Runx2、Osterix转录因子过表达驱动内皮细胞成骨分化的机制探讨

目的:探讨Runx2和Osterix (OSX)过表达对人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)成骨分化的调控作用.方法:通过慢病毒载体,将Runx2和Osterix基因分别转染入HUVECs.通过碱性磷酸酶(ALP)染色、半定量活性检测,探讨过表达Runx2和Osterix对HUVECs成骨分化的影响.通过RT-PCR、蛋白免疫印迹、免疫荧光染色检测成骨相关标志物Runx2、OSX、ALP、骨涎蛋白(BSP)、骨桥蛋白(OPN)、骨钙蛋白(OCN)在HUVECs中的表达.采用GraphPad Prism 6.01软件包对数据进行统计学分析.结果:Runx2过表达有利于HUVECs的成骨分化,而Osterix过表达则无此作用.HUVECs转染Runx2过表达慢病毒后,成骨相关基因Runx2、OSX、ALP、BSP、OPN及OCN的转录水平上调,同时Runx2、OSX、OPN及OCN的蛋白表达水平亦有所上调.结论:Runx2过表达可促进HUVECs的成骨分化.     

化脓链球菌脂磷壁酸对人牙周膜干细胞分化能力的影响

目的 研究脂磷壁酸(LTA)对牙周膜干细胞(PDLSCs) 分化能力的影响,从而探讨G+细菌毒素LTA对人牙周膜干细胞再生牙周组织的影响.方法 用0.1、1和10μg/ml的LTA作用于PDLSCs,采用MTT方法及流式细胞术检测细胞的增殖及凋亡情况,使用碱性磷酸酶染色和茜素红染色对细胞的成骨分化能力进行比较;应用油红O染色鉴定成脂分化能力,实时定量PCR检测成骨成脂相关基因的变化,研究LTA在PDLSCs分化中的作用.结果 1μg/ml及10μg/ml LTA显著降低PDLSCs增殖率,细胞凋亡增加.ALP染色及活性结果表明,早期成骨能力各组之间没有显著差异;茜素红染色结果及钙离子浓度定量测定显示,随LTA浓度升高,PDLSCs晚期成骨能力降低,并具有LTA浓度依赖性.成骨相关基因Runx2表达表现相同变化趋势.油红O染色结果表明,随着LTA浓度的增加,PDLSCs的成脂分化能力升高,成脂相关基因PPARγ表达升高,具有LTA浓度依赖性.结论 LTA降低PDLSCs成骨分化能力,同时促进细胞成脂分化能力,表明LTA抑制PDLSCs介导的牙周组织再生.     

富血小板纤维蛋白通过Wnt/β-catenin信号通路促进BMSCs成骨分化的研究

目的 :研究富血小板纤维蛋白(PRF)通过Wnt/β-catenin信号通路对骨髓基质干细胞(BMSCs)分化的影响。方法:分离、培养原代兔BMSCs,取第三代细胞进行干细胞鉴定,收集同一只兔耳缘静脉血离心制备PRF,将PRF与BMSCs置于Transwell小室中共培养并进行成骨分化。实验分组:A组为单纯BMSCs对照组;B组为PRF与BMSCs共培养组;C组为加入DKK1的PRF与BMSCs共培养组;D组为加入Wnt3a的PRF与BMSCs共培养组。茜素红染色观察各组钙结节形成情况,碱性磷酸酶(ALP)试剂盒检测各组ALP活性,定量聚合酶链反应(q RT-PCR)检测成骨成脂相关基因Runx2、OCN、PPARγ2及LPL的m RNA表达,同时检测Wnt/β-catenin信号通路关键因子Cyclin D1及β-catenin的m RNA表达。结果:流式细术检测结果显示,原代培养的BMSCs符合间充质干细胞鉴定标准。茜素红染色结果显示,B组和D组的钙结节数量明显多于A组和C组,A组和C组之间无明显差异。碱性磷酸酶(ALP)活性检测结果显示,B组与D组的ALP活性较A组和C组明显增加(P<0.05),且两组之间差异无明显统计学意义。q RTPCR结果显示B组与D组中的成骨分化标志基因Runx2、OCN的m RNA表达,较A组和C组显著增加(P<0.05),而成脂分化标志基因PPARγ2、LPL的m RNA表达显著降低(P<0.05)。此外,B组和D组中Wnt/β-catenin信号通路关键因子Cyclin D1及β-catenin的m RNA表达较A组和C组显著增加(P<0.05)。结论:PRF通过激活Wnt/β-catenin信号通路促进BMSCs成骨分化而抑制其成脂分化。     

Dlx2在MC3T3-E1细胞成骨分化过程中的作用

目的:探讨Dlx2(distal-less homeobox 2)基因过表达对体外培养的小鼠前成骨细胞系MC3T3-E1 向成骨方向分化的影响.方法:构建Dlx2过表达的反转录病毒载体,测序验证.体外病毒转染MC3T3-E1后,以嘌呤霉素行抗性筛选稳定细胞株,以RT-PCR和Western印迹检测转染后细胞中Dlx2的表达.应用实时定量PCR(RT-PCR)检测Dlx2过表达对部分成骨相关基因(ALP、OCN、Runx2、Msx2)表达的影响.以碱性磷酸酶(ALP)活性测定和茜素红染色法检测Dlx2过表达对MC3T3-E1细胞成骨分化的影响.采用SAS 6.04软件包对数据进行随机设计的方差分析.结果:本实验成功构建Dlx2过表达的反转录病毒载体,测序正确.体外转染后筛选出Dlx2稳定高表达细胞株MC3T3-E1-Dlx2,其mRNA和蛋白表达量显著高于对照组.在成骨诱导过程中,MC3T3-E1-Dlx2细胞ALP值在第4、7、14d均高于对照组细胞,茜素红染色显示实验组较对照组和空白组染色深.Dlx2过表达在成骨诱导早期能显著促进ALP和Msx2的表达(P<0.05),晚期则上调OCN表达(P<0.05),而Runx2表达无明显变化(P>0.05).结论:Dlx2过表达上调AIP、OCN等成骨相关基因的表达.促进MC3T3-E1细胞的成骨分化.     

过表达ADAM10通过调控Notch信号通路对牙周膜干细胞成骨分化的影响

目的:探讨解整合素金属蛋白酶10(ADAM10)调控Notch信号通路对人牙周膜干细胞(hPDLSCs)成骨分化的影响.方法:体外培养hPDLSCs并对其进行成骨分化诱导,RT-PCR检测成骨诱导第0、7、14天细胞中ADAM10 mRNA表达水平.采用ADAM10过表达慢病毒感染hPDLSCs,并将细胞分为空白对照组、空载组和ADAM10过表达组,分别采用RT-PCR和Western blot检测感染后hPDLSCs中ADAM10 mRNA和蛋白表达水平,CCK-8检测各组细胞增值情况.感染的hPDLSCs经成骨诱导分化后,茜素红染色观察各组细胞矿化结节生成情况,RT-PCR检测各组细胞中成骨相关基因ALP、Runx2、OCN以及Notch信号通路相关基因Notch1、NICD、Hes1的mRNA表达水平,Western blot检测Notch信号通路相关蛋白Notch1、NICD和Hes1的蛋白表达水平.结果:hPDLSCs成骨诱导分化的第0、7、14天过程中,ADAM10 mRNA表达水平逐渐降低(P<0.05).感染ADAM10过表达慢病毒后,hPDLSCs中ADAM10 mRNA和蛋白表达水平显著增加(P<0.05),同时细胞增殖能力明显增强(P<0.05).成骨诱导分化后,与对照组和空载组比较,ADAM10过表达组矿化结节形成量、成骨相关基因ALP、Runx2、OCN的mRNA表达水平以及Notch信号通路相关基因Notch1、NICD、Hes1的mRNA和蛋白表达水平均显著降低(P<0.05).结论:过表达ADAM10可促进hPDLSCs增殖并抑制其成骨分化,其机制可能与Notch信号通路的激活有关.     

过表达ADAM10通过调控Notch信号通路对牙周膜干细胞成骨分化的影响

目的:探讨解整合素金属蛋白酶10(ADAM10)调控Notch信号通路对人牙周膜干细胞(hPDLSCs)成骨分化的影响.方法:体外培养hPDLSCs并对其进行成骨分化诱导,RT-PCR检测成骨诱导第0、7、14天细胞中ADAM10 mRNA表达水平.采用ADAM10过表达慢病毒感染hPDLSCs,并将细胞分为空白对照组、空载组和ADAM10过表达组,分别采用RT-PCR和Western blot检测感染后hPDLSCs中ADAM10 mRNA和蛋白表达水平,CCK-8检测各组细胞增值情况.感染的hPDLSCs经成骨诱导分化后,茜素红染色观察各组细胞矿化结节生成情况,RT-PCR检测各组细胞中成骨相关基因ALP、Runx2、OCN以及Notch信号通路相关基因Notch1、NICD、Hes1的mRNA表达水平,Western blot检测Notch信号通路相关蛋白Notch1、NICD和Hes1的蛋白表达水平.结果:hPDLSCs成骨诱导分化的第0、7、14天过程中,ADAM10 mRNA表达水平逐渐降低(P<0.05).感染ADAM10过表达慢病毒后,hPDLSCs中ADAM10 mRNA和蛋白表达水平显著增加(P<0.05),同时细胞增殖能力明显增强(P<0.05).成骨诱导分化后,与对照组和空载组比较,ADAM10过表达组矿化结节形成量、成骨相关基因ALP、Runx2、OCN的mRNA表达水平以及Notch信号通路相关基因Notch1、NICD、Hes1的mRNA和蛋白表达水平均显著降低(P<0.05).结论:过表达ADAM10可促进hPDLSCs增殖并抑制其成骨分化,其机制可能与Notch信号通路的激活有关.     

p38信号通路在牙周膜细胞成骨分化中的调控作用

目的 研究p38信号通路在人牙周膜细胞成骨分化中的调控作用。 方法 体外培养人牙周膜细胞,取第三代细胞进行成骨诱导培养,实验组加入p38信号通路抑制剂(SB203580),诱导培养4周后通过定量PCR和茜素红染色检测其成骨能力。 结果 成骨诱导可促进牙周膜细胞中p38的磷酸化（p-p38）。抑制p38的磷酸化可降低成骨标记物Runx相关基因（Runx2）、碱性磷酸酶（ALP）、骨桥蛋白（OPN）和骨钙素（OCN）的表达,减少钙结节形成。 结论 p38信号通路在体外培养的牙周膜细胞成骨分化中具有重要的调控作用。     

细胞外信号调节激酶1/2信号转导通路调控牙周膜细胞成骨分化的研究

目的：探索细胞外信号调节激酶（ERK）1/2信号转导通路是否参与调控牙周膜细胞的成骨分化。方法???取体外培养的第3代牙周膜细胞进行研究。实验分为空白对照组、成骨诱导组和实验组（在成骨诱导培养基中加入10?nmol·L－1?ERK1/2磷酸化的抑制剂PD98059）。培养1周和3周后通过定量聚合酶链反应（qPCR）、碱性磷酸酶（ALP）染色和茜素红染色检测其成骨能力。结果?成骨诱导可促进牙周膜细胞中ERK1/2的磷酸化。培养1周后,抑制ERK1/2的磷酸化可上调成骨标志物Runx2、ALP和骨钙蛋白（OCN）的表达,与成骨诱导组相比较,OCN的表达差异具有统计学意义（P<0.05）,Runx2、ALP的表达差异也具有统计学意义（P<0.01）。培养3周后,实验组牙周膜细胞成骨标志物Runx2、ALP和OCN的表达仍较成骨诱导组高,ALP染色和钙结节形成较成骨诱导组强,其中Runx2、ALP的表达差异具有统计学意义（P<0.05）,OCN的表达差异也具有统计学意义（P<0.01）。结论 ERK?1/2信号转导通路参与了调控体外培养的牙周膜细胞的成骨分化。     

Effect of prostaglandin E2 on recombinant human bone morphogenetic protein-2-stimulated osteoblastic differentiation in human periodontal ligament cells

Recombinant human (rh) bone morphogenetic protein-2 (BMP-2) stimulates osteoblastic differentiation in cells isolated from human periodontal ligament (HPLC), and this action of rhBMP-2 may be modulated by prostaglandins (PGs), which are local regulatory factors in the bone metabolism. In the present study, we investigated the effect of prostaglandin E2 (PGE2) on rhBMP-2-stimulated osteoblastic differentiation in cultured HPLC. rhBMP-2 (500 ng/ml)-stimulated alkaline phosphatase (ALPase) activity was enhanced by simultaneous treatment with low concentrations (10(-10)-10(-8) M) of PGE2, whereas a high concentration (10(-6) M) of PGE2 suppressed it. rhBMP-2 did not induce cyclo-oxygenase-2 (COX-2) mRNA expression or subsequent PGE2 production, whereas it remarkably suppressed rhIL-1 beta-induced COX-2 mRNA expression and PGE2 production. The rhBMP-2 action on osteoblastic differentiation in HPLC was also enhanced by co-treatment with 0.25 to 25 ng/ml of rh interleukin-1 beta (IL-1 beta). The ALPase activity stimulated by simultaneous treatment with rhBMP-2 and rhIL-1 beta was partially inhibited by addition of 10(-6) M of indomethacin, which completely inhibited rhIL-1 beta-induced PGE2 production. These results reveal that PGE2 at different concentrations exerts a biphasic effect on BMP-2-stimulated osteoblastic differentiation in HPLC, BMP-2 inhibits IL-1 beta-induced PGE2 production through suppressing COX-2 expression, and the BMP-2-stimulated osteoblastic differentiation may be enhanced by the endogenous PGE2 induced by BMP-2 and IL-1 beta. These suggest that BMP-2 action on osteoblastic differentiation in HPLC may be modulated by PGE2 in autocrine and paracrine fashions.     

Overexpression of bcl-2 protein inhibits terminal differentiation of oral keratinocytes in vitro

Harada H, Mitsuyasu T, Seta Y. Maruoka Y, Toyoshima K, Yasumoto S: Overexpression of bcl-2 protein inhibits terminal differentiation of oral keratinocytes in vitro. J Oral Pathol Med 1998; 27: 11–7. © Munksgaard, 1998.
The bcl-2 proto-oncogene is a known inhibitor of apoptosis; in normal human stratified squamous epithelium, its expression is restricted to the basal cell layer. To investigate the functional role of bcl-2 protein in the process of differentiation of oral keratinocytes, bcl-2 expression vector was transfected into SCC-25 cells, which normally undergo squamous cell differentiation in vitro while expressing specific differentiation markers, e.g., keratin 10/11 and involucrin. In bcl-2 transfected SCC-25 cells, the expression of these differentiation markers was markedly suppressed. The bcl-2 proto-oncogene may play a critical role in opposing the commitment to terminal differentiation and apoptosis of oral keratinocytes.     

TiO2纳米管负载BMP-2指节肽对骨髓间充质干细胞增殖与分化的影响

目的 检测负载骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic protein 2, BMP-2)指节肽的二氧化钛(TiO2)纳米管复合结构对骨髓间充质干细胞增殖与成骨分化的影响.方法 通过阳极氧化法在钛片表面制备TiO2纳米管阵列.全骨髓差速贴壁法分离培养Wistar大鼠骨髓间充质干细胞.实验组负载BMP-2指节肽TiO2纳米管;对照组只采用TiO2纳米管.2组纳米管钛片接种间充质干细胞培养,测定细胞增殖、碱性磷酸酶活性、骨钙素(osteocalcin,OCN)及骨桥蛋白(osteopontin,OPN)RNA表达,并进行统计学分析.结果 2组细胞培养1、3、5天,细胞增殖实验组>对照组(P<0.05);2组细胞培养7、10、15天,碱性磷酸酶活性实验组>对照组(P<0.01);2组细胞培养21天后,骨钙素和骨桥蛋白的差异倍数(fold change)显示为实验组>对照组.结论 TiO2纳米管负载BMP-2指节肽对骨髓间充质干细胞增殖和早期成骨分化的促进作用强于单纯TiO2纳米管结构.     

低氧对C2C12细胞分化不同阶段自噬和肌细胞生成素表达的影响

目的:研究低氧对C2C12细胞分化不同阶段自噬相关蛋白Beclin1、微管相关蛋白轻链3(microtubule-associated protein light chain 3,LC3B)和肌细胞生成素(myogenin)表达的影响。方法:C2C12细胞诱导分化1、2、3、4 d,在常氧和低氧状态下观察细胞分化情况。免疫细胞化学染色法检测自噬相关蛋白LC3B和Beclin1的表达。Western blot检测Beclin1、LC3B和myogenin的蛋白表达水平,采用SPSS 22.0软件对数据进行统计学分析。结果:1.与常氧组比较,低氧组分化形成的肌管数量较少,形态细小;2.免疫细胞化学染色结果显示,分化1、2、3、4 d低氧组细胞LC3B和Beclin1荧光强度均低于常氧组;3.Western blot结果显示分化前中期低氧组Beclin1、LC3B和myogenin蛋白表达水平显著低于常氧组(P<0.05)。随着分化时间的增加,低氧状态下LC3B的表达水平进一步降低,而myogenin表达水平回升。结论:低氧抑制C2C12细胞分化;低氧能降低细胞分化前中期Beclin1、LC3B和myogenin蛋白表达水平。     

Toll样受体2和4在细胞成骨向分化中的作用

Toll样受体（TLR）4是人类发现的第一个TLR相关蛋白质,主要介导格兰阴性细菌的免疫过程。TLR2具有相对广泛的配体特异性,可识别多种病原体相关分子模式,协助TLR4参与人体内对脂多糖的反应。研究显示, TLR2和TLR4参与多种细胞成骨向分化的调控。譬如TLR2和TLR4即可通过促进主动脉瓣间质细胞的成骨向分化参与主动脉瓣钙化过程,也可通过上调冠状动脉内皮细胞中骨形态发生蛋白2的表达参与冠状动脉粥样硬化,还可参与骨髓间质干细胞的成骨向分化。在牙髓组织中,有TLR4表达的成牙本质细胞样细胞可向成牙本质细胞受损处迁移并形成修复性牙本质;而TLR2和TLR4作为参与牙髓防御反应的成员,在牙髓组织受损时,不仅可调节炎症因子的表达,还参与牙髓细胞成牙本质向分化的调控。由此可见,TLR2和TLR4在细胞成骨向分化中的作用机制值得进一步的探讨。     

Minichromosome maintenance 2 expression is correlated with mode of invasion and prognosis in oral squamous cell carcinomas

BACKGROUND: This study examined the immunohistochemical expression of cell-cycle related molecules as well as cell proliferation and pathologic findings in oral squamous cell carcinoma (SCC) in order to clarify their pathobiologic and prognostic significance. METHODS: A total of 46 oral SCC specimens were analyzed using Ki-67, minichromosome maintenance 2 (MCM2), p53, p27, p21, and TUNEL. Aspects including tumor differentiation, mode of carcinoma invasion, tumor metastasis, and patient prognosis were compared among the specimens. RESULTS: A significantly higher MCM2 labeling index (LI) was observed in the moderately differentiated SCCs when compared to the well-differentiated SCCs (P<0.05). The higher MCM2 LI was correlated with mode of invasion Grade 4 (infiltrative growth) and patient prognosis. In contrast, the LIs of Ki-67, TUNEL-signal, p53, p27, and p21 were not correlated with patient prognosis. CONCLUSION: Higher MCM2 LI provides useful information for patient prognosis in oral SCCs.     

柚皮苷协同骨形态发生蛋白-2促进小鼠成骨细胞MC3T3-E1增殖和分化的研究

目的 研究柚皮苷（NAR）联合骨形态发生蛋白（BMP）-2对体外培养的成骨前体细胞MC3T3-E1增殖、碱性磷酸酶（ALP）活性及成骨相关基因ALP、骨钙素（OCN）、成骨特异性转录因子（Runx2）、Ⅰ型胶原（ColⅠ）表达的影响。方法 以成骨细胞株MC3T3-E1为体外药效的试验模型,通过Alamar blue法检测第1、4和7天3种不同浓度NAR（10、100和1 000 μmol·L^-1）单独作用以及分别与50 ng·mL^-1 BMP-2联合诱导对MC3T3-E1细胞增殖能力的影响。同时在第4天和7天测定成骨细胞内ALP活性,采用实时定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测成骨相关基因ALP、OCN、Runx2、ColⅠ的表达。结果 单纯NAR刺激及联合BMP-2刺激能够促进细胞增殖,在NAR浓度为100 μmol·L^-1时达到高峰（P<0.05）,且该浓度NAR与BMP-2联合作用时增殖效果大于两者单独作用（P<0.05）。单纯NAR刺激及联合BMP-2刺激4 d和7 d时均能促进细胞ALP活性,100 μmol·L^-1 NAR与BMP-2联合作用时ALP活性最强（P<0.05）。100~1 000 μmol·L^-1的NAR单独及联合作用在不同程度上能促进ALP、OCN、Runx2、ColⅠ成骨相关基因表达。结论 NAR能有效促进成骨细胞株MC3T3-E1增殖、分化,且适宜浓度的NAR和BMP-2有协同和促进作用。     

Erk1/2信号通路在上颌突间充质细胞成骨分化中的调控作用

目的:研究Erk1/2信号通路在体外培养的上颌突间充质细胞成骨分化中的调控作用。方法:体外培养胚胎13.5 d(E13.5)的小鼠上颌突间充质细胞,取第二代细胞进行成骨诱导,实验组加入Erk1/2信号通路抑制剂PD98059,诱导培养7 d后通过免疫荧光、茜素红染色和定量PCR检测其成骨能力。结果:E13.5小鼠的上颌突间充质细胞能在体外成功培养和传代。成骨诱导可促进Erk1/2的磷酸化(pErk1/2)。抑制Erk1/2的磷酸化可降低成骨标记物ALP、Runx2和OCN的表达,减少钙结节形成。结论:Erk1/2信号通路在体外培养的上颌突间充质细胞的成骨分化中具有重要的调控作用。