物理交联再生丝素膜组织工程角膜的生物相容性研究

背景角膜组织工程生物材料在体内应当具备透明性、一定的机械强度、生物相容性和缓慢降解的特点,丝素膜生物材料具备这些特征。目的研究采用物理交联再生丝素膜构建组织工程角膜的可行性。方法用常规培养法培养人角膜上皮细胞（CECs）,将对数生长期的CECs在用家蚕丝制备的物理交联再生丝素膜上进行培养,分别于培养后24、48、72h在倒置显微镜、扫描电子显微镜下观察CECs的生长状态和形态学,并与细胞培养板培养的人CECs形态进行对照。MTT法每日检测和记录再生丝素膜培养后人CECs的增生情况,流式细胞仪检测再生丝素膜培养人CECs的细胞周期和凋亡率。将再生丝素膜4mm×3mm植入新西兰白兔右眼角膜基质层间,于术后1个月、2个月时裂隙灯下检查眼表,术后2个月摘除兔眼并制备移植眼角膜组织切片行组织病理学检查,观察再生丝素膜材料的降解情况及角膜新生血管（CNV）的生长情况。采用免疫组织化学法检测术后1个月、2个月CD34在移植眼角膜组织中的表达,并与正常眼进行对照。结果在24、48、72h3个时间点,倒置显微镜、扫描电子显微镜下见再生丝素膜培养的人CECs与细胞培养板培养法培养的人CECs形态结构无明显差别。再生丝素膜或细胞培养板培养CECs在1、2、3、4、5、6、7d各个时间点A490值比较,差异无统计学意义（F=0．641,P〉0．05）。再生丝素膜和细胞培养板培养的CECs凋亡率分别为1．8％、2．0％,细胞G2／G1期分别为1．956、1．945。再生丝素膜角膜植入后2个月时,再生丝素膜为排列整齐的胶原组织替代,角膜内新生血管和炎性细胞均少于移植后1个月。角膜免疫组织化学染色检测显示再生丝素膜植入角膜后1个月、2个月CD34表达量均明显低于Ad—VEGF165诱导的阳性对照,而与正常的角膜相比差异无统计学意义（P〉0．05）。术后1个月与术后2个月比较,角膜中CD34阳性率的差异无统计学意义（P〉0．05）。结论物理交联再生丝素膜构建组织工程角膜可行,再生丝素膜与角膜组织生物相容性良好,再生丝素膜植入兔角膜基质后无明显的炎症反应和新生血管。     

人工角膜支架及其生物相容性的研究进展

除了传统的穿透性角膜移植术和角膜内皮植入术外,人工角膜植入术是一种严重性角膜疾病终末期光学增视性选择性治疗方法.人工角膜最常见的结构是柱镜-裙带型,即由中央透明光学柱镜和周围裙边支架两部分组成.支架材料良好的生物相容性是人工角膜植入成功的关键.随着高分子材料科学的发展,支架材料的种类愈加丰富,对生物相容性的要求也愈加提高.目前常见的人工角膜主要以无机、有机或/和生物材料作为支架,不同材料在实际应用中的相容性和优劣性有所差异,了解这些特性有助于提高人工角膜植入的成功率.     

组织工程角膜支架材料的研究进展

理想的支架材料是组织工程角膜构建的重要条件.目前常用的组织工程角膜支架材料主要包括生物材料、人工材料、复合材料.羊膜、脱细胞角膜基质等生物材料是一种天然结构,具有组织相容性好、含有多种细胞因子、对人体无刺激性等优点,但来源有限,可塑性欠佳.聚羟基乙酸等高分子有机合成材料来源广泛、制作工艺简单、力学性能可控,但在人体代谢过程不尽清楚.复合材料综合了生物材料和有机合成材料的优点,但复合材料的混合比例,生物相容性和其他理化特性还需进一步研究.因此,寻找具有更高生物活性、安全性、透明性的支架材料仍是当前组织工程角膜研究的重点.     

组织工程角膜支架材料研究现状

支架材料是组织工程角膜的土壤,土壤微环境的好坏(即支架材料的选择)直接关系到组织工程角膜的构建及其应用。选择具有更高生物活性、透明性、机械强度等特点的支架材料是组织工程角膜研究的热点,本文就支架材料的研究现状做一综述。     

组织工程角膜上皮支架材料研究进展

体外培养角膜缘干细胞构建组织工程角膜上皮后再行角膜移植是治疗角膜缘干细胞缺乏导致眼表疾病的重要方法,选择理想的支架材料是构建组织工程角膜上皮过程中的一个关键环节。但支架材料的组织相容性、透光度,支架材料的降解与角膜修复的同步化,手术的长期有效性等问题仍有待进一步研究。细胞生物学、分子生物学、组织工程学和材料学的发展为构建组织工程角膜上皮的研究开辟了更广阔的前景。从近年来新发现或研制的支架材料的来源、优缺点及应用等方面,就构建组织工程角膜上皮支架材料的研究进展进行综述。     

脱细胞角膜基质为支架构建组织工程角膜上皮组织的实验研究

目的 比较氯化钠(NaCl)-十二烷基硫酸钠(SDS)-胰蛋白酶与分散酶(Dispase)-聚乙二醇辛基苯基醚(Triton-X-100)两种角膜组织脱细胞方法的效果,探讨以脱细胞角膜基质为支架构建组织工程化角膜上皮组织的可行性.方法 实验研究.采用完全随机化设计的方法,分别用NaCl-SDS-胰蛋白酶和Dispase-Triton-X-100处理兔角膜组织,使用裂隙灯显微镜、光学显微镜及透射电镜观察经两种方法处理后的角膜基质特性和脱细胞效果.以兔角膜缘上皮细胞为种子细胞,Dispase-Triton-X-100处理的猪角膜前弹力层与基质为支架,体外重建兔角膜上皮细胞层,并进行形态学、组织病理学及免疫组织化学检测.结果 两种方法处理过的兔角膜基质大体形态相似,灰白色不透明,水肿明显,质地柔软.组织病理学和超微形态学观察显示两种方法处理的兔角膜基质胶原排列规整,NaCl-SDS-胰蛋白酶处理的角膜组织残留了部分基质细胞碎片,而Dispase-Triton-X-100处理的角膜组织未见基质细胞碎片.兔角膜缘上皮组织块接种于脱细胞猪角膜前弹力层与基质上,24 h角膜上皮细胞开始游出,3～4 d融合呈片状,7～8 d形成单细胞层.组织工程化角膜上皮细胞表达CK3.结论 Dispase-Triton-X-100处理方法的角膜组织脱细胞效果良好.以脱细胞猪角膜前弹力层与基质为支架.可在体外构建组织工程化兔角膜上皮组织.     

生物玻璃陶瓷的生物相容性及其与角膜生物愈合特性的研究

目的：研究生物玻璃陶瓷（Bioglass Ceramic,BGC)在角膜中的生物相容性及其与角膜的生物愈合特性,寻找人工角膜支架材料。方法：将孔径20－70μm,孔隙率37－62％,厚度0.5mm,前后曲率半径7.8mm,直径6mm的BGC分别植入11只新西兰白兔角膜板层中。裂隙灯观察并照相,不同时间取材进行光镜检查。结果：最长观察8个月,5只实验2兔的植入物脱出,其中3只碎裂。术后第2,3周角膜新生血管增生明显。术后2个月,出现角膜浅层轻度混浊。光镜检查见植床内少量大小不一的灰色BGC团块,其间混杂红杂物质,周围角膜见大量增生成纤维细胞成同心圆样排列。结论：BGC植入角膜后有较高的脱出率,孔隙率5为1％,62T的BGC强度不够,植入后碎裂。BGC植入影响了角膜代谢,导致角膜前板层混浊。目前的切片技术与设备,较难获得良好的切片效果,难以评价BGC在角膜板层中的生物愈合特性。BGC目前的参数不适宜用于人工角膜的支架材料。     

猪脱细胞角膜基质组织结构特点与生物相容性研究

背景构建组织工程化角膜时,载体的选择十分重要。目前有多种载体可供选用,但脱细胞角膜基质是公认的较好载体。目的观察猪脱细胞角膜基质的组织结构特点,评价其与异种角膜基质和上皮细胞的生物相容性。方法取猪角膜组织进行组织块培养,经胰蛋白酶-EDTA酶消化角膜上皮、基质、内皮细胞,支架组织于-20℃冷冻干燥后灭菌保存。猪脱细胞角膜基质石蜡切片行常规苏木精一伊红染色,光学显微镜下观察组织的形态学特征;扫描电镜下观察其组织结构特点;并对其物理特性,如抗拉性、膨胀性、含水量和透明度进行评价。将猪脱细胞角膜基质移植到兔角膜基质层内,同时与体外培养的兔角膜上皮细胞共培养4周,分析其组织和细胞生物相容性。结果经酶消化处理后猪角膜组织中未见上皮、基质和内皮细胞,其胶原纤维直径大小、排列与正常角膜组织相同,抗拉性、膨胀性、含水量和透明度等物理特性与正常猪角膜相似。猪脱细胞角膜基质行异种兔角膜基质层间移植1周时可见轻度水肿,2周后水肿基本消退,4周时透明度较好。猪脱细胞角膜基质与兔角膜基质之间贴附良好,未见炎症反应及新生血管。兔角膜上皮细胞接种于猪脱细胞角膜基质上共培养4周后CK3表达阳性。猪脱细胞角膜基质脱水前与脱水2h、4h后及正常猪角膜基质间的抗拉性、膨胀性、含水量的差异均无统计学意义（P〉0．05）,但脱水2h、4h后及正常猪角膜基质的透明度明显好于脱水前,差异均有统计学意义（P〈0．01）。结论猪脱细胞角膜基质组织结构与正常猪角膜相似,与兔角膜基质和上皮细胞具有良好的生物相容性。     

壳聚糖及其衍生物作为组织工程角膜支架的研究进展

利用组织工程技术构建组织工程角膜能够从根本上解决角膜移植供体不足和术后免疫排斥等问题.理想的支架材料是构建组织工程角膜的重要条件.壳聚糖及其衍生物具有良好的透明性、生物相容性、可降解性、力学性能和可塑性,在角膜组织工程中具有良好的应用前景.本文对壳聚糖及其衍生物在角膜组织工程中的研究现状进行了综述,讨论了目前存在的问题,为构建满足临床要求的组织工程角膜提供指导.     

异种脱细胞角膜基质材料的生物相容性研究

目的：研究脱细胞猪角膜基质材料在角膜组织中的生物相容性,为组织工程角膜的构建寻找一种良好的支架材料。方法：将用去垢剂联合酶的方法脱细胞处理的猪角膜基质材料植入兔角膜基质囊袋中,进行裂隙灯观察并照相。不同时间取材HE染色,进行光镜检查。结果：脱细胞猪角膜基质材料植入兔角膜基质囊袋,观察4mo,生物相容性良好,材料逐渐降解吸收。结论：脱细胞猪角膜基质材料植入兔角膜中无炎症、无免疫排斥反应,生物相容性好,可作为组织工程角膜的支架材料。     

Evaluation of novel decellularizing corneal stroma for cornea tissue engineering applications

AIM: To develop a new decellularization method depended upon the natural corneal structure and to harvest an ideal scaffold with good biocompatibilities for corneal reconstruction. METHODS: The acellular cornea matrix (ACM) were prepared from de-epithelium fresh porcine corneas (DFPCs) by incubation with 100% fresh human sera and additional electrophoresis at 4℃. Human corneal epithelial cells (HCEs) were used for the cytotoxicity tests of ACM. ACM were implanted into the Enhanced Green Fluorecence Protein (eGFP) transgenic mouse anterior chamber for evaluation of histocompatibility. RESULTS: HE and GSIB4 results showed fresh porcine cornea matrix with 100% human sera and electrophoresis could entirely decellularize stromal cell without reducing its transparency. ACM had no cytotoxic effect ex vivo. Animal test showed there was no rejection for one month after surgery. CONCLUSION: These results provide a decellularizing approach for the study of corneal tissue engineering and had the broader implications for the field of biological tissue engineering in other engineered organ or tissue matrix.     

组织工程结膜支架的研究进展

结膜重建常用于各种化学热烧伤所导致的严重结膜缺损,而组织工程结膜能有效解决在结膜移植中自体结膜移植材料缺乏及异体结膜移植材料存在免疫排斥反应等难题。具有良好生物相容性及足够生物力学强度的支架材料是构建组织工程结膜的重要条件。本文对组织工程结膜支架材料的最新研究进展及目前存在的问题进行总结。     

组织工程角膜基质的体外构建及移植的实验研究

目的探讨利用组织工程技术体外构建角膜基质进行板层角膜移植的可行性和有效性。方法将猪角膜基质去细胞处理后制备成组织工程角膜基质载体;取幼兔角膜基质细胞体外培养,将其种植在载体上,体外构建成组织工程角膜基质,用PKH26荧光标记兔角膜基质细胞示踪角膜基质的构建;将16只兔的角膜基质内植入壳聚糖膜使之形成无菌性角膜溃疡,随机从16只兔中选8只,进行组织工程角膜基质移植;另外8只作为对照组,进行新鲜的同种异体兔板层角膜移植。术后对角膜进行裂隙灯、光学显微镜、透射电镜观察。结果体外构建的组织工程角膜的基质细胞具有活性,其结构与正常角膜基质相近。移植治疗无菌性角膜溃疡术后,1~2周有新生血管侵入组织工程角膜基质植片边缘,植片为灰白色半透明状;3~4周随着新生血管减退,组织工程角膜基质植片局部开始透明变薄;术后8~10周角膜溃疡完全修复,角膜恢复透明性,角膜神经可再生;观察最长达10月,角膜仍保持透明,无免疫排斥发生,与对照组疗效相同。结论体外构建的组织工程角膜基质无免疫原性、具有良好的生物相容性,可作为临床治疗角膜溃疡的移植材料。     

构建组织工程化羊膜角膜上皮植片的研究进展

虽然组织工程化角膜组织已成功构建,并为体外进行角膜生理、病理、药理和角膜移植等方面的研究提供了与活体角膜很接近的模型,但其距离临床应用还有一定距离。近年来,采用组织工程技术构建的羊膜角膜上皮植片已率先应用于临床,为成千上万的由于角膜上皮缺损所致的角膜疾病患者带来希望,本文对有关羊膜的基础研究、羊膜负载角膜缘干细胞植片的构建方法及其功能的评价、角膜缘干细胞在羊膜上的生物学特性、植片移植及术后护理等方面的研究进展和存在的问题进行综述。     

Acellular ostrich corneal stroma used as scaffold for construction of tissue-engineered cornea

AIM: To assess acellular ostrich corneal matrix used as a scaffold to reconstruct a damaged cornea. METHODS: A hypertonic saline solution combined with a digestion method was used to decellularize the ostrich cornea. The microstructure of the acellular corneal matrix was observed by transmission electron microscopy (TEM) and hematoxylin and eosin (H&E) staining. The mechanical properties were detected by a rheometer and a tension machine. The acellular corneal matrix was also transplanted into a rabbit cornea and cytokeratin 3 was used to check the immune phenotype. RESULTS: The microstructure and mechanical properties of the ostrich cornea were well preserved after the decellularization process. In vitro, the methyl thiazolyl tetrazolium results revealed that extracts of the acellular ostrich corneas (AOCs) had no inhibitory effects on the proliferation of the corneal epithelial or endothelial cells or on the keratocytes. The rabbit lamellar keratoplasty showed that the transplanted AOCs were transparent and completely incorporated into the host cornea while corneal turbidity and graft dissolution occurred in the acellular porcine cornea (APC) transplantation. The phenotype of the reconstructed cornea was similar to a normal rabbit cornea with a high expression of cytokeratin 3 in the superficial epithelial cell layer. CONCLUSION: We first used AOCs as scaffolds to reconstruct damaged corneas. Compared with porcine corneas, the anatomical structures of ostrich corneas are closer to those of human corneas. In accordance with the principle that structure determines function, a xenograft lamellar keratoplasty also confirmed that the AOC transplantation generated a superior outcome compared to that of the APC graft.