5-氮杂胞苷诱导兔骨髓间充质细胞分化为心肌样细胞的实验

目的:探讨5-氮杂胞苷诱导兔骨髓间充质细胞体外分化为肌细胞的可能性。方法:实验于2002-10/2003-03在西京医院心脏内科实验室完成。穿刺法抽取成年新西兰兔双侧股骨骨髓,分离培养骨髓间充质细胞,通过不同浓度的5-氮杂胞苷诱导24h后,继续培养3周,收集生长良好的诱导后7,14,21,28d的骨髓间充质细胞,以及第3代乳鼠心肌细胞做Westernblot检测。10μmol/L5-氮杂胞苷诱导分化3周的间充质细胞经胰酶消化后接种在多聚赖氨酸包被的无菌盖玻片上做细胞爬片,CO2孵箱中培养48h后取出,磷酸盐缓冲液冲洗后加横纹肌α-肌动蛋白单抗室温孵育1h,洗涤后加入Cy3标记的羊抗鼠抗体,在37℃下摇床孵育1h,荧光显微镜下拍照。取诱导后3周处于对数生长期的细胞,制成超薄切片,铀-铅双染色,透射电镜下观察照相。结果:①倒置相差显微镜下观察5-氮杂胞苷诱导10d后可见细胞部分变成多角形状,14d后可见趋于融合的多核肌管样细胞结构。②West-ernblot检测横纹肌α-肌动蛋白在乳鼠心肌细胞和10μmol/L5-氮杂胞苷诱导后14,21,28d的兔间充质细胞中均有表达,心肌细胞的阳性条带最粗,其次为诱导后21d和28d的细胞,诱导后14d的细胞阳性条带最淡,诱导后7d的细胞未见阳性条带。③诱导后21d,10μmol/L5-氮杂胞苷处理的间充质细胞经横纹肌α-肌动蛋白免疫细胞荧光染色部分细胞呈阳性反应,提示有肌样细胞特性。④透射电镜检查局部放大示胞浆内有明显的Z线物质,之间有肌丝团样结构,构成类似原始的肌小节样结构。结论:成年兔骨髓间充质细胞在5-氮杂胞苷诱导下可向肌细胞分化,未分化为跳动的心肌样细胞。     

5-氮杂胞苷诱导人脐带间充质干细胞向心肌样细胞的分化

背景：5-氮杂胞苷能诱导人脐带间充质干细胞分化为心肌细胞。目的：以5-氮杂胞苷诱导人脐带间充质干细胞分化为心肌细胞。方法：采用贴壁培养法分离、纯化人脐带间充质干细胞,以5-氮杂胞苷诱导第3代人脐带间充质干细胞分化为心肌样细胞。结果与结论：诱导前人脐带间充质干细胞呈典型的梭形;诱导后一二周细胞体积变大,三四周后相邻细胞间胞膜有接触,逐渐相连呈肌管状,细胞胞质内可见细丝样结构。诱导4周后免疫组织化学鉴定人脐带间充质干细胞cTnI表达阳性,未诱导细胞cTnI表达阴性;诱导组Nkx2.5、GATA4mRNA表达水平较未诱导组显著增加（P〈0.05）。提示5-氮杂胞苷可能通过调控GATA4、Nkx2.5基因的表达促进人脐带间充质干细胞分化为心肌样细胞,并促进其成熟。     

5-氮杂胞苷诱导人脐带间充质干细胞向心肌样细胞的分化

背景:5-氮杂胞苷能诱导人脐带间充质干细胞分化为心肌细胞。目的:以5-氮杂胞苷诱导人脐带间充质干细胞分化为心肌细胞。方法:采用贴壁培养法分离、纯化人脐带间充质干细胞,以5-氮杂胞苷诱导第3代人脐带间充质干细胞分化为心肌样细胞。结果与结论:诱导前人脐带间充质干细胞呈典型的梭形;诱导后一二周细胞体积变大,三四周后相邻细胞间胞膜有接触,逐渐相连呈肌管状,细胞胞质内可见细丝样结构。诱导4周后免疫组织化学鉴定人脐带间充质干细胞cTnI表达阳性,未诱导细胞cTnI表达阴性;诱导组Nkx2.5、GATA4mRNA表达水平较未诱导组显著增加(P<0.05)。提示5-氮杂胞苷可能通过调控GATA4、Nkx2.5基因的表达促进人脐带间充质干细胞分化为心肌样细胞,并促进其成熟。     

5-氮胞苷体外诱导人骨髓间充质干细胞转化为心肌样细胞的实验

目的:观察5-氮胞苷在体外诱导人骨髓间充质干细胞转化为心肌样细胞的情况及GATA-4和Nkx2.5基因的表达,从而确定人骨髓间充质干细胞体外诱导为心肌样细胞的条件、规律及转化细胞的特点。方法:实验于2005-08/2006-05在解放军沈阳军区总医院心血管外科和中国医科大学实验技术中心一部完成。取非血液疾病的5例胸科手术患者术中已切除掉的肋骨,抽取骨髓。利用淋巴细胞分离液行密度梯度离心法和差异贴壁法进行分离、提纯骨髓间充质干细胞,并进行培养扩增。用流式细胞仪对第2代的骨髓间充质干细胞表面抗原进行测定。应用10μmol/L5-氮胞苷对第2代的骨髓间充质干细胞诱导24h,于诱导后1,2,3,4周,用反转录-聚合酶链反应检测GATA-4和Nkx2.5基因表达。结果:①3份第2代骨髓间充质干细胞样本重复测定,表达CD29,CD44,不表达CD34,CD45。②以5-氮胞苷诱导培养24h后,骨髓间充质干细胞形态和排列方式发生明显变化,诱导1周后,细胞体积增大,多呈长梭行,平行排列;诱导2周后,细胞变为短柱状,突起位于两端,相邻细胞的突起紧密接触;诱导3周后,短柱状细胞的突起相互连接,部分细胞可见类肌管样结构;诱导4周后,细胞体积变小,可见由几个细胞连接形成的多核肌管样结构。③诱导组细胞GATA-4和Nkx2.5的聚合酶链反应产物凝胶电泳呈阳性,对照组为阴性,诱导组基因表达量均随着时间延长逐渐增加。结论:5-氮胞苷可诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞转化,其处于祖心肌细胞和分化的心肌细胞之间。     

5-氮胞苷体外诱导人骨髓间充质干细胞转化为心肌样细胞的实验

目的：观察5-氮胞苷在体外诱导人骨髓间充质干细胞转化为心肌样细胞的情况及GATA-4和Nkx2．5基因的表达，从而确定人骨髓间充质干细胞体外诱导为心肌样细胞的条件、规律及转化细胞的特点。方法：实验于2005—08／2006—05在解放军沈阳军区总医院心血管外科和中国医科大学实验技术中心一部完成。取非血液疾病的5例胸科手术患者术中已切除掉的肋骨，抽取骨髓。利用淋巴细胞分离液行密度梯度离心法和差异贴壁法进行分离、提纯骨髓间充质干细胞，并进行培养扩增。用流式细胞仪对第2代的骨髓间充质干细胞表面抗原进行测定。应用10μmol／L 5-氮胞苷对第2代的骨髓间充质干细胞诱导24h，于诱导后1，2，3，4周，用反转录-聚合酶链反应检测GATA-4和Nkx2．5基因表达。结果：①3份第2代骨髓间充质干细胞样本重复测定，表达CD29，CD44，不表达CD34，CD45。②以5-氮胞苷诱导培养24h后，骨髓间充质干细胞形态和排列方式发生明显变化，诱导1周后，细胞体积增大，多呈长梭行，平行排列；诱导2周后，细胞变为短柱状，突起位于两端，相邻细胞的突起紧密接触；诱导3周后，短柱状细胞的突起相互连接，部分细胞可见类肌管样结构；诱导4周后，细胞体积变小，可见由几个细胞连接形成的多核肌管样结构，③诱导组细胞GATA-4和Nkx2．5的聚合酶链反应产物凝胶电泳呈阳性，对照组为阴性，诱导组基因表达量均随着时间延长逐渐增加。结论：5-氮胞苷可诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞转化，其处于祖心肌细胞和分化的心肌细胞之间。     

体外诱导人骨髓间充质干细胞分化为肝细胞样细胞的特征及功能

目的：观察人骨髓间充质干细胞体外培养定向分化为肝细胞样细胞的过程及其特征。方法：实验于2003—12／2004—05在中山大学附属第二医院林百欣医学研究中心实验室完成。人骨髓取自髂后上嵴骨髓穿刺的健康供者，来源于中山大学附属第二医院儿科患儿健康家属。全骨髓贴壁筛选法分离出骨髓间充质干细胞，体外扩增后以流式细胞仪鉴定其表面标志。取扩增5代的骨髓间充质干细胞，分为2组，分化组于加入20μg／L肝细胞生长因子和10μg／L成纤维细胞生长因子4的opti-MEMI低血清培养基中诱导分化，空白对照组则不加任何细胞因子。2周后，行细胞形态学观察，并检测成热肝细胞的糖原合成和尿素分泌功能(免疫细胞化学法检测甲胎蛋白、白蛋白及细胞角蛋白18，19表达，反转录-聚合酶链式反应检测甲胎蛋白、白蛋白基因mRNA转录水平，高碘酸-Schiff染色检测糖原及紫外分光光度法测定尿素氮合量)。结果：①流式细胞仪显示第5代骨髓间充质干细胞高表达表面抗原白细胞分化抗原29，不表达白细胞分化抗原34，11b。②分化组骨髓间充质干细胞至第14天，部分细胞分化为多角形的肝细胞样细胞。③免疫细胞化学法检测到细胞特异性表达甲胎蛋白、白蛋白及细胞角蛋白18，19，反转录-聚合酶链式反应显示有甲胎蛋白和白蛋白mRNA转录。④高碘酸-Schiff糖原染色可见胞浆内存在红色颗粒，呈阳性反应，培养液内尿素氮含量亦明显升高。⑤空白对照组骨髓间充质干细胞则未见上述各项变化。结论：在低血清培养体系中，采用成纤维细胞生长因子4和肝细胞生长因子联合诱导，证明人骨髓间充质干细胞在体外能定向分化为肝细胞样细胞，诱导后的骨髓间充质干细胞上有了成熟肝细胞的糖原合成和分泌尿素的特征性功能，表明骨髓间充质干细胞可作为肝细胞移植和人工肝的新型种子细胞。     

骨髓间充质干细胞向早期神经元样细胞诱导分化的研究

背景骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)不仅能分化成间质细胞,而且能向实质细胞(如心肌细胞)转化.在体外定向诱导MSCs分化成神经细胞,是目前国内外研究热点,具有重大理论意义.目的探讨大鼠MSCs体外诱导分化成神经元的能力.设计随机空白对照实验的研究.地点、材料和干预实验在吉林大学公共卫生学院毒理教研室完成.实验动物采用Wistar大鼠(吉林大学实验动物中心),6周龄,雌雄不限.将2～4代的rMSCs接种在铺有盖玻片的24孔板中.分为3个实验组,一个对照组.实验组分别加入终浓度为0.25,0.50和1.00 mmol/L异丁基甲基黄嘌呤(isobutylmethlxanthine,IBMX)诱导传代的rMSCs,待细胞分化后进行形态学观察,对照组中不加诱导剂,并用免疫细胞化学方法进行细胞鉴定.主要观察指标培养MSCs的生长情况,诱导后细胞的形态学变化及nestin(小鼠抗大鼠,单克隆),神经元特异性烯醇化酶(neuron-specific enolase,NSE)抗体(兔抗鼠,多抗)、微管相关蛋白-2a,bmicrotubule-associated protein-2a,b,MAP-2a,b)的免疫细胞化学检测.结果加入IBMX后,0.25mmol/L组分化成神经元样细胞较少.1.0mmol/L组细胞加入IBMX第2天开始可见细胞陆续死亡.0.5 mmol/L组2 d即可见有神经元样细胞出现,细胞具有典型的神经元形态特征,0.5 mmol/LIBMX诱导细胞效果最好,2 d即可见有神经元样细胞出现,6 d神经元样细胞占细胞总数的(23.2±2.3)%,NSE染色阳性.对照组中未诱导细胞表达nestin,诱导后3 d阳性细胞增多,6 d减少.实验组和对照组均不表达MAP-2a,b.结论体外rMSC能扩增、传代,并被诱导分化成早期神经元样细胞.     

骨髓间充质干细胞体外诱导分化为心肌样细胞

目的:探讨肝细胞生长因子(hepatocyte growth ractor,HGF)作为诱导剂,体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,Mscs)分化为心肌细胞的作用.方法:分离培养大鼠MSCs,在第4代MSCs中添加HGF(20 ng/mL)对其进行诱导分化,观察细胞形态学的变化,采用荧光免疫组织化学及RT-PCR方法对分化细胞进行鉴定.结果:大鼠MSCs贴壁呈集落生长,有成纤维细胞样外观.诱导后细胞呈梭形,排列方向渐趋一致,有肌管样结构形成,未观察到转化细胞的自主搏动.Troponin T及Connexin43的表达呈阳性,并可见清晰肌小节.RT-PCR检测MLC-2A、MLC-2V、α-MHc、β-Actin mRNA表达阳性.结论:大鼠MSCs体外在HGF诱导下可定向分化为心肌样细胞.     

5-氮胞苷诱导骨髓间充质干细胞向心肌细胞的分化

目的:目前在5-氮胞苷诱导骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化领域中,对用于诱导的细胞代次选择不一。实验选择第2,9代骨髓间充质干细胞,观察比较经5-氮胞苷体外诱导后其各自向心肌细胞分化过程中心肌特异性肌钙蛋白cTnT和早期分化基因的表达。方法:实验于2005-07/2007-07在天津中医药大学病理三级实验室完成。①实验方法:清洁级Wistar雄性大鼠,脱颈处死后取双侧股骨、胫骨,采用密度梯度离心法分离骨髓单个核细胞进行原代培养。去掉原代细胞瓶内的培养液,D-Hank’s液冲洗去除血清,胰蛋白酶 乙二胺四乙酸消化,制备单细胞悬液,按1∶3传代。用10μmol/L的5-氮胞苷分别诱导第2,9代骨髓间充质干细胞,诱导4周,并设立未加诱导剂的阴性对照。②实验评估:倒置相差显微镜下观察细胞的生长情况及形态变化;免疫组织细胞化学法检测心肌特异性肌钙蛋白cTnT的表达,胞浆出现棕黄色颗粒状物质为阳性;嵌合荧光法检测心肌早期基因NKx2.5、GATA-4、Desmin、α-actin的相对表达量。结果:①细胞形态学观察:5-氮胞苷诱导前细胞生长较快,诱导后死亡细胞较多且生长较慢。诱导后2,3,4周,第9代骨髓间充质干细胞无论在形态和细胞活力方面均优于第2代。②心肌特异性肌钙蛋白cTnT的表达:5-氮胞苷诱导4周后,第9代骨髓间充质干细胞心肌特异性肌钙蛋白cTnT阳性表达率明显高于第2代(22.42±9.97),(11.22±5.62)%,P<0.05,阴性对照无阳性表达。③心肌早期基因的表达:反转录-聚合酶链反应结果显示,5-氮胞苷诱导4周后,第9代骨髓间充质干细胞心肌早期基因NKx2.5、GATA-4、Desmin、α-actin的相对表达量均明显高于第2代(P<0.05)。结论:经5-氮胞苷诱导后,骨髓间充质干细胞表达心肌特异性肌钙蛋白cTnT及4种心肌早期基因,证实其能够向心肌细胞分化,且传至第9代时向心肌细胞分化的能力要强于第2代。     

兔骨髓基质细胞在条件培养液中向成骨细胞转化的特征

目的:观察不同类型的培养液环境对骨髓基质细胞向成骨细胞转化的诱导作用。方法:实验于2004-04/08在哈尔滨医科大学附属一院实验中心完成。实验动物为日本大耳白兔。制备标准培养液和条件培养液,体外分离兔长骨骨髓基质细胞,标准培养液和条件培养液体外培养骨髓基质原代细胞,3d后半量换液,其后每两三天换液1次。当细胞融合80%,用25g/L胰蛋白酶消化,以1∶2传代培养。应用倒置相差显微镜逐日观察体外培养的骨髓基质细胞的形态,采用常规24孔培养板计数法测定第3代细胞在标准培养液及条件培养液培养条件下的细胞生长曲线。以5×107L-1细胞接种到96培养板中,培养24h后,更换标准培养液、条件培养液,继续培养至第5天及第10天,经处理,每孔加100μL碱性磷酸酶底物溶液,37℃孵育40min,每孔加1mol/L氢氧化钠50μL终止反应,在490nm波长测定各孔吸光度值,以U/L表示细胞碱性磷酸酶相对活性。将传代培养至第10天的标准培养液和条件培养液细胞分作2组,去除培养液,磷酸盐缓冲液pH7.3清洗,10g/L多聚甲醛固定1h,行常规VonKossa染色观察矿化结节形成。实验数据进行配对资料t检验。结果:①骨髓基质细胞在标准培养液中生长良好,细胞接种后1d少量细胞贴壁,呈圆形,2d可见贴壁细胞增多,3d有少量细胞呈纺锤形,6d后见细胞呈多种形态,且形成分散的集落,其间混有少量圆形透光度较好的细胞。1周后细胞集落迅速增多,且集落中的细胞明显增多,近12～14d集落融合成片,细胞排列有一定的方向性,呈旋涡状排列,表现为类成纤维样细胞集落生长。②条件培养液有较明显的增加骨髓基质细胞碱性磷酸酶活性的作用,条件培养液组碱性磷酸酶活性在各时间点均显著高于标准培养液组(P<0.05),条件培养组液随培养时间延长其碱性磷酸酶活性显著增高(P<0.05),而标准培养液组碱性磷酸酶活性在各时间点无显著差异。③条件培养组VonKossa染色强阳性,细胞间连接处可见大量黑色沉积物,证实有大量矿化结节的存在。而在标准培养液组未见黑色沉积物,VonKossa染色阴性。结论:骨髓基质细胞在体外条件培养液中可明显增强其形成矿化组织的能力     

黄芪甲苷联合丹参酮Ⅱa诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化

背景：黄芪甲苷和丹参酮Ⅱa是传统中医药治疗心肌缺血的有效成分,是否可参与骨髓间充质于细胞向心肌样细胞分化的过程呢？目的：观察黄芪甲苷联合丹参酮Ⅱa对体外诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化作用的影响。方法：应用M丌法分别测定黄芪甲苷和丹参酮Ⅱa的最大无毒浓度,确定两者联合诱导骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞的剂量。将分离纯化的骨髓间充质干细胞分5组进行诱导：黄芪甲苷组、丹参酮Ⅱa组、丹参酮Ⅱa＋黄芪甲苷组、5-氮胞苷组、空白对照组,ELISA方法观察体外诱导后骨髓间充质干细胞缝隙连接蛋白43和肌钙蛋白表达变化。结果与结论：诱导后丹参酮Ⅱa＋黄芪甲苷组、丹参酮Ⅱa、黄芪甲苷、5-氮胞苷组肌钙蛋白、缝隙连接蛋白43表达水平均高于正常对照组（P〈0．01）,丹参酮Ⅱa＋黄芪甲苷组高于丹参酮Ⅱa、黄芪甲苷组（P〈0。01）。丹参酮Ⅱa＋黄芪甲苷组与5-氮胞苷组缝隙连接蛋白43表达水平差异无显著性意义（P〉0．05）。结果提示黄芪甲苷联合丹参酮Ⅱa可以诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞方向转化,而其联合作用高于单一成分的作用。     

参三七皂苷Rg1预适应对5-氮胞苷诱导大鼠骨髓间充质干细胞向心肌细胞转化的干预

目的:用药物预适应方法进行干细胞诱导已有报道,本实验观察中药参三七皂苷Rg1对5-氮胞苷诱导大鼠骨髓间充质干细胞向心肌细胞转化中的作用。方法:实验于2003-01/05在南京医科大学药理教研室完成。①实验材料:清洁级SD大鼠8只。参三七皂苷Rg18mg,批号20021017,由云南省长春花生物制剂公司提供,加入不含胎牛血清的IMDM培养液10mL,调配成10-4mol/L溶液,4℃保存。5-氮胞苷(Sigma公司,批号021209)。②实验方法:贴壁法体外培养大鼠骨髓间充质干细胞。设立4组:空白对照组常规培养后进行无血清处理,每3d换液1次;5-氮胞苷单用组单纯以10μmol/L的5-氮胞苷进行处理,其终浓度为1×10-8moL/L,连续诱导15d;5-氮胞苷 参三七皂苷Rg1预适应组分别加入0.1,1μmol/L参三七皂苷Rg1培养液处理24h,再各以10μmol/L的5-氮胞苷进行诱导,其终浓度为1×10-8moL/L,连续诱导15d。③实验评估:取第2代骨髓间充质干细胞,绘制生长曲线并计算群体倍增时间。观察诱导后骨髓间充质干细胞的生长形态学特征和细胞超微结构变化。激光共聚焦显微镜测定细胞表面积变化和细胞内钙离子浓度。结果:①5-氮胞苷诱导后骨髓间充质干细胞的生长形态学特征和细胞超微结构变化:骨髓间质干细胞胞体逐渐增大并伸出细长突起,在突起末端出现分支,部分相邻细胞的突起连接成网,形态学上表现出向心肌细胞方向转化的特征。其超微结构呈梭形,有明显的肌丝,细胞核呈单椭圆形,位于细胞中央,间质干细胞形似心肌细胞。②参三七皂苷Rg1预适应对5-氮胞苷诱导的骨髓间充质干细胞增殖特性的影响:与5-氮胞苷单用组比较,5-氮胞苷 参三七皂苷Rg1预适应组从第3天开始细胞数明显增加,细胞生长曲线均无明显的生长平台期,达到高峰后细胞数开始减少。③参三七皂苷Rg1预适应对5-氮胞苷诱导的骨髓间充质干细胞表面积的影响:与空白对照组骨髓间充质干细胞表面积比较,5-氮胞苷单用组明显降低,0.1,1μmol/L参三七皂苷Rg1预适应则能显著升高5-氮胞苷诱导的骨髓间充质干细胞表面积(P<0.01)。④参三七皂苷Rg1对5-氮胞苷诱导的骨髓间充质干细胞内游离钙水平的影响:与空白对照组比较,5-氮胞苷诱导4周后骨髓间充质干细胞内游离Ca2 相对荧光强度均明显升高(t=6.72,P<0.01),且5-氮胞苷 1μmol/L参三七皂苷Rg1预适应组升高幅度大于5-氮胞苷单用组(t=3.13,P<0.05)。结论:①参三七皂苷Rg1预适应在体外可显著刺激5-氮胞苷诱导的鼠骨髓间充质干细胞向心肌细胞转化和增殖,改善细胞形态,刺激细胞内钙离子增加。②参三七皂苷Rg1与5-氮胞苷对骨髓间充质干细胞向心肌细胞定向分化产生协同效应。     

5-氮胞苷体外诱导大鼠骨髓基质干细胞向心肌样细胞的分化

背景:骨髓基质干细胞具有扩增迅速、分化潜能广泛等特点,因此建立骨髓基质干细胞的体外定向诱导模型有利于组织工程学研究.目的:探讨应用5-氮胞苷体外诱导大鼠骨髓基质干细胞向心肌样细胞分化的可能性.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2005-06/2008-06在辽宁医学院附属第一医院中心实验室完成.材料:SD大鼠20只,由辽宁医学院实验动物中心提供.5-氮胞苷为Sigma公司产品.方法:大鼠麻醉后,分离股骨和胫骨,全骨髓法+贴壁法分离培养骨髓基质干细胞,待细胞生长融合至90%后传代扩增.取P3代骨髓基质干细胞,以2×10~4/孔密度接种于24孔培养板,分别加入5,10,15,20 μmol/L 5-氮胞苷诱导培养,同时设立不加诱导剂的空白对照,诱导24 h后更换为正常培养液继续培养至3周.主要观察指标:细胞形态及生长曲线,诱导后细胞形态变化,诱导后细胞连接蛋白43和α-横纹肌肌动蛋白的表达.结果:①培养的骨髓基质干细胞大多呈梭形,有时可见细胞融合,P3代细胞接种后第1,2天为静止生长期,从第3天开始进入对数生长期,第9天达高峰,以后进入平台期,第12天细胞数量开始减少.②5 μmol/L 5-氮胞苷诱导后,骨髓基质干细胞形态无明显变化;10 μmol/L 5-氮胞苷诱导后骨髓基质干细胞变长,宽大,并朝一个方向延伸,具有肌管形成细胞的形态特点;15 μmol/L 5-氮胞苷诱导后,24孔板周边区有少量细胞存活;20 μmol/L 5-氮胞苷诱导后细胞死亡.③经10 μmol/L5-氮胞苷诱导3周后.骨髓基质干细胞胞浆内可见连接蛋白43和α-横纹肌肌动蛋白的表达;空白对照组均呈阴性表达.结论:骨髓基质干细胞自身无法向心肌细胞方向转化,体外经5-氮胞苷诱导后具有向心肌细胞分化的潜能.5-氮胞苷浓度过低不能起到诱导分化作用,浓度过高则会造成细胞大量死亡,10 μmol/L为较适宜的诱导浓度.     

心肌条件培养液与5-氮胞苷诱导骨髓基质干细胞向心肌样细胞的分化

背景：骨髓基质干细胞可以明显改善心肌缺血时的心脏功能,但其直接分化为心肌细胞并参与心功能恢复的机制尚不明确。目的：探讨心肌条件培养液与5-氮胞苷诱导骨髓基质干细胞分化为心肌样细胞的作用。方法：全骨髓贴壁法分离培养骨髓基质干细胞,将第6代骨髓基质干细胞随机分为4组：5-氮胞苷＋心肌条件培养液联合诱导组;5-氮胞苷组;心肌条件培养液组;基础培养基组（空白组）。用心肌条件培养液和5-氮胞苷诱导3周后用免疫组化法测定各组心肌肌钙蛋白表达,并采用单因素方差分析检验进行统计学分析。结果与结论：在体外心肌条件培养液可以诱导骨髓基质干细胞向心肌细胞分化,提示其中细胞因子可能起关键作用,但心肌条件培养液的这种作用要弱于化学诱导剂5-氮胞苷的诱导作用,且联合诱导作用更强。     

兔骨髓源性神经干细胞分化为成熟神经元样细胞的特征研究

目的:探讨兔骨髓源性神经干细胞(bonemarrowstromalcells,BMSCs)经体外培养及诱导分化成的神经元样细胞,能否合成分泌5-羟色胺神经生物活性物质成分。方法:分离兔BMSCs,应用神经干细胞培养液和分化诱导因子进行体外培养和诱导分化,免疫细胞化学鉴定;并应用高效液相色谱法(HPLC)检测其5-羟色胺生物活性物质的含量。细胞培养所涉及的细胞因子主要有脑源性神经营养因子(BDNF)和维A酸。结果:BMSCs培养12d可见大而圆细胞,免疫细胞化学鉴定Nestin抗原阳性;培养20d可见长突起神经元样细胞,神经核蛋白(NeuN)免疫细胞化学检查阳性,高效液相检测BMSCs、空白神经干细胞培养液及L-02肝细胞阴性对照组未测到5-羟色胺生物活性物质,经体外培养增殖14d的神经干细胞及培养液、体外诱导分化20d的神经元样细胞及培养液则可检测到5-羟色胺分别为:每1×107细胞中(1.7940±0.0095),(4.010±0.1170)μg/L,差异有非常显著性意义(t=30.6323,P=0.001)。方差分析显示:随着骨髓基质细胞培养天数的增加,其所含的5-羟色胺浓度也渐增加,组间5-羟色胺含量差异有显著意义(P<0.01)。结论:兔BMSCs能在体外增殖,并表达Nestin抗原;而且,在适宜条件下能分化成神经元样细胞,并表达成熟神经元特异性核蛋白,合成、分泌5-羟色胺神经递质。     

心肌条件培养液与5-氮胞苷诱导骨髓基质干细胞向心肌样细胞的分化

背景:骨髓基质干细胞可以明显改善心肌缺血时的心脏功能,但其直接分化为心肌细胞并参与心功能恢复的机制尚不明确.目的:探讨心肌条件培养液与5-氮胞苷诱导骨髓基质干细胞分化为心肌样细胞的作用.方法:全骨髓贴壁法分离培养骨髓基质干细胞,将第6代骨髓基质干细胞随机分为4组:5-氮胞苷+心肌条件培养液联合诱导组;5-氮胞苷组;心肌条件培养液组;基础培养基组(空白组).用心肌条件培养液和5-氮胞苷诱导3周后用免疫组化法测定各组心肌肌钙蛋白表达,并采用单因素方差分析检验进行统计学分析.结果与结论:在体外心肌条件培养液可以诱导骨髓基质干细胞向心肌细胞分化,提示其中细胞因子可能起关键作用,但心肌条件培养液的这种作用要弱于化学诱导剂5-氮胞苷的诱导作用,且联合诱导作用更强.     

联合应用地塞米松和维甲酸诱导兔骨髓基质细胞向成骨方向的转化

目的：观察维甲酸和地塞米松对兔骨髓基质细胞的成骨诱导影响，探讨二者联合诱导兔骨髓基质细胞向成骨细胞分化的可能性和适当条件，使兔骨髓基质细胞向成骨诱导得以优化，从而为临床治疗骨缺损提供实验基础。方法：实验于2005—12／2006—3在锦州医学院附属第一医院骨科实验室完成。①体外培养兔骨髓基质干细胞。②用不同的诱导剂将其向类成骨细胞诱导。实验分非诱导组（用DMEM培养基培养），地塞米松诱导组（培养基中加入地塞米松、β-甘油磷酸钠和维生素C），维甲酸诱导组（培养基中加入维甲酸），地塞米松与维甲酸联合诱导组（培养基中加入地塞米松、β-甘油磷酸钠、维生素C和维甲酸）。③通过倒置相差显微镜对细胞的形态进行观察；于第4，6，8，10，12天定量检测其分泌的碱性磷酸酶；应用原位杂交技术检测Ⅰ型胶原的表达情况。结果：①原代和传代培养时不同组别兔骨髓基质细胞的生长情况：地塞米松诱导组细胞形态向类成骨细胞转化，维甲酸诱导组细胞与神经干细胞类似，地塞米松与维甲酸联合诱导组细胞与地塞米松诱导组细胞形态变化大体一致，但细胞更饱满，多角形细胞比例更高，部分区域细胞呈现漩涡状分布。②各组碱性磷酸酶活性检测结果：非诱导组碱性磷酸酶表达量低，随时间略有增加；地塞米松诱导组碱性磷酸酶表达呈曲线升高[6，8．10，12d依次为（265．9&;#177;47．3），（445．4&;#177;69．4），（650．3&;#177;52．0），（703．6&;#177;62．5）nkat／L]；维甲酸诱导组基本无碱性磷酸酶表达；地塞米松与维甲酸联合诱导组碱性磷酸酶表达趋势与地塞米松诱导组相似，但绝对值有所增高[6，8，10，12d依次为（355．4&;#177;62．2），（631．3&;#177;84．4），（925．0-69．0），（1039．5&;#177;85．2）nkat／L]。（固各组原位杂交技术检测Ⅰ型胶原结果：地塞米松诱导组和地塞米松、维甲酸联合诱导组检测Ⅰ型胶原结果发现胞浆内可见大量棕黄色颗粒，非诱导组与维甲酸诱导组为阴性。结论：适当浓度地塞米松可成功的将兔骨髓基质细胞向成骨细胞诱导，维甲酸与地塞米松联合诱导可使成骨能力进一步加强，表现为碱性磷酸酶表达明显增高，并表达Ⅰ型胶原，具体浓度条件有待进一步研究。