乙酰肝素酶在头颈部鳞状细胞癌的表达及其临床意义

目的探讨乙酰肝素酶（heparanase，HPSE）在头颈部鳞癌的表达与临床病理特征及预后的关系。方法对62例头颈肿瘤手术切除标本进行检测，采用免疫组化技术检测HPSE在原发肿瘤组织及其淋巴转移灶中的表达，分析HPSE的表达同患者的年龄、临床分期、病理分级、有无淋巴转移及与预后的关系。结果HPSE在癌旁黏膜组织中不表达或少表达，在大多数头颈肿瘤组织中呈阳性表达，阳性表达率为69．3％（43／62），主要为胞质表达。HPSE的表达在患者的年龄、肿瘤的病理分级方面比较，差异无统计学意义（Х^2=0．05，Х^2=3．84，P值均〉0．05）；而在有无淋巴转移以及肿瘤的临床分期方面差异有统计学意义（Х^2=3．98，Х^2=8．06，P值均〈0．05）；HPSE在原发灶及其淋巴转移灶中的表达之间呈明显正相关（r=0．9162，P=0．001）；Kaplan—Meier法计算，HPSE阳性组的3年累积生存率为25．9％，HPSE阴性组的3年累积生存率为72．7％，二者差异有统计学意义（Х^2=11．607，P=0．001）。HPSE的表达和肿瘤的TNM临床分期分别为影响预后的独立因素，二者分别与患者的预后显著相关（Х^2值分别为16．86和19．73，P值均〈0．05）。结论HPSE在头颈鳞癌中表达显著增高。HPSE的表达与有无淋巴转移、肿瘤的临床分期密切相关。HPSE的表达、肿瘤的临床分期是影响患者预后的独立因素。     

低氧对人喉癌Hep-2细胞增殖及凋亡的影响

目的：探讨低氧对喉癌Hep-2细胞增殖及凋亡的影响。方法：模拟人体实体肿瘤低氧环境,应用MTT法检测低氧组与常氧组6、12、24、36h细胞增殖率,流式细胞学方法检测低氧组与常氧组6、12、24、36h细胞凋亡率。结果：常氧与低氧细胞增殖率随时间延长均呈逐渐升高趋势;常氧组与低氧组6、12、24、36h各时间点下比较于24h差异有统计学意义（P〈0.01）。低氧组细胞凋亡率于6、12、24h较常氧组低（P〈0.01）,于36h较常氧组高（P〈0.05）。结论：低氧可促进细胞增殖,且细胞增殖率可随时间延长逐渐增高。低氧能够抑制细胞凋亡,但持续缺氧还可以促进细胞凋亡。     

乙酰肝素酶与头颈肿瘤

对乙酰肝素酶的发现、基因定位、蛋白质结构、生物学作用、在肿瘤浸润转移、血管生成的影响以及在头颈肿瘤研究中的进展进行综述，对乙酰肝素酶抑制剂研究做一简单概述。     

乙酰肝素酶与头颈肿瘤

对乙酰肝素酶的发现、基因定位、蛋白质结构、生物学作用、在肿瘤浸润转移、血管生成的影响以及在头颈肿瘤研究中的进展进行综述,对乙酰肝素酶抑制剂研究做一简单概述。     

低氧对Hep-2细胞肿瘤干细胞特性和化疗抵抗的影响及其作用机制

目的 探讨低氧对Hep-2细胞肿瘤干细胞特性和化疗抵抗的影响,并分析其相关机制.方法 构建针对低氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible factor 1 alpha,HIF-1α)的短发夹RNA重组质粒,转染Hep-2细胞,经筛选建立HIF-1 α基因敲除的Hep-2细胞并检测HIF-1α表达的变化;观察低氧条件培养的Hep-2细胞增殖、克隆形成、细胞周期、凋亡及CD133表型等细胞生理学特性变化;流式细胞仪分选CD133+细胞,观察CD133+细胞克隆形成及顺铂杀伤情况,并检测相关基因Oct-4、p53及survivin表达变化.用方差分析及两样本均数比较的t检验进行统计分析.结果 成功建立HIF-1α基因敲除Hep-2细胞,HIF-1 α在mRNA和蛋白水平上的表达明显下调;低氧培养Hep-2细胞具有较高的增殖活性及克隆形成能力,凋亡率降低,细胞周期GO/G1期阻滞、CD133表达升高,而HIF-1α基因敲除后上述变化减弱;成功分选出Hep-2细胞中的CD133+细胞,CD133+细胞克隆形成能力高、顺铂杀伤抗性强,而HIF-1α基因敲除后上述能力降低,并出现Oct-4表达下调,p53表达上调,survivin表达下调.结论 低氧能够诱导和强化Hep-2细胞的肿瘤干细胞特性,增强CD133+细胞的增殖分化和化疗抵抗能力,其作用机制可能与HIF-1α及其诱导的相关基因表达变化相关.     

紫杉醇对人喉癌细胞系Hep-2的抑制作用研究

目的：通过体外实验评价紫杉醇对人喉癌细胞系Hep-2的抑制作用。方法：应用人喉癌细胞系Hep-2，将细胞暴露于不同浓度紫杉醇下，分别于6、12、24、48、72h收集标本，进行细胞形态观察；流式细胞仪细胞周期分析；MTT法检测细胞生长情况，绘制细胞生长曲线；应用琼脂糖凝胶电泳进行检测和观察。结果：人喉癌细胞系Hep-2在紫杉醇的作用下，细胞分裂阻滞在分裂期的中期，并诱导细胞发生凋亡；凋亡细胞表现为细胞固缩，核染色质凝聚或者断裂；细胞DNA裂解片段呈现典型的“阶梯状”排列的条带；紫杉醇对Hep-2的细胞毒性与剂量和时间有依赖关系。结论：紫杉醇诱发人喉癌细胞凋亡与细胞分裂期阻滞密切相关，随浓度和时间延长，G2／M期细胞的比率也增高。     

Hep-2细胞MDR1基因蛋白的表达

采用单克隆抗体免疫荧光技术对Hep－2细胞MDR1基因的表达产物蛋白定量测定，结果证实p－170蛋白高度表达，旨从分子生物学角度探讨喉癌细胞的多药耐受性。     

RNA干扰介导的PIK3CA基因沉默抑制Hep-2细胞增殖和侵袭力

目的观察RNA干扰介导PIK3CA基因表达沉默对喉鳞状细胞癌（简称喉癌）细胞增殖和侵袭力的影响,探讨PIK3CA基因作为喉癌基因治疗靶标的可行性。方法构建PIK3CA-shRNA的慢病毒表达载体,在脂质体介导下转染人喉癌细胞Hep-2。采用real-time RT-PCR和Western-blot检测PIK3CA基因的表达,MTT法、细胞克隆形成实验、细胞生长曲线检测细胞生长增殖,Boyden小室模型检测细胞的体外侵袭力。结果表达PIK3CA-shRNA的慢病毒载体构建成功;与对照组相比,实验组细胞PIK3CA mRNA和蛋白表达明显下调,分别达75％和70％（P〈0．05）;细胞增殖和侵袭力均受到明显抑制,差异显著（P〈0．05）。结论靶向PIK3CA基因的RNA干扰可抑制喉癌细胞的增殖和侵袭力,PIK3CA有望成为喉癌基因治疗的新的候选基因。     

人喉癌Hep-2细胞膜钾离子通道与RNA编辑酶1的相关性

目的研究人喉癌细胞系Hep-2细胞膜钾离子通道特性及其与RNA编辑酶1(RNA-dependent adenosinedeaminase1,ADAR1)的相关性.方法以Hep-2细胞为研究对象,采用穿孔膜片钳全细胞记录法研究钾离子通道特性,用逆转录聚合酶链反应检测四乙胺(tetraethylammonium,TEA)阻断钾离子通道前后Hep-2细胞ADAR1 mRNA的表达.结果 Hep-2细胞膜的静息膜电位为(-29.8±1.9)mV,在钳制电压-40 mV,阶跃电压在-80～ 80 mV,记录到一种跨膜电流,该跨膜电流具有电压依赖、外向整流特性,该电流在延迟25ms后最大激活,800 ms内不失活,可被阻断剂TEA阻断.Hep-2细胞钾离子通道被TEA阻断前后ADAR1mRNA相对表达量存在显著性差异.结论 Hep-2细胞膜上存在延迟整流钾离子通道,此钾离子通道可能和ADAR1 mRNA的表达密切相关.     

人喉癌Hep-2细胞株CD133+肿瘤干细胞生物学特性研究

目的 研究喉癌Hep-2细胞株中CD133+肿瘤细胞的干细胞特性及其生物学特性.方法 流式细胞仪分选Hep-2细胞株中CD133+肿瘤细胞,Transwell法检测CD133+肿瘤细胞侵袭能力及三代克隆形成能力;CD133+肿瘤细胞与紫杉醇共培养,10 Gy的直线加速器照射CD133+肿瘤细胞,四甲基偶氮唑蓝法计算其相对存活率和生长抑制率,观察其放化疗抵抗性.结果 CD133+细胞比例为3.1％±0.2％,流式细胞仪分选纯度可达90.2％±5.5％,分选后的CD133+细胞贴壁,呈团块状、克隆球状生长.增殖速度明显较CD133-细胞快;Transwell实验中,相同视野CD133+细胞穿膜细胞数(526±39)个/每视野,而CD133-细胞为(220±20)个/每视野,二者差异有统计学意义(t=22.08,P＜0.01);CD133+细胞三代克隆形成率分别为30.0％±4.7％、32.2％±3.6％、32.7％±3.4％,CD133-细胞三代克隆形成率分别为15.2％±2.2％、12.0％±2.5％、13.8％±3.3％,同代比较差异有统计学意义(t值分别为8.99、14.66、12.69,P值均＜0.01).在紫杉醇共培养体系中,CD133+细胞24 h、48 h、72 h的相对存活率分别为90.1％±5.9％、85.1％±7.1％、70.3％±6.4％,均高于同时期对照组CD133-细胞(t值分别为5.24、8.18、8.14,P值均＜0.01);放射线照射后,CD133+细胞生长抑制率30.0％±7.1％,显著低于CD133-细胞的55.0％±6.3％(t=8.30,P＜0.01).结论 CD133+ Hep-2细胞所占比例较小,具有强的增殖、侵袭能力及克隆形成能力,对放化疗有抵抗性,具有干细胞特性.靶向CD133+肿瘤细胞,有望有效杀伤喉癌干细胞.     

金丝桃素联合放射线照射对喉癌细胞Hep-2的影响

目的：探讨金丝桃素（HY）联合放射线照射对喉癌细胞Hep-2的影响。方法：体外培养的喉癌细胞Hep-2分别给予0、1、2、3Mg／ml终浓度的HY,加药1h后,给予5Gy的放射线照射（HY加放射组）;另取喉癌细胞Hep-2分别给予5、10、20、25μg／ml终浓度的HY,不给予放射线照射（单纯HY组）;各实验组均设空白对照。继续培养48h后,应用显微镜、MTT法和流式细胞仪（FCM）分析HY加放射组和单纯HY组对喉癌细胞Hep-2的影响。结果：光镜下可见喉癌细胞生长密集,细胞呈梭型或多角型,细胞彼此之间相接触,放射后的喉癌细胞主要改变为部分细胞肿胀,HY和喉癌细胞共同经放射线作用后,在HY低剂量时即可见细胞数量明显减少,肿胀细胞比例明显增多,高剂量时可见细胞坏死。MTT结果显示放射后HY可显著抑制喉癌细胞的生长;FCM分析表明放射后HY可将喉癌细胞阻滞在G0／C1期,并诱导喉癌细胞凋亡。HY单独应用,对喉癌细胞的抑制作用相对较弱。结论：HY联合放射线照射可有效地抑制喉癌细胞的增殖,并可诱导喉癌细胞凋亡。     

美洛昔康对人喉癌Hep-2细胞株作用的研究

目的探讨美洛昔康对喉癌细胞株Hep-2凋亡作用和对体外培养喉癌Hep-2细胞周期的影响及作用机制。方法应用肿瘤细胞培养技术,随机分实验组和空白对照组,培养不同时间后,用流式细胞仪检测美洛昔康对Hep-2细胞凋亡发生率及对细胞周期的影响,同时检测美洛昔康作用Hep-2细胞后细胞线粒体跨膜电位的变化。结果流式细胞仪分析显示美洛昔康呈浓度依赖性诱导Hep-2细胞凋亡,且实验组G1期细胞数明显增加,与对照组比较差异有统计学意义（P〈0.05）;实验组Hep-2细胞线粒体跨膜电位明显下降,与对照组比较差异有统计学意义（P〈0.05）。结论美洛昔康具有诱导Hep-2细胞凋亡及抑制细胞分化的作用,其机制可能与触发了线粒体凋亡途径有关。     

华蟾素对喉癌细胞株的诱导分化研究

目的研究华蟾素(Cinobutacini,CIN)对喉癌细胞的诱导分化作用.方法体外培养喉癌细胞(Hep-2)放射性同位素掺入法检测CIN对Hep-2的生长抑制作用,原位杂交方法检测c-myc(细胞核内癌基因)的表达变化.结果CIN低浓度在24小时内有促进Hep-2细胞分裂、增殖并诱导细胞分化作用;高浓度作用72小时则抑制Hep-2细胞生长.3H-脱氧胸苷(3H-TdR)掺入量检测提示,CIN短时间作用的Hep-2细胞cpm(每分钟脉冲数)值增高,而长时间作用组则cpm值下降.CIN作用48小时后,Hep-2细胞内c-myc蛋白表达较对照组低,但较平阳霉素组高.结论中药华蟾素在低浓度和时间相对较短时对人喉癌Hep-2细胞具有诱导分化作用,当作用时间超过72小时,则表现为抑制肿瘤细胞生长作用.     

金丝桃素光照对喉癌细胞Hep-2的影响

目的 探讨金丝桃素对喉癌细胞Hep-2的影响。方法 体外培养的喉癌细胞Hep-2分别加入终质量浓度为0．5、1．0、2．0、3．0、5．0μg／ml的金丝桃素，加药后1h给予照射能量为7．5J／cm^2的光照10min，另取喉癌细胞Hep-2分别加入终质量浓度为5．0、10．0、20．0、25．0μg／ml的金丝桃素，不给予光照。各实验组均设空白对照组。继续培养48h后，应用荧光显微镜、四甲基偶氮唑盐[3-(4，5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2，5-diphenyl-2H tetrazolium bromide，MTT]法和流式细胞仪检测观察金丝桃素在光照和非光照条件下对喉癌细胞Hep-2的影响。结果 光镜下可见对照组喉癌细胞生长密集，细胞呈梭型或多角型，细胞彼此之间相接触。光照后小剂量金丝桃素组可见细胞数量明显减少，随着金丝桃素剂量的增加，细胞数量明显减少，在高剂量组可见细胞坏死。MTT结果显示光活化金丝桃素呈剂量依赖性抑制喉癌细胞的生长。流式细胞仪分析表明金丝桃素经光照后，可将喉癌细胞阻滞在G0-G1期，并诱导喉癌细胞凋亡；吖啶橙染色可见细胞胞膜出芽、染色质凝集、核片段化及凋亡小体等典型的细胞凋亡特征。金丝桃素单独应用，对喉癌细胞的抑制作用相对较弱。结论 金丝桃素经光照后，可有效抑制体外培养的喉癌细胞的增殖，并可诱导喉癌细胞凋亡。     

塞来昔布对人高转移性鼻咽癌CNE-2Z细胞侵袭力的影响

目的 研究塞来昔布(Cox-2选择性抑制剂)对人鼻咽癌CNE-2Z细胞侵袭力的影响及其相关机制.方法 用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测不同浓度塞来昔布对鼻咽癌CNE-2Z细胞增殖的影响.不同浓度塞来昔布作用鼻咽癌CNE-2Z细胞24 h后,Transwell小室检测细胞侵袭力的改变;免疫细胞化学检测肿瘤细胞中E钙黏素蛋白表达变化,反转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测细胞中Cox-2和E钙黏素mRNA表达变化.结果 塞来昔布明显抑制CNE-2Z细胞存活率,呈明显的浓度依赖性,24 h后25、50、100 μmol/L塞来昔布组细胞存活率(-x±s,下同)分别为(94.75±1.34)%、(91.77±2.70)%、(64.54±1.20)%,48 h后细胞存活率分别为(88.41±1.28)%、(78.84±1.56)%、(52.46±2.25)%,50%抑制浓度(IC50)为100 μmol/L,同一时间点细胞存活率差异有统计学意义(F值分别为462.204和1328.306,P值均＜0.01).0、25、50 μmol/L塞来昔布作用鼻咽癌CNE-2Z细胞24 h,侵袭实验显示穿膜细胞数(-x±s,下同)分别为(263.7±13.5)个、(185.3±8.7)个、(144.0±8.2)个,用药组穿膜细胞数明显减少,组间差异有统计学意义(F=102.089,P＜0.01).免疫细胞化学结果显示,0、25、50μmol/L塞来昔布组E钙黏素阳性表达的CNE-2Z细胞数分别为(21.7±2.6)个、(28.7±2.4)个、(40.3±1.3)个,50 μmol/L组阳性细胞数明显增多(F=78.637,P＜0.01).RT-PCR结果显示:25、50 μmol/L组Cox-2 mRNA的表达比对照组明显下降(t值分别为23.950和36.651,P值均＜0.01);25、50 μmol/L塞来昔布组E钙黏素mRNA的表达明显高于对照组(t值分别为35.829和81. 497,P值均＜0.01).结论 塞来昔布抑制鼻咽癌CNE-2Z细胞的侵袭能力,其机制可能与E钙黏素表达升高有关.     

下调组蛋白去乙酰化酶6对Hep-2细胞裸鼠移植瘤的抑制作用及其机制

目的 观察下调组蛋白去乙酰化酶6(histone deacetylation 6,HDAC6)对人喉鳞状细胞癌(简称鳞癌)Hep-2细胞裸鼠移植瘤的抑制作用并探讨其体内抗肿瘤机制.方法 将喉鳞癌Hep-2细胞注射入裸鼠皮下,1周后裸鼠荷瘤模型建成.将裸鼠分为3组进行治疗,即空白对照组、空载体组和HDAC6小干扰RNA( siRNA)组,监测肿瘤生长变化.采用免疫组织化学法检测不同组别裸鼠移植瘤瘤体内Ki-67增殖情况的变化.采用Western blot法检测转染HDAC6前后不同组别裸鼠移植瘤组织凋亡相关基因B淋巴细胞-2(bcl-2)及bcl相关X蛋白(bcl-associated x protein,Bax)表达的变化.采用末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记测定法(TUNEL法)检测转染HDAC6前后裸鼠移植瘤组织凋亡情况的变化.结果 HDAC6 siRNA转染荷瘤裸鼠后,与空载体组及空白对照组相比,HDAC6 siRNA组荷瘤裸鼠肿瘤体积显著下降(F =64.783,P＜0.05);原位杂交、免疫组织化学及Western blot结果表明,HDAC6 siRNA转染组裸鼠肿瘤组织中HDAC6 mRNA及蛋白表达水平均显著下调(P值均＜0.05);Western blot结果显示HDAC6 siRNA转染组裸鼠肿瘤组织中Bax蛋白表达显著上调而Bcl-2的表达则显著下调,三组间比较差异具有统计学意义(P值均＜0.05);免疫组织化学结果显示转染HDAC6 siRNA组Ki-67染色阳性细胞数显著少于空载体组及空白对照组(F=25.793,P＜0.05);TUNEL结果表明,HDAC6转染组中细胞明显发生凋亡.结论 HDAC6 siRNA能有效抑制人喉鳞癌Hep-2细胞裸鼠移植瘤的生长,并降低HDAC6和Bcl-2的表达,提高Bax的表达,为喉鳞癌的分子治疗提供了理论依据.     

角质细胞生长因子对喉癌细胞株Hep-2及细胞外调节信号激酶活性及表达的影响

目的：观察角质细胞生长因子（keratinocyte growth factor,KGF）对喉癌细胞株Hep-2增殖及细胞外调节信号激酶（extracellular signal-regulated kinase,ERK）活性和表达的影响。方法：培养喉癌细胞株Hep-2,MTT比色法及流式细胞仪测定不同浓度KGF对细胞增殖的影响;免疫沉淀法纯化蛋白并用ERK1／2试剂盒测定ERK活性;Western—blot测定p-ERK表达。结果：KGF能显著促进细胞增殖,增强ERK活性及p-ERK表达。结论：KGF可以促使喉癌细胞株Hep-2增殖,其机制与增强ERK活性及p-ERK表达有关。     

新城疫病毒对Hep-2肿瘤细胞的抑制效应

目的探讨新城疫病毒(newcastlediseasevirus,NDV)对Hep-2肿瘤细胞的杀伤效应及其免疫刺激作用。方法采用考马斯亮兰染色法观察NDV感染对Hep-2肿瘤细胞细胞骨架的影响。运用甲基噻唑基四唑(methylthiazolyltetrazolium,MTT)染色法检测NDV感染致Hep-2肿瘤细胞死亡的杀伤率。通过免疫荧光结合流式细胞仪(flowcytometer,FCM)检测Hep-2肿瘤细胞表面主要组织相容性复合体Ⅰ类分子(majorhistocompabilitycomplexclassImolecules,MHC-I)的表达情况。另外,分离人外周血淋巴细胞(peripheralbloodmononuclearcells,PBMC)作为效应细胞,以NDV感染的Hep-2肿瘤细胞作为靶细胞,同时设空白细胞对照,通过特异性细胞毒T淋巴细胞实验,探讨NDV所介导的抑瘤作用。结果NDV可致Hep-2肿瘤细胞的细胞骨架发生改变,对体外培养Hep-2肿瘤细胞的杀伤率达77.7%,可上调其表面MHC-I类分子的表达,并且能够刺激增强人外周血淋巴细胞中肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxicTlymphocyte,CTL)活性,杀伤率为23.54%。结论NDV可有效杀伤Hep-2肿瘤细胞,并刺激产生特异性抗肿瘤免疫反应。