of arginine-glycine-aspartic acid (RGD) peptide coatings on implants by measuring the amount of peptide remaining after installation.

MATERIALS AND METHODS

Fluorescent isothiocyanate (FITC)-fixed RGD peptide was coated onto anodized titanium implants (width 4 mm, length 10 mm) using a physical adsorption method (P) or a chemical grafting method (C). Solid Rigid Polyurethane Foam (SRPF) was classified as either hard bone (H) or soft bone (S) according to its density. Two pieces of artificial bone were fixed in a customized jig, and coated implants were installed at the center of the boundary between two pieces of artificial bone. The test groups were classified as: P-H, P-S, C-H, or C-S. After each installation, implants were removed from the SRPF, and the residual amounts and rates of RGD peptide in implants were measured by fluorescence spectrometry. The Kruskal-Wallis test was used for the statistical analysis (α=0.05).

RESULTS

Peptide-coating was identified by fluorescence microscopy and XPS. Total coating amount was higher for physical adsorption than chemical grafting. The residual rate of peptide was significantly larger in the P-S group than in the other three groups (P<.05).

CONCLUSION

The result of this study suggests that coating doses depend on coating method. Residual amounts of RGD peptide were greater for the physical adsorption method than the chemical grafting method.     

纯钛微弧氧化-多巴胺-环型多肽涂层的细胞相容性研究

目的:探讨纯钛种植体表面加载环型多肽对成骨细胞生物行为的影响。方法:微弧氧化组为M组,微弧氧化加载多巴胺组为P组,微弧氧化加载多巴胺接枝环环肽组为R组。扫描电镜对3组钛片进行表面形貌分析,能谱仪分析3组试件元素成分。CCK-8检测成骨细胞不同时间点在3组的增殖黏附能力,激光共聚焦观察成骨细胞在3组涂层表面的铺展情况。结果:扫描电镜及能谱显示涂层加载成功,CCK-8显示R组的A值在各个时间点上都高于M组和P组,且各组比较具有统计学意义(P<0.05)。激光共聚焦观察R组细胞数目最多,伪足较多,细胞联系最为紧密。结论:纯钛表面加载环肽后能有效的促进成骨细胞早期的黏附及增殖。     

丝切蛋白在成骨细胞细胞骨架改建中的作用探讨

目的 采用流体剪切力加载成骨细胞,通过观察细胞骨架改建和测定丝切蛋白及磷酸化丝切蛋白的含量,探讨丝切蛋白在流体剪切力引起成骨细胞细胞骨架改建中的作用.方法 采用1.2 Pa的流体剪切力作用于成骨细胞0(空白对照组)、15、30、45、60、120 min后,蛋白质印迹法测定细胞内丝切蛋白及磷酸化丝切蛋白的含量,采用异硫氰酸荧光素标记的鬼笔环肽染色观察纤维型肌动蛋白的变化.结果 成骨细胞受流体剪切力刺激后,随加载时间延长,细胞内磷酸化丝切蛋白含量持续升高.流体剪切力作用60 min内丝切蛋白随加载时间延长有所下降,但加载120 min时细胞内丝切蛋白含量(0.254±0.026)为加载60 min(0.162±0.004)的1.5倍.随流体剪切力作用时间延长,各组细胞纤维型肌动蛋白染色逐渐增强,纤维增粗;加载120 min时的平均荧光强度(42.93±6.41)为空白对照组(15.41±3.60)的2.8倍(P＜0.05).结论 流体剪切力刺激可通过丝切蛋白磷酸化,使成骨细胞细胞骨架发生改建.