猴D型逆转录病毒p27基因的原核表达及流式免疫荧光微球检测技术的建立

目的构建猴D型逆转录病毒的p27蛋白,并建立流式免疫荧光微球检测技术用于猴D型逆转录病毒的检测。方法通过PCR扩增p27基因片段,与p GEX-4T-1表达载体进行连接,转化至BL21(DE3)进行表达。通过SDS-PAGE分析蛋白表达的形式及最佳诱导时间。采取GST树脂纯化目标蛋白,包被磁珠,建立流式免疫荧光微球检测技术,用于临床样本的检测。结果重组蛋白以可溶的上清液进行表达,诱导的最佳时间为4 h。包被磁珠后,成功建立流式免疫荧光微球检测技术,对阳性血清稀释81倍仍可检测为阳性,对猴类其他病原的阳性血清无交叉反应,特异性强,与ELISA法同时对24份临床样本进行检测,其中3份样品的流式免疫荧光微球检测结果为阳性,ELISA检测结果为2份阳性,1份阴性,两种方法的检测结果符合率为96%。结论成功表达猴D型逆转录病毒p27蛋白,并运用该蛋白建立了灵敏度高,特异性强,样本需求少的流式免疫荧光微球检测技术,为后续推广应用多重流式免疫荧光微球检测技术奠定了基础。     

p27基因及其蛋白在大肠癌的表达及其意义

目的　研究 p2 7mRNA和p2 7蛋白在大肠癌的表达及其临床意义。方法　应用原位杂交方法检测 58例大肠癌标本及 58例正常黏膜中p2 7mRNA的表达 ,应用免疫组织化学S P法检测相同组织中 p2 7蛋白的表达。 结果　p2 7mRNA在大肠癌及正常黏膜中的表达阳性率均为 1 0 0 %。p2 7蛋白在大肠癌中的表达阳性率为 55 1 7% (32 / 58) ,在正常组织中的表达阳性率为 96 55 % (56/ 58) ,差异有显著性(P <0 0 1 )。p2 7蛋白表达与肿瘤组织分化程度负相关 ,与其它临床病理因素无关。结论　p2 7蛋白表达的调控主要在转录后水平。p2 7蛋白表达在大肠癌发生过程中具有重要作用 ,其检测有助于大肠癌恶性程度评价和预后判断     

猴免疫缺陷病毒衣壳蛋白p27在大肠杆菌中的表达及纯化

目的获得用于SIV检测的衣壳蛋白p27重组抗原。方法利用生物信息学软件选择衣壳蛋白p27抗原表位集中的区域,合成SIV p27基因;将该基因与pMAL-p5x载体连接构建pMAL-p5x-p27重组质粒,并转化大肠杆菌BL21中,诱导表达;用Amylose Resin亲和层析柱对表达产物进行纯化。结果 SDS-PAGE分析显示,pMAL-p5x-p27重组质粒可在大肠杆菌中高效表达,表达产物分子量约为70×103;经纯化获得目的蛋白p27纯度可达90%。结论本研究利用原核表达系统成功表达了SIV p27蛋白,为SIV检测方法的建立奠定了基础。     

卵巢上皮癌中p16和p27基因的表达及其临床意义

目的：研究p16,p27基因在卵巢上皮性恶性肿瘤中的表达及其临床意义．方法：用免疫组织化学方法检测18例卵巢正常组织、20例卵巢良性肿瘤及38例卵巢癌组织中p16,p27基因的表达情况,并与临床特征相比较．结果：P16蛋白在卵巢上皮性恶、良性肿瘤和正常组织中的阳性表达率分别为39％,70％和83％;P27蛋白在卵巢上皮性恶、良性肿瘤和正常组织中阳性表达率分别为32％,65％和78％,P16和P27蛋白在卵巢上皮性恶性肿瘤中的表达明显低于卵巢正常组织和卵巢良性肿瘤．在细胞分化程度Ⅰ级的肿瘤中,P16和P27蛋白表达阳性率明显高于分化程度Ⅱ级和Ⅲ级的肿瘤（P〈0．01）;在临床分期早期的肿瘤中,P16和P27蛋白的表达率明显高于临床分期晚期的肿瘤（P〈0．01）．不伴淋巴转移的P16和P27蛋白的表达率明显高于有淋巴转移的蛋白的表达率（P〈0．01）．结论：p16,p27基因的表达与卵巢上皮性恶性肿瘤的细胞分化程度、临床分期及有无淋巴转移密切相关．临床检测卵巢上皮性肿瘤P16和P27蛋白的表达,可以作为判断卵巢上皮性恶性肿瘤生物学行为及患者预后的参考指标．     

胃肠道间质瘤中p27和细胞周期素D1蛋白的表达及临床意义

目的研究p27和细胞周期素D1蛋白在胃肠道间质瘤中的表达及其与间质瘤临床病理特征的关系。方法收集48例手术切除的胃肠道间质瘤标本,同时取距瘤灶>5cm的正常组织,应用免疫组织化学SP法检测肿瘤组织及正常组织中p27和细胞周期素D1蛋白的表达。结果48例胃肠道间质瘤中p27和细胞周期素D1蛋白阳性表达率分别为54.16%和58.33%。p27蛋白的低表达与间质瘤的分化程度呈负相关(P<0.01),与间质瘤复发呈负相关(P<0.01)。p27和细胞周期素D1蛋白在胃肠道间质瘤的表达呈正相关(r=0.573,P<0.01)。结论p27和细胞周期素D1蛋白与胃肠道间质瘤的发生、发展有关,检测p27和细胞周期素D1蛋白可作为评估恶性程度和判断预后的重要指标。     

慢性粒细胞白血病MGMT基因的克隆及逆转录病毒表达载体的构建

目的：从慢性粒细胞白血病病人外周血中克隆人MGMT基因，并进行逆转录病毒表达载体的构建。方法：用RT－PCR方法从慢性粒细胞白血病病人外周血白细胞中克隆得到长为684bp MGMTcDNA。将该片段与pGEM-T载体连接，转化大肠杆菌DH5后得到重组质粒pGEM-T-MGMT，进行限制性内切酶酶切分析、PCR及测序鉴定。再将MGMTcDNA亚克隆到GlNa逆转录病毒载体EcoRI和xhoI位点之间，并进行酶切、PCR鉴定。结果：成功克隆了人MGMT基因，经酶切分析、PCR初步筛选及测序鉴定证实序列正确，并成功构建到逆转录病毒载体上。结论：通过克隆人MGMT基因，并构建逆转录病毒载体GlNa-MGMT，为探讨将耐药基因导入造血干细胞对烷化剂类化疗药物抗性的研究奠定了基础。     

猴D型逆转录病毒血清抗体检测方法的比较研究

本文比较了酶联免疫吸附试验(ELISA)、间接免疫荧光试验(IFA)、斑点酶免疫试验(DEIA)3种方法检测猕猴SRV抗体的情况。结果表明,DEIA的阳性检出率最高,IFA的阳性检出率最低。比较了3种方法的优缺点:ELISA的敏感性比DEIA低,但特异性明显高于DEIA,ELISA完成一个样品的检测所用酶结合物的量和所费时间都比DEIA少。IFA的特异性比ELISA高,但结果判断不易掌握,需经过专门训练的人员操作。因此,本中心以ELISA和IFA作为猴群的常规监测方法,先以ELISA进行初检,视结果情况作IFA复检。     

胃癌p27蛋白表达及其意义

目的 研究p27蛋白表达与胃癌发生、发展、组织学类型及浸润转移的关系.方法 采用免疫组化S-P法分别检测胃癌及正常胃粘膜中p27蛋白表达.结果 p27在胃癌中高表达31%(20/64),与正常胃粘膜组织100%(10/10)相比有显著差异(P＜0.05).p27阳性表达与淋巴结转移、浸润深度及临床分期有关(P＜0.05).结论 ①p27在胃癌的发生、发展中起重要的抑制作用.②p27蛋白低表达的胃癌更易发生淋巴结转移及肌层浸润.     

外源性p27kip1基因表达对人肝癌细胞生长抑制作用

目的: 研究p27kip1基因对人肝癌细胞的生长抑制作用. 方法: 采用可诱导性真核表达载体pMD-kip1,脂质体转染法将p27kip1全长cDNA转入肝癌细胞系HCC-9204中,通过外加Zn离子诱导目的基因的表达. 免疫印迹分析及RT-PCR检测p27kip1基因在蛋白质和mRNA水平上的表达;细胞活力实验检测转染p27kip1基因对细胞增殖的作用;并将转染的肝癌细胞接种于裸鼠皮下,观察该肿瘤细胞的致瘤情况. 结果: 转染p27kip1的HCC-9204细胞在mRNA和蛋白质水平均显p27kip1高表达. 细胞活力检测显示在外加Zn离子48 h后,细胞生长被抑制35%;转染p27kip1的HCC-9204细胞在裸鼠体内的致瘤能力明显下降[(0.62±0.12) vs (1.31±0.17), P<0.01 )]. 结论: 外源性p27kip1基因表达能够抑制人肝癌细胞的恶性增殖和致瘤性.     

p57Kip2和p27Kip1基因mRNA在胃癌组织中的表达及意义

目的:研究细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子p57Kip2和p27Kip1基因mRNA在胃癌组织中的表达及意义.方法:采用RT-PCR技术,分别检测p57Kip2和p27Kip1基因mRNA在108例胃癌组织及60例癌旁组织中的表达.结果:p57Kip2基因mRNA在胃癌组织中阳性表达率为28.70%,显著低于癌旁组织中的阳性表达率56.67%(P＜0.05),p57Kip2基因mRNA相对含量检测胃癌组织为0.59±0.17,显著低于癌旁组织1.63±0.21(P＜0.05);p27Kip1基因mRA在胃癌组织中阳性表达率为23.15%,低于癌旁组织中的阳性表达率31.67%(P＞0.05),p27Kip1基因mRNA相对含量检测胃癌组织为1.53±0.23,稍高于癌旁组织1.46±0.35(P＞0.05).结论:胃癌组织中p57Kip2和p27Kip1基因蛋白表达的降低与转录机制有关,并在胃癌的发生中存在不同的抑癌途径或不同的调控机制.     

人突变p27重组腺病毒的构建及其在结肠癌细胞SW480中的表达

目的 :为了探讨腺病毒载体用于基因治疗的可行性及突变 p2 7的抗肿瘤特性 ,构建复制缺陷型重组hp2 7mt基因腺病毒。 方法 :hp2 7mt自载体pORF9-hp2 7mt中切出 ,经 2次亚克隆 ,插入到穿梭质粒 pShuttle -CMV中 ,形成转移质粒 pShuttle -CMV -hp2 7mt;然后再用PmeI线性化的 pShuttle -CMV -hp2 7mt转化含腺病毒骨架质粒 pAdeasy - 1的超感受态BJ5 183,使其在细菌内发生同源重组。重组质粒鉴定正确后经PacⅠ酶切 ,转入Ad2 93细胞 ,包装成重组腺病毒Ad -hp2 7mt。采用PCR方法对重组腺病毒进行鉴定 ,用紫外分光光度计进行滴度测定。用重组 p2 7mt的腺病毒Ad - p2 7mt感染大肠癌细胞SW 4 80 ,WesternBlot检测p2 7蛋白的表达。结果 :用含pShuttle -CMV -hp2 7mt转化含 pAdeasy - 1的超感受态BJ5 183后 ,可获得约 30 %的阳性重组质粒。PCR检测表明重组腺病毒DNA中含有目的基因。重组腺病毒滴度为 7.95× 10 15pfu/L。转染大肠癌细胞后 ,p2 7在SW4 80中获得了高表达 ,而未转染细胞和Ad -LacZ转染的细胞中仅有低表达。结论 :腺病毒作为一种基因转移载体 ,可有效介导 p2 7在肿瘤细胞中的表达 ,在肿瘤基因治疗方面具有很大的应用前景。     

抑癌基因p27对肾癌细胞系GRC-1生长的抑制作用

目的：探讨p27基因对肾癌GRC－1细胞系生长的抑制作用,为肾癌发生机制的研究和基因治疗提供理论依据。方法 采用基因转染技术,将p27 cDNA转染到肾癌GRC－1细胞系中,了解其对细胞增殖能力及细胞周期的影响。结果 转染p27基因的肾癌细胞生长受到抑制,其在软琼脂上克隆形成能力降低了大约4倍。对细胞周期分析表明,处在G0－G1期的细胞由32．2％增加到66．9％,经Dot blot和Western blot杂交证实,p27 mRNA表达有明显差异（P＜0．01）,p27的蛋白表达量有明显差异（P＜0．01）,说明p27蛋白具有生长抑制功能,其作用点为G1－S。结论 提高肾癌细胞中p27的表达,能抑制肿瘤细胞的生长,导入p27基因是一种治疗肾癌的新途径。     

P27基因在结直肠癌中的表达及其临床意义

目的 对结直肠癌组织进行p27基因表达的检测,探讨其与临床病理特征的关系.方法 对106例结直肠癌组织及各自的正常大肠黏膜组织应用免疫组织化学SP法进行检测.结果 p27在正常大肠黏膜组织中的表达率为100%（106/106）,而在结直肠癌组织中的高表达率为57.5%（61/106）;Dukes分期A＋B、C＋D高表达率分别为764%（42/55）和37.3%（19/51）;低分化、高中分化高表达率分别为24.0%（6/25）和67.9%（55/81）;有无淋巴结转移的高表达率分别为26.8%（11/14）和76.9%（50/65）.结果 表明,p27基因在组织中的表达差异有统计学意义（均P〈0.05）,p27基因的低表达与结直肠癌的临床分期、组织分化程度和有无转移等临床病理因素有显著相关（均P〈0.05）,而与患者性别、年龄、肿瘤部位及大小等无统计学意义（均P〉0.05）.结论 p27基因表达与结直肠癌的生物学行为和预后有关,可作为结直肠癌预后判断有利的参考依据.     

人硫氧还蛋白基因克隆及其重组逆转录病毒载体的构建和鉴定

目的 克隆人硫氧还蛋白（hTRX）基因,并构建含有该目的 基因的重组逆转录病毒载体。方法 利用RT-PCR法,以PHA活化的人外周血单个核细胞总RNA为模板,扩增hTRX编码蛋白的cDNA基因,并亚克隆至逆转录病毒载体pSIV-1中进行PCR、双酶切和测序鉴定。结果 将所得的序列与GenBank（BC003377）报道的序列比较,其酶活性中心（Trp-Cys-Gly-Pro-Cys）与已知序列一致,第132、136、170、264位碱基与已知序列不同,其中第136、170位相应密码子编码的氨基酸发生了变化（Phe→Leu,Ile→Thr）,成功获得了pSIV-1-hTRX重组逆转录病毒载体。结论 hTRX基因的克隆及其重组逆转录病毒载体pSIV-1-hTRX的构建,为进一步探讨hTRX的生物学活性和应用奠定了基础。     

野生型p53基因对白血病K562细胞的增殖抑制作用

目的:建立携野生型p53基因的K562细胞株,研究该细胞内野生型p53基因的表达并观察其生物学特性。方法:构建重组人p53逆转录病毒载体,导入PA317细胞中进行包装,经过病毒滴度测定,筛选高滴度的产病毒细胞克隆。收集培养上清液中的重组人p53逆转录病毒颗粒,感染K562靶细胞,建立携野生型p53基因的K562细胞株。观察该细胞株的生长方式、形态学和生长速度。SP免疫组化染色法检测p53蛋白表达。进一步用流式细胞仪检测p53蛋白表达率和细胞周期变化;双层软琼脂培养实验检测细胞的增殖潜能改变。以pBabe空载体同时实验,作为各阶段的对照。结果:成功地构建了重组逆转录病毒载体pBabe/p53;获得逆转录病毒生产PA317/p53细胞系,最高病毒滴度为4.64×105CFU/m l;获稳定表达p53基因的K562/p53靶细胞,免疫组化结果证实该细胞内有野生型P53蛋白表达,流式细胞仪检测到野生型P53蛋白表达率为1.32%;与对照K562/pBabe细胞比较,K562/p53靶细胞的生长速度下降;软琼脂集落生成的下降率为27.14±4.49%(P<0.05);增殖指数下降,S期比例下降(P均<0.01)。结论:制备了携p53基因的高滴度逆转录病毒,建立携野生型p53基因的K562/p53细胞株,证实表达的野生型p53蛋白对该细胞有抑制作用。     

含野生型p53cDNA重组逆转录病毒的制备

目的：制备野生型p53cDNA重组体的复制缺陷型逆转录病毒。方法：设计引物PCR扩增野生型p53cDNA，用T－A克隆的方法克隆入质粒载体pGEM-T,转化JM109，提取pGEM-T/p53重组体，双酶切得到野生型p53cDNA,然后再克隆人逆转录病毒表达载体pLXSN,转化感受态大肠杆菌 JM109，筛选pL(p53cDNA)SN重组体，脂质体法转染包装细胞AM12，G－418（geneticin)筛选，收集病毒液。结果：通过PCR和重组质粒酶切筛选出重组阳性克隆，收集含pL(p53cDNA)SN重组体的逆转录病毒。结论：含pL(p53cDNA)SN重组体的复制缺陷逆转录病毒可用于转染真核细胞等进一步研究。     

谷胱甘肽S－转移酶pi基因与逆转录病毒载体的重组体构建

为了在细胞水平上研究谷胱甘肽Ｓ－转移酶ｐｉ（ＧＳＴ－ｐｉ）基因的表达活性对化学致癌物诱导细胞转化作用的影响及探讨肿瘤基因预防的可能性，作为第一步，本实验构建了ＧＳＴ－ｐｉｃＤＮＡ与逆转录病毒载体ｐＸＴ_１的重组体。