体外扩增脐血间充质干细胞的生物学特性和

目的从脐血中分离单个核细胞(MNCs),体外培养扩增间充质干细胞(MSCs)并研究其生物学特性和诱导分化潜能.方法取35份足月顺产新生儿脐血,密度梯度离心法分离出其中的MNCs,采用含胎牛血清的DMEM培养基体外培养扩增MSCs.显微镜下观察MSCs的形态、细胞化学染色,流式细胞仪测定MSCs的细胞免疫表型,体外诱导分化实验检测MSCs分化成骨细胞、脂肪细胞和神经细胞的能力.结果从12份脐血中可培养出MSCs,形态上与从其他来源的MSCs类似,可传至20代而无形态上的变化.细胞化学染色示碱性磷酸酶(ALP)阴性,非特异性酯酶--α-丁酸萘酚酯酶(alpha-naphthol butyric acid esterase,NBE)阳性.其表达CD29、CD44和CD105,特别是人类MSCs标记SH-2 和 SH-3 阳性,而CD3、CD14、CD19、CD34和CD45阴性,说明它们并非来自造血细胞.这些MSCs在适当诱导分化剂的作用下,2周左右可以诱导分化形成骨细胞, 20天左右可以诱导分化形成脂肪细胞.脐血MSCs预诱导12 h后,胞体发生收缩,细胞边缘有细的突起.正式诱导5 h后大多数细胞呈现典型的神经元样.结论胎儿脐血MNCs可分离培养出MSCs.这些MSCs具有与其他来源MSCs类似的表型及分化潜能.     

黄芩苷体外诱导脐血间充质干细胞向神经元样细胞分化的实验研究

目的探讨中药黄芩苷体外诱导人脐血间充质干细胞(MSCs)向神经元样细胞分化的可行性及其可能的机制。方法采集健康孕妇足月顺产儿的脐带血,共5人份,以肝素抗凝,采用明胶沉降加密度梯度离心两步法分离脐血单个核细胞,加入含黄芩苷50μmol/L的液体培养体系中进行扩增培养。取黄芩苷体外扩增2周的人脐血MSCs,采用黄芩苷诱导24h后,继续维持诱导6d,诱导30min后开始在倒置显微镜下动态观察脐血MSCs生长情况及诱导前后形态学变化。免疫细胞化学染色评价神经细胞特异性烯醇化酶(NSE),微管相关蛋白2(MAP-2)阳性细胞的表达。诱导液(DMEM培养基,200~400μmol/L黄芩苷),37℃,5%CO2诱导24h。维持诱导液(DMEM培养基,200~400μmol/L黄芩苷,B27)继续维持诱导1周。实验共分4组,分别为诱导组;对照1组(诱导液和维持液均不含黄芩苷)、对照2组(诱导液和维持液含3mmol/L的β-巯基乙醇,不含黄芩苷)、对照3组(诱导液和维持液含20g/L二甲基亚砜和20mmol/L丁化羟基苯甲醚,不含黄芩苷)、对照4组(诱导液和维持液均含有上述浓度的黄芩苷、β-巯基乙醇、二甲基亚砜和丁化羟基苯甲醚),各组分别在诱导6h、24h、7d留取标本,制作细胞爬片,细胞固定后,免疫细胞化学染色评价NSE和MAP-2阳性细胞的表达率;Hoechest33258染色,评价细胞存活率。结果诱导组诱导6h后,细胞微丝收缩,原来梭形的脐血MSCs胞体已发生收缩,细胞边缘变得不规整,出现了细的突起。7d后多数细胞成锥形,交织成网,形成较典型的神经元细胞样形态结构,免疫细胞化学染色显示黄芩苷诱导组NSE、MAP-2阳性细胞表达率以及细胞存活率分别为(76.3±9.2)%、(78.5±5.5)%、(85.3±4.8)%,显著高于对照1、2、3组(P<0.01),分别为(4.6±0.6)%、(0.7±0.6)%、(46.7±9.2)%;(63.3±6.8)%、(40.9±5.1)%、(66.5±5.2)%和(71.6±4.7)%、(42.3±4.5)%、(72.8±7.6)%。此外,各组胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达率均低于1%。结论低浓度的黄芩苷体外扩增2周后的MSCs中已有少量表达NSE的阳性细胞出现,这在一定程度上黄芩苷起到了预诱导分化作用;黄芩苷能够体外诱导脐血MSCs分化为神经元样细胞,诱导过程中黄芩苷的诱导作用温和、稳定而持久;诱导出的神经元样细胞成活时间长,其诱导机制可能与黄芩苷的抗氧化、调控细胞NF-κB的活性从而刺激多种细胞因子的表达和生成有关。     

脐血造血干细胞的体外扩增

脐血（ＣＢ）已经成为一个重要的干细胞来源,以其采集方便、干细胞含量丰．富、移植物抗宿主病发生率低受到欢迎。但因ＣＢ中有核细胞、 ＣＤ３４＋细胞绝对数较低,所以不能广泛应用于成人及体重较重的患者。将ＣＢ的造血干细胞体外诱导扩增可以解决ＣＢ量不足的问题。本文就ＣＢ造血干细胞体外扩增的条件、扩增后造血重建能力检测及其临床应用做一综述。     

丹参诱导人脐血间充质干细胞分化为神经样细胞

目的探讨丹参注射液对人脐血单个核细胞来源的间充质干细胞(MSCs)向神经细胞分化的诱导作用。方法利用FACScan流式细胞仪检测MSCs表面抗原CD29、CD44、CD59、CD33,用丹参注射液诱导人脐血原代细胞和脐血来源的间充质干细胞向神经细胞方向分化,并与神经生长因子(NGF)和神经常苷脂(GM1)的诱导作用比较,用免疫细胞化学方法对分化和未分化细胞进行鉴定。结果人脐血原代细胞中MSCs的表耐标记CD29、CD44、CD59阳性率分别为10.7%、37.27%和66.67%,而造血细胞的表面标记CD33阳性率仅为0.33%。人脐血传代细胞(第5代)MSCs的表面标记CD29、CD44、CD59的阳性率分别为40.2%、70.5%和95.4%。原代培养的贴壁细胞形态呈大小不等圆形和条形,用丹参诱导可表达神经细胞的标记。传代培养的间充质干细胞,可维持在未分化状态稳定增殖。用丹参可诱导这种细胞向神经样细胞分化,表达神经干细胞标记nestin,神经元的标记β-Ⅲ类神经微管(β-TubulinⅢ)、神经微丝(NF)和神经胶质细胞的标记胶质纤维酸性蛋白(GFAP)。与NGF和GMI的诱导作用比较,细胞形态类似,表达相同的神经细胞标记,丹参的诱导速度较快,诱导后细胞表达神经元标记的比例较高。结论人脐血是MSCs的来源之一,丹参可诱导人脐血干细胞分化为神经样细胞,丹参可作为神经诱导剂,人脐血干细胞可作为神经干细胞的来源。     

人脐血及脐带间充质干细胞的分离培养及表面标记分析

目的探讨从人脐带血及脐带分离和培养间充质干细胞(MSCs)的方法,并分析MSCs的表面标记。方法人脐带血按常规方法制备单个核细胞,利用MSCs贴壁生长的特性,经培养、换液、传代纯化MSCs;分离脐带华尔通胶(Wharton’s jelly),采用组织块贴壁法获得脐带MSCs并传代。将传代的MSCs冻存,1个月后再复苏,观察复苏后MSCs的生长情况。利用FACScan流式细胞仪检测脐带血及脐带细胞表面抗原。结果经过传代后,贴壁细胞形态趋于同一。人脐血及脐带MSCs体外生长形态相似,类似成纤维细胞,可以稳定增殖和传代。经冷冻保存,复苏后仍能较好生长。人脐血及脐带来源的MSCs表面标记CD29、CD44、CD59高表达,而表面标记CD14、CD33、CD34和CD45低表达。结论人脐带血及脐带均可分离出MSCs,在体外能扩增纯化及冻存复苏,为组织工程提供丰富的细胞来源。     

人脐带血间充质干细胞体外诱导分化为神经元样细胞的可行性

目的探讨人脐带血来源间充质干细胞(MSCs)在体外诱导分化为神经元样细胞的可行性及条件。方法采用Fi- coll-Paque(1.077 g/mL)分离液密度梯度分离人脐带血中MSCs,体外扩增纯化后,二甲基亚砜、巯基乙醇及丁羟茴醚等试剂诱导其向神经细胞分化,显微镜下观察,细胞免疫化学法鉴定。结果诱导后脐血MSCs具有典型神经元形态细胞,免疫细胞化学显示神经丝蛋白(NF-M)染色呈强阳性,占(81．86±4．06)％;Nestin染色呈阳性细胞占(39．99±4．60)％;GFAP染色阴性。结论人脐带血MSCs在体外培养及诱导条件下可定向分化为神经元样细胞。     

脐血干细胞移植的移植物抗宿主病

脐血来源广泛，并含有丰富的造血干祖细胞，是骨髓良好的替代品。脐血移植已成为先天性造血系统发育不良、白血病等多种疾病的一种重要治疗手段。脐血移植的一个主要特点是移植物杭宿主病轻。移植物抗宿主病的核心是细胞因子风暴。细胞因子风暴的强度及持续时间与宿主和供体细胞产生细胞固子的能力，以及细胞因子刺激下供体细胞分裂、增殖能力的大小有关。     

65例中国非亲缘性脐血造血干细胞移植的回顾研究

目的1998—2004年,广州脐血库向国内25家移植中心提供非亲缘性脐血治疗恶性及非恶性肿瘤性疾病患者65例,对其进行回顾性分析,探讨与非亲缘性脐血移植密切相关的影响因素。方法脐带血均采自广州市妇婴医院正常分娩的足月顺产产妇,脐血分离、冻存、复温方法参照纽约脐血库的标准及相关文献;选择脐血的依据是HLA相合程度及有核细胞数量。结果65例接受非亲缘性脐血移植的病例中,白血病49例,遗传缺陷性疾病16例;男性42例,女性23例;受者中位年龄10岁(1~33岁);中位体重27kg(10~67kg);HLA-A、B,DRB1匹配全相合9例,1个位点不合43例,2个位点不合13例;总有核细胞(TNC)中位输入量5.7×107/kg[(1.84~20.00)×107/kg]。移植后植入50例有核细胞总数(ANC>500/μl),植入的中位时间为17.5d(7~44d),植入率77%;41例受体发生GVHD,发生率为63%。30例长期存活(无病生存时间>365d),无病存活率为61%。结论非亲缘性脐血移植具有良好的临床应用前景。     

骨髓间充质干细胞移植改善心肌病大鼠心功能相关基因的初步筛选

目的 筛选骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells MSCs）移植改善心肌病大鼠心功能的相关基因,初步分析相关基因在MSCs改善心功能中的作用。方法 用贴壁筛选法分离、扩增大鼠MSCs,并移植入经阿霉素腹腔注射构建的大鼠心肌病模型中。然后利用抑制性消减杂交技术（supression subtractive hybridization,SSH）筛选移植MSCs后大鼠心肌组织差异表达的相关基因,并进行分析。结果 成功建立了心肌病大鼠模型,并进行了MSCs心肌移植,筛选出移植MSCs后心肌细胞表达上调的基因12条、表达下调的基因4条。经基因的序列检索分析显示,MSCs移植入大鼠心肌后与线粒体合成有关的基因和与心肌的收缩蛋白合成有关的基因表达上调;表达下调的基因分别为肌小节的线粒体肌氨酸激酶基因;核糖体的磷蛋白P2基因;α-晶状体蛋白基因;NADH-辅酶Q氧化还原酶Fe—S蛋白7基因。结论 MSCs移植后可能通过刺激与能量合成相关和心肌收缩相关基因的表达,一方面促进心肌能量合成,另一方面MSCs可能分化为新的心肌细胞,增加心肌收缩力,从而改善心肌组织功能。     

人脐血间充质干细胞对脐血CD+34细胞体外扩增作用的研究

目的 探讨含人脐血来源的间充质干细胞(MSCs)体系在体外对脐血造血干细胞(HSCs)扩增作用。方法 (1)用含人脐血MSCs及不同造血生长因子(HGFs)组合的无血清扩增体系对人脐血CD34^ 细胞进行体外扩增。(2)于扩增前及扩增后第6、12天分别用双色流式细胞仪动态检测HSCs表面抗原标记：CD34^ 、CD34^ CD38^-、CD34^ CD3^ 、CD34^ CD19^ 、CD34^ 和CD34^ CD41^ 。细胞的含量。(3)按本实验室方法行体外半固体培养,观察扩增前后脐血细胞粒-单核细胞集落形成单位(CFU-GM)、爆式红系集落形成单位(BFU-E)、混合集落形成单位(CFU-Mix)及高增殖集落形成单位(CFU-HPP)集落形成情况。结果(1)含人脐血MSCs体系对脐血CD34^ CD38^ 细胞的扩增倍数在第6天和第12大分别为159和437倍。该业群百分比在单纯因子组扩增第12天时为1．98％,而在含脐血MSCs组为9．98%,明显高于扩增前。(2)集落培养表明,含脐血MSCs组扩增第12天与扩增第6天相比,其CFU-Mix和CFU-HPP的扩增倍数增加,而单纯因子组这两种集落的扩增倍数下降。(3)随扩增天数的增加,两组扩增体系中CD34^ CD3^ 和CD34^ CD41a^ 细胞均明显增加,而CD34^ CD19^ 和CD34^ CD3^ 细胞均明显减少。两组相比,含脐血MSCs组差异更显著。结论 (1)含脐血MSCs体系不仅能扩增更原始的造血干／祖细胞(HSPC),且具有在短期内(12d)保持HSCs不耗竭。(2)含脐血MSCs体系对脐血CD34^ 细胞向定向祖细胞的扩增,主要为髓系及巨核系祖细胞,而对其向淋巴系祖细胞的扩增具有抑制作用。     

脐血和外周血来源的巨核细胞体外扩增差异的研究

目的建立外周血(peripheral blood,PB)和脐血(cord blood,CB)来源的CD3+4细胞体外定向诱导扩增巨核细胞(megakaryocyte,MK)的最佳体系,探讨两种来源巨核细胞的扩增差异。方法以Ficoll-Hapaque分离“动员”的外周血和脐血单个核细胞,免疫磁珠分离纯化CD3+4细胞,在含胎牛血清的液体培养体系中,以不同细胞因子组合诱导两种来源的CD3+4细胞,定时进行细胞计数和流式细胞术检测培养体系中CD4+1细胞的含量;同时采用甲基纤维素半固体培养法进行巨核细胞集落培养,测定巨核细胞集落形成单位的数量。结果在血小板生成素(thrombopoietin,TPO)+胎肝酪氨酸激酶配体(FLT-3ligand,FL)+白介素6(interleukin-6,IL-6)+IL-3组合中,外周血来源的CD4+1细胞第10天扩增了131±18倍,脐血来源的CD4+1细胞在培养的第14天扩增了193±25倍,为增殖高峰。均明显高于同来源的其他3组(P<0.05),随着时间的推移两者的CD4+1细胞扩增倍数均呈下降趋势。结论TPO+FL+IL-6+IL-3组合均为CB和PB体外诱导扩增巨核细胞的最佳组合。CB来源的巨核细胞较PB来源的巨核细胞有更强的增生能力,而PB来源的CD3+4细胞产生巨核细胞的时间较CB来源的短,与临床上外周血造血干细胞移植的血小板造血重建快于脐血移植相一致。     

六个转录因子将人脐带间充质干细胞高效重编程为诱导性多能干细胞的实验研究

目的 建立人脐带间充质干细胞(HuMSCs)来源的诱导性多能干细胞(iPSC)系.方法 以慢病毒载体将OCT4、SOX2、KLF4、c-Myc、NANOG、LIN-28 6个转录因子转入HuMSCs使其重编程为iPSC.通过形态学观察、多能细胞特异性标志检测、碱性磷酸酶(AKP)染色、核型分析、拟胚体形成、体内成瘤实验鉴定获得的iPSC.结果 慢病毒感染后第4天,HuMSCs逐渐变成类圆形,第10天开始出现不规则细胞团,第14天出现较大的细胞团,约1.25％的细胞重编程为iPSC.建系后iPSC呈典型的克隆状生长,边缘清晰,内部细胞细小,排列紧密;AKP染色阳性;表达多能性相关基因及胚胎干细胞特异性蛋白;细胞核型正常(46,XY);体内外均能向3个胚层方向分化.结论 慢病毒携带OCT4、SOX2、KLF4、c-Myc、NANOG、LIN-28 6个因子能将HuMSCs高效诱导为完全重编程的iPSC.     

脐血间充质干细胞对T淋巴细胞增殖和激活影响的实验研究

目的研究脐血源间充质干细胞(UCB-MSCs)对T淋巴细胞激活和增殖的影响。方法2006—2007年广西壮族自治区人民医院从脐血中分离和培养间充质干细胞,流式细胞术检测其表面标志以鉴定纯度;用B r-du法测定细胞增殖率,观察UCB-MSCs对异体T淋巴细胞增殖的影响;流式细胞仪检测共培养体系中CD6 9细胞水平。结果从脐血获得的MSCs免疫表型分析显示,其不表达HLA-II抗原。对PHA刺激的脐带血T淋巴细胞,UCB-MSCs对其的增殖反应具有抑制作用,呈细胞数量剂量依赖性;UCB-MSCs与脐带血单个核细胞共培养体系中,CD 69细胞比例降低,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.01)。结论UCB-MSCs抑制PHA刺激的T淋巴的增殖及激活,这种抑制特性表明,UCB-MSCs对免疫反应具负调节作用,可能为GVHD的防治提供一条新途径。     

人脐带间充质干细胞的生物学特性及向神经样细胞分化的研究

目的 研究人脐带华尔通胶来源的间充质干细胞（MSCs）的特性及向神经细胞分化的可能性,为神经移植寻找新的细胞来源。方法 检测人脐带来源的MSCs的细胞表面标记;丹参和B巯基乙醇诱导人脐带来源的MSCs向神经细胞分化,用免疫细胞化学方法对分化和未分化的细胞进行鉴定;半定量逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）检测细胞的神经相关基因表达。结果 从人脐带分离、培养的贴壁细胞,体外生长形态类似于成纤维细胞,可以维持在未分化状态稳定增殖,体外增殖超过10代。这类细胞MSCs的表面标记CD29、CD44、CD59、CD105仿呈现高表达,造血细胞表面标记CD14、CD33、CD34、CD27、CD45、CD117和与移植免疫排斥相关的表面标记CD80（137—1）、CD86（B7-2）、CD40、CD40L不表达或低表达。丹参和β巯基乙醇均可诱导人脐带MSCs向神经样细胞分化,分化的细胞表达神经干细胞的标记巢蛋白（Nestin）,神经元的标记类神经微管（β-TubulinⅢ）和神经微丝（NF）,以及神经胶质细胞的标记胶质纤维酸性蛋白（GFAP）。RT-PCR检测证实,经丹参诱导后的MSCs表达神经干细胞相关基因Nestin,诱导前和诱导后的MSCs均表达神经细胞基因Pleiotrophin,诱导后的表达明显增强。结论 人脐带华尔通胶含有丰富的MSCs,易于培养扩增,其表达MSCs的表面标记。不表达或低表达造血细胞和与移植排斥相关的细胞标记。人脐带来源的MSCs能分化为神经细胞,表达神经细胞的相关标记和基因,这种细胞可能成为中枢神经系统细胞移植的一个干细胞来源。     

免疫毒素去除脐血T细胞效率及对造血祖细胞的影响

目的 探讨抗Ｔ细胞免疫毒素体外对脐血Ｔ细胞的清除效率及对造血干／祖细胞的影响，方法（１）用碱性磷酸酶抗碱性酸酶桥联酶标技术法（ＡＰＡＡＰ）分别测定了脐血、骨髓、我周血标本ＣＤ５、ＣＤ８Ｔ细胞的百分率；（２）用单向事淋巴细胞培养（ＭＬＣ）方法比较了外周血与脐血ＭＬＣ增殖反应；（３）分别用ＭＬＣ法和噻唑蓝（ＭＴＴ）比色法；观察了两组抗人白细胞分化抗原的单克隆抗体（ＣＤ５、ＣＤ８）与完整蓖麻毒素（Ｒｉｃ     

小RNA干扰靶向抑制Par-4基因表达对人骨髓间充质干细胞凋亡的影响

目的 探讨小RNA干扰靶向抑制Par-4基因表达对人骨髓间充质干细胞凋亡的影响.方法 原代培养人骨髓间充质干细胞,谷氨酸诱导凋亡.设计和合成针对Par-4基因mRNA的siRNA(Par-4-siRNA),构建真核细胞表达载体,用脂质体介导转染入骨髓间充质干细胞,利用G418筛选稳定表达细胞株.实时荧光定量PCR(real-time PCR)法检测Par-4 mRNA的表达量.流式细胞术测定细胞凋亡百分率.Western blot测定磷酸化(Thr308)的蛋白激酶Akt1蛋白表达量.比色法测定Caspase-3酶活性.结果筛选出的Par-4-SiRNA-1、2显著抑制人骨髓间充质干细胞中Par-4基因的mRNA表达,mRNA水平分别降低88%、67%.在谷氨酸诱导后24 h,人骨髓间充质干细胞发生凋亡,百分率为60.30%±6.82%.Par-4-SiRNA-1、2都显著抑制谷氨酸的诱导作用,凋亡百分率降为38.80%±3.97%(P＜0.01)和45.49%±4.32%(P＜0.01).谷氨酸诱导后24 h人骨髓问充质干细胞中磷酸化Akt1蛋白表达下调(89.07±6.42和28.30±5.65,P＜0.01),而Par-4-SiRNA-1、2对之下调都有显著抑制作用(63.56±6.75和45.59±4.88,均有P＜0.01).谷氨酸诱导后24 h人骨髓间充质干细胞中Caspase-3酶活性上调(0.1428±0.0495和0.8616±0.1051,P＜0.01),而Par-4-SiRNA-1、2对之上调都有显著抑制作用(0.6581±0.0555和0.7041±0.0401,均有P＜0.01).结论 小RNA干扰可靶向抑制Par-4基因的表达,拮抗谷氨酸诱导的人骨髓间充质干细胞的凋亡.