慢病毒——基因转移的潜在新载体

随着对疾病分子机制认识的加深及生物技术的发展,基因治疗已成为治疗感染性疾病、遗传疾病、神经系统疾病以及肿瘤的新焦点。用于基因治疗的载体系统可分为病毒性载体和非病毒性载体两类。目前常用的病毒载体包括逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、疱疹病毒载体、痘苗病毒载体等,但是这些载体均存在不足之处,严重影响了基因治疗的有效性及安全性。在基因治疗中广泛应用的逆转录病毒载体存在的主要问题,是无法高效转导非分裂期细胞,而腺病毒载体虽然能转导非分裂期细胞,但在体内不能实现目的基因稳定的长期表达,且反复应用容易引…     

USP22 ShRNA慢病毒载体的构建及鉴定

目的：构建并鉴定USP22基因ShRNA慢病毒载体,为进一步研究USP22基因在鼻咽癌中的作用机制奠定基础。方法针对USP22基因的编码序列设计并合成2条特异性干扰序列,序列两端含有限制性内切酶位点HpaⅠ和X hoⅠ。寡核苷酸链退火生成寡核苷酸双链,5＇端磷酸化后将含有酶切位点的寡核苷酸双链克隆到pLL3.7慢病毒表达载体。连接产物经转化、培养,提取其质粒,提取出来的质粒经HpaⅠ和XhoⅠ酶切电泳鉴定,鉴定正确的质粒进行测序。构建成功的慢病毒表达载体pLL-USP22-shRNA与包装载体质粒混匀共转染于293T细胞。通过荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白（GFP）情况,对病毒滴度和感染效率进行检测。结果成功构建慢病毒表达载体pLL-USP22-shRNA。与包装载体质粒共转染293T细胞后测定慢病毒滴度为4×10^7 TU/ml。结论本实验应用相关技术成功构建USP22 ShRNA慢病毒载体,为进一步研究USP22基因的生物学功能奠定了基础。     

慢病毒载体的发展历程及现状

慢病毒载体目前是基因治疗中研究较多的载体,慢病毒载体逐渐成为病毒载体研究的重点。本文主要就慢病毒载体的历史发展进程及到目前为止的最新发展状况进行综述。     

人肺癌转移相关蛋白1重组慢病毒载体的构建和病毒包装及其鉴定

目的构建人肺癌转移相关蛋白1（LCMR1）重组慢病毒载体,并包装慢病毒颗粒,为进一步研究该基因在人肺癌发生发展中的功能提供实验基础。方法将人肺癌转移相关基因LCMR1扩增后,酶切连接构建人pLVX—IRES—Neo病毒载体,转化DH5a大肠杆菌,挑取阳性克隆测序鉴定,将重组质粒与慢病毒系统一起转染Lenti—X293T病毒包装细胞,并将收集的病毒感染肺癌细胞系95C,即时定量聚合酶链反应（q—PCR）及蛋白质印迹法验证其表达情况。结果DNA测序结果证实成功构建人LCMR1重组慢病毒载体,包装后的病毒浓缩液浓度可达2．5×10^8IFU／ml以上。包装后的病毒颗粒感染95C细胞系,LCMR1的mRNA水平提高9．98倍（P〈0．05）,蛋白水平的表达也明显增强。结论本研究成功构建了pLVX—IRES—LCMR1-Neo慢病毒载体,获得的慢病毒颗粒有效感染肺癌细胞系95C,为研究该基因在肺癌中的功能建立了模型。     

大鼠FasL基因重组慢病毒载体介导大鼠肾细胞体外转染

目的 探讨慢病毒载体对大鼠肾细胞体外转染的可行性.方法 三质粒系统共转染包装细胞293-T,合成重组慢病毒载体,P24gag EIISA对其定量测定.流式细胞术测定SD大鼠肾细胞Fas、FasL的表达.Western blot、RT-PCR检测转染后目的 基因的表达.结果 定量测定目的 基因载体、空白载体浓度分别为11.6 ng/ml、13.8 ng/ml,Western blot、RT-PCR分别检测到目的 基因的表达.结论 慢病毒载体体外成功转染SD大鼠肾细胞,并表达目的 基因.     

HuR基因的慢病毒干扰载体构建及其病毒包装

目的 构建人HuR基因慢病毒干扰载体和基因敲低细胞株,为揭示C/EBPβ3'UTR RNA 与HuR蛋白相互作用抑制肝癌细胞增殖的分子机制奠定基础.方法 根据shRNA设计原则设计人HuR基因的shRNA序列,用化学合成法合成shDNA序列,以LV10(pGLVU6/RFP/Puro)为载体骨架,构建慢病毒干扰载体LV10-HuR,并与慢病毒包装辅助载体(pLP1、pLP2和pLP/VSVG)共转染HEK293T细胞,收集病毒液纯化后感染SMMC-7721细胞并用嘌呤霉素杀死未感染的肝癌细胞,荧光显微镜下挑取单克隆红色荧光细胞集落,扩大培养后通过Western blot验证肝癌细胞内源性HuR蛋白表达.结果 经DNA测序鉴定,LV10-HuR正是所需的慢病毒干扰载体.通过共转染获得的重组慢病毒颗粒感染的肝癌细胞在荧光显微镜下显示红色荧光.嘌呤霉素筛选和单克隆细胞集落挑取获得显示红色荧光细胞株,western blot证明稳转细胞内源性HuR基因表达下降,证明LV10-HuR慢病毒干扰载体可以抑制肝癌细胞内源性HuR基因表达.结论 成功构建慢病毒干扰载体LV10-HuR,包装出有活性的重组慢病毒颗粒,建立HuR基因敲低肝癌细胞株.     

人miR-378慢病毒表达载体的构建及鉴定

目的构建人miR-378慢病毒表达载体。方法酶切法从已构建的质粒获得pri-miR-378,克隆于含绿色荧光蛋白(GFP)编码基因的PGCSIL载体,转化感受态细胞,产生重组慢病毒质粒PGCSIL-miR-378,并进行PCR及测序鉴定。将PGCSIL-miR-378、pHelper 1.0和pHelper 2.0三种质粒DNA共转染293T细胞,包装产生慢病毒,以293T细胞GFP蛋白的表达水平用逐孔稀释滴度法测定病毒滴度。结果成功构建miR-378的慢病毒表达载体,测序证实所插入基因序列完全正确。荧光显微镜检测证实PGCSIL-miR-378携有正确的miR-378基因,并能在293T细胞中表达。检测病毒滴度为8×108 TU/ml。结论成功建立了miR-378慢病毒表达系统。     

大鼠CRH基因RNA干扰慢病毒载体的构建与鉴定

目的：构建针对大鼠促肾上腺皮质激素释放激素（CRH）基因的RNA干扰（RNAi）慢病毒表达载体并进行鉴定。方法针对CRH基因设计4个RNAi靶点并分别构建入慢病毒骨架载体,测序鉴定。过表达质粒和RNAi质粒共转染293T工具细胞后,用Western blot进行外源筛靶以确定有效靶序列。有效RNAi病毒质粒与辅助质粒通过Lipofectamine 2000共转染293T细胞,培养48 h后,收集细胞培养上清液,将其浓缩后用孔稀释法测定病毒滴度。结果 Western blot外源筛靶显示3个靶点能有效敲减目的基因的表达。测定浓缩病毒悬液的滴度为1．5×109 T U／ml。结论成功构建了CRH基因的RNAi慢病毒载体,可用于CRH在应激反应中作用的研究。     

has-miR-181b慢病毒表达载体的构建与鉴定

目的构建靶向has-miR-181b基因的慢病毒表达载体。方法根据has-miR-181b序列设计互补的单链寡核苷酸引物序列进行退火延伸后连入经双酶切的pGCSIL-GFP载体质粒,与辅助元件载体质粒pHelper 1.0及pHelper 2.0共同导入感受态细胞T293进行慢病毒包装,收集、浓缩并测定病毒滴度。用所得病毒转染U87胶质瘤细胞;实时定量PCR检测转染后miR-181b表达,流式细胞术检测细胞凋亡以及Transwell实验评价细胞侵袭能力的改变。结果目的序列成功连接入载体,测序分析证实目的序列载体构建成功,并测得病毒滴度为6×109 TU/ml;病毒转染U87胶质瘤细胞能够显著上调has-miR-181b表达,该病毒载体能够有效诱导胶质瘤细胞凋亡,显著抑制U87细胞的侵袭性。结论成功建立高效稳定表达has-miR-181b的慢病毒转染系统,体外实验中能够有效诱导U87胶质瘤细胞凋亡,并且可以抑制胶质瘤的侵袭能力。     

ERα基因shRNAi慢病毒载体的构建与滴度测定

目的：构建ERα基因RNAi慢病毒载体,检测病毒感染细胞的滴度。方法：针对已经筛选确定的ERα基因RNAi有效靶序列,合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与经Age I和EcoRI 酶切后的pGCsil-GFP载体［含U6启动子和绿色荧光蛋白（GFP）］连接产生shERα-LV慢病毒载体,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定。 用shERα-LV载体、pHelper 1.0 载体和pHelper 2.0质粒共转染包装细胞293T细胞,包装产生慢病毒,以293T细胞GFP蛋白的表达水平测定病毒滴度。结论：PCR和测序证实,成功构建ERα shRNA的慢病毒载体shERα-LV. 包装慢病毒,浓缩病毒悬液的滴度为2E+8TU/ml。讨论：成功构建人ERα基因RNAi慢病毒载体,为ERα在乳腺癌发生发展中的研究提供了工作基础。     

表皮生长因子受体基因RNA干扰慢病毒载体的构建和鉴定研究

目的构建表皮生长因子受体(EGFR)基因RNA干扰(RNAi)慢病毒载体,为其体内外实验研究提供依据。方法合成EGFR基因的miRNA干扰序列,构建pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR-EGFR质粒,测序验证插入序列正确,连接到慢病毒载体pLenti6.3-MCS/V5 DEST中,获得pLenti6.3-EGFR-miRNA质粒,与慢病毒包装质粒Packaging MIX、POLOdelivererTM3000 Transfection Reagent共转染293T细胞株,细胞包装产生慢病毒颗粒,测定慢病毒滴度。结果 PCR和测序结果证实,EGFR miRNA核苷酸链序列插入正确,包装慢病毒产生病毒悬液滴度为1.8×106ifu/ml。结论成功构建EGFR基因RNAi慢病毒载体,为研究其在胶质瘤细胞中的生物学功能奠定基础。     

基因转移载体的研究进展

目的:介绍基因转移载体的研究进展,为其深入研究提供参考.方法:对近年来有代表性的文献进行分析、归纳.结果:介绍了病毒载体和非病毒载体的主要优缺点、研究方向及存在的障碍.结论:病毒载体虽转染率较高、表达时间长,但其安全性令人担比.非病毒载体的转染率还不够高,有效表达时间短,其毒副反应近来也受到关注;为了进一步提高其转染率和表达持续时间,还须深入研究外源DNA进入靶细胞核的细胞和分子机制.     

含IL-24基因重组慢病毒表达载体的构建及其对肝癌细胞生长的抑制作用

目的 探讨白细胞介素(IL)24基因表达目的蛋白IL-24的方法,检测IL-24对肝癌细胞生长的影响.方法 自经5μg/ml植物血凝素(PHA)刺激的正常人单个核细胞(PBMCs)中提取总RNA,RT-PCR扩增出IL-24 cDNA,插入到pHAGE-CMV-MCS-IzsGreen中构建成慢病毒转移载体pHAGE-IL-24,转染HEK 293T细胞.荧光显微镜观察293T细胞中绿色荧光蛋白(GFP)表达;梯度稀释法测定病毒滴度,感染HEK 293T细胞48 h后进行RT-PCR和Western blot检测IL-24的基因和蛋白表达;MTT法检测细胞的增殖.结果 限制性内切酶检测和基因测序证实成功构建了携带IL-24基因的慢病毒表达载体,滴度为5×106TU/ml.以MOI为5.0的重组慢病毒感染靶细胞HepG2 48 h后,能够检测到外源基因IL-24的蛋白表达.IL-24能够抑制肝癌细胞的生长.结论 成功构建了含IL-24基因的慢病毒表达载体,获得的病毒能够有效感染HepG2细胞,并在其中大量表达目的蛋白;IL-24能够抑制肝癌细胞的生长.     

大鼠ILK-RNAi慢病毒表达载体的构建及鉴定

目的 构建大鼠整合素连接激酶-RNAi(ILK-RNAi)慢病毒表达载体,为下一步干预研究细胞转分化及其信号通路奠定基础.方法 针对大鼠ILK基因RNAi有效靶序列,合成4条干扰(KD)序列.与pGCSIL-GFP载体连接产生shILK-RNAi慢病毒载体.将连接产物转入制备完毕的细菌感受态细胞,PCR鉴定阳性克隆,测序验证.包装慢病毒,以绿色荧光蛋白(GFP)表达水平验证病毒滴度.慢病毒载体感染大鼠NRK-52E细胞后,RT-PCR、WB检测及荧光显微镜观察ILK在其细胞中的表达.结果 测序验证成功构建3条大鼠ILK-RNAi慢病毒载体,滴度分别为5×108,2.5×108,3.5×108 pfu/mL.分别以不同感染复数(MOI)感染NRK-52E细胞进行内源筛靶,荧光观察80％细胞的绿色荧光蛋白,RT-PCR、WB检测ILK的表达明显下降.相对于阴性对照序列,KD2,KD3在高MOI组中对ILK表达的敲减达到65％以上(P＜0.05),为有效靶点.其中KD2及KD3的ILK 2-△△ct值分别为0.337,0.217.KD2序列为对ILK的表达抑制最显著.结论 成功构建大鼠ILK-RNAi慢病毒表达载体.     

缺陷病毒载体系统的研究进展

近年来缺陷病毒载体系统在基因治疗和许多基础研究中发挥着越来越重要的作用。本文将几种主要的缺陷病毒载体系统，包装细胞及其在基因治疗方面的应用作一综述。     

基于慢病毒载体系统构建重组JSRV－NM假病毒

【摘要】目的 采用慢病毒质粒结构重组JSRV-NM假病毒,克服JSRV-NM病毒只能通过绵羊支气管穿刺接种扩增,不能通过体外细胞培养扩增的问题。方法 采用慢病毒高效包装系统pMD.G、pCMV-HIV△8.2和pHIVeGFP,以JSRV-NM病毒的env包膜质粒pCMVJSRV-NM替代VSV-G病毒的包膜质粒pMD.G,转染293T细胞,复制、包装并产出重组的JSRV-NM假病毒。用real-time PCR检测WPRE表达来测定假病毒的滴度,用接种24孔板的293T细胞检测假病毒感染力。结果 成功重组了基于慢病毒质粒结构的JSRV-NM假病毒,可超速离心浓缩成高滴度（1×10⁸TU/mL）的病毒,Lv-JSRV-NM包膜与Lv-VSV-G包膜按感染复数（MOI）=3的比例感染Hela细胞具有相同的感染能力。结论 基于慢病毒质粒构建的JSRV-NM假病毒,能够在293T细胞中复制和扩增,产出的假病毒具有稳定性、感染力和安全性,符合二级生物实验室安全的要求。     

ZNF24基因过表达慢病毒载体的构建及其在人结直肠癌HCT116细胞中的表达

目的 通过构建ZNF24基因过表达慢病毒载体,建立ZNF24基因过表达的人结直肠癌HCT116细胞株,为开展后续研究提供物质基础。方法 通过PCR扩增ZNF24基因序列片段和3FLAG标签序列片段,并将两产物通过同源重组克隆至慢病毒载体pMT406中,构建成重组表达ZNF24慢病毒质粒pMT-ZNF24。将重组质粒pMT-ZNF24与辅助包装载体质粒p CMV-dR8.9和pCMV-VSV-G一起共转染293T细胞并收集慢病毒。应用孔稀释法检测病毒滴度,用qRT-PCR和蛋白印迹法检测慢病毒转染HCT116细胞后ZNF24的表达水平。结果 成功构建了重组载体pMT-ZNF24,并获得相应的病毒,病毒滴度为3.25×10⁹ TU/ml。转染重组ZNF24慢病毒的HCT116细胞中ZNF24表达水平显著高于空白组和阴性对照组细胞。结论 构建了ZNF24基因过表达慢病毒载体,并获得相应的病毒和稳定表达ZNF24的HCT116细胞株。     

非病毒载体在肿瘤基因治疗领域的研究进展

随着肿瘤基因治疗领域的研究进展，临床应用逐渐增多。载体是癌症基因治疗的主要难题。当前广泛使用的病毒载体存在的安全问题越来越受到人们的重视，已经有多种非病毒载体用于肿瘤基因治疔，如：裸DNA直接注射、阳离子脂质、阳离子聚合物。研究非病毒载体的目标是：它能像靶向的合成病毒载体那样对肿瘤组织表现出高度特异性；具有很高的转染效率；潜在的安全性问题能够被控制。