人血布鲁菌的分离培养及PCR鉴定

目的:初步建立布鲁菌的PCR检测技术。方法:对疑似布病患者血液进行采样培养,提取菌落DNA,通过16S rDNA基因引物和布鲁菌通用引物进行PCR扩增,琼脂糖凝胶电泳检测结果。结果:样品的16S rDNA扩增产物为1 500 bp,IS711基因扩增产物为63 bp,可以确认病人血液中含有布鲁菌。结论:细菌的分离培养结合PCR方法检测在布病的诊断中具有良好的应用前景。     

PCR法检测血液中白色念珠菌的敏感性研究

目的:探讨PCR法检测血液中白色念珠菌的敏感度.方法:采用 Biospin真菌基因组DNA提取试剂盒提取白色念珠菌DNA,应用真菌通用引物ITS1和ITS4进行PCR扩增,并采用有限稀释法推测PCR法可检测到的全血中最低白色念珠菌数目.结果:以白色念珠菌DNA为模版,用PCR法扩增得到约为500 bp左右的特异性条带;...     

长沙人间布鲁菌分离株omp25基因扩增和系统进化分析

目的了解长沙地区人间布鲁菌omp25基因的序列特征并阐明其系统进化关系,为布鲁菌病防控以及omp25基因克隆与表达研究提供参考。方法根据Gen Bank公布的羊种布鲁菌16M的omp25基因序列设计1对PCR引物,采用PCR法从长沙地区布鲁菌分离株基因组中扩增omp25基因,产物用凝胶电泳进行分析后进行双向核苷酸序列测定,测序结果用DNAstar 7.1进行分析,将测序结果提交Gen Bank,并利用Mega 7软件构建布鲁菌长沙分离株系统进化树。结果 41株布鲁菌成功扩增出omp25基因片段,片段长度约640 bp,通过测序后Blast同源性分析,证实41株菌株均为羊种布鲁菌,长沙分离株与10株羊种布鲁菌序列100%相同,进化树显示长沙分离的布鲁菌和国内外羊种布鲁菌位于同一进化分支上,同广西的LA1105参考株亲缘关系最近。结论长沙地区人间布鲁菌分离株omp25基因序列与参考菌株序列同源性高,且与羊种布鲁菌在同一分支,表明omp25基因序列是一个保守序列。该研究结果可为布鲁菌的分子生物学鉴定和诊断试剂的研制提供参考。     

DNA微条形码技术在降解检材种属鉴定中的应用及法医学意义

【立题依据】 标准DNA条形码技术是基于COI基因序列分析而建立的一种物种鉴定方法,但由于目的基因扩增片段长达645bp,在法医物证降解检材中的应用受到限制。因此,本研究拟建立DNA微条形码技术,以解决法医物证特殊检材种属鉴定的难题。 【设计思路】 设计分别扩增不同近缘动物COI基因的通用引物,构建相应的复合扩增体系,并从种属特异性、林敏性、稳定性、案件适应性等方面进行验证。 【实验内容】 DNA提取及处理:有机溶剂法提取实验样本的基因组DNA;制备DNA<200bp的降解检材和两种动物DNA不同比例混合的混合检材。引物设计与合成:设计4对种属特异性引物和1对无种属特异性的ND3引物,并合成COI基因的标准引物。PCR扩增:①以10种动物基因组DNA为模板,分别用自行设计的4对引物进行扩增,以检验引物种属特异性;②以10种动物不同浓度基因组DNA为模板,分别用对应种属特异性的引物进行扩增,以检验引物扩增效能;③以降解检材基因组DNA为模板,分别用自行设计引物和标准引物进行扩增,以评估引物应用价值。PCR复合扩增:在确定自行设计引物特异性、扩增灵敏度的基础上,通过调整引物量和退火温度构建含有5对引物的复合扩增体系,并用于单一样本和混合样本基因组DNA的扩增。扩增产物检测:用聚丙烯凝胶电泳结合银染的方法检测各种动物模板DNA的扩增效果,以判定引物的扩增特异性和灵敏度,及降解检材和混合检材的扩增效果;用循环测序的方法获得各扩增产物的碱基序列,并通过BLAST软件与DNA数据库比对及遗传距离分析,判定检材的种属来源。 【实验材料】 常见家禽(鸡、鸭、鹅、鹌鹑、鸽子)和常见家畜(水牛、黄牛、山羊、绵羊、马、驴、犬)共7科18种动物及人类血液样本各5例。 【可行性】 (1)不同种属动物COI基因序列可从相应DNA数据库获得;(2)熟练掌握引物设计的操作方法和PCR技术;(3)具备本研究所需的各种仪器、设备和试剂。 【创新性】 为法医物证降解检材的种属鉴定提供一种有效的方法。     

泉州市6例布鲁菌病的微生物生化鉴定及分子生物学确认

目的 验证布鲁菌的微生物鉴定和PCR检测结果的一致性. 方法 利用全自动细菌鉴定仪对血（骨髓）培养阳性的标本进行微生物鉴定,提取细菌DNA,应用布鲁菌通用引物BCSP31进行PCR扩增,产物进行测序. 结果 6例培养阳性的病原菌经鉴定为布鲁菌.经荧光PCR检测、测序结果在线blast分析确认为布鲁菌. 结论 细菌的分离培养结合PCR方法可以提高布鲁菌的检测.     

空肠弯曲菌套式PCR快速检测方法的建立与初步应用

目的建立套式PCR快速检测实验动物空肠弯曲菌的方法。方法根据GenBank数据库的空肠弯曲菌flaA基因设计2对引物，对空肠弯曲菌抽提DNA作PCR扩增及克隆测序。同时，对其他病原菌抽提核酸扩增，并对120份临床样品进行检测。结果空肠弯曲菌经2对引物分别扩增出1719bp和640bp片段，与预期大小一致。套式PCR检测的最低限度为10CFU。整个检测过程可在8h内完成。而其他病原菌未出现特异性扩增条带。采用套式PCR对121份临床样品进行检测，检出31份阳性，与传统的细菌分离方法完全一致。结论本研究建立的套式PCR方法具有很好的特异性和敏感性，可用于实验动物空肠弯曲菌的快速检测。     

五种生物恐怖细菌基因悬浮芯片多重检测方法的建立

目的 建立5种生物恐怖细菌的快速、高通量的基因悬浮芯片检测方法 ,即炭疽芽胞杆菌、鼠疫耶尔森菌、布鲁菌、土拉弗朗西斯菌和类鼻疽伯克霍尔德菌的多重检测.方法 针对炭疽芽孢杆菌、鼠疫耶尔森菌、布鲁菌、土拉弗朗西菌、类鼻疽伯克霍尔德菌的特异性基因序列设计6对引物和相应的特异性探针,经多重PCR扩增并用生物素标记相应的基因片段,标记的PCR产物与包被在不同编码微球上的相应探针杂交,用悬浮芯片扫描仪检测.结果 多重PCR悬浮芯片检测体系能够正确的检测和鉴定5种生物恐怖细菌,特异性好,灵敏度高,可用于恐怖样本的高通量筛查.结论 建立了多重PCR基因悬浮芯片快速检测几种生物恐怖细菌的方法 .     

基于多重PCR技术检测蜡样芽胞杆菌3种毒素基因方法的建立及评价

目的：基于多重PCR技术,建立一种快速检测蜡样芽胞杆菌nhe、cytK和entFM 3种毒素基因的方法,并评价其效能。方法：煮沸法提取蜡样芽胞杆菌DNA,以蜡样芽胞杆菌nhe、cytK和entFM特异性毒素基因作为靶基因,采用NCBI primer-BLAST 5.0软件设计特异性引物,优化反应体系。建立三重PCR检测体系,并检测其特异性、灵敏度和稳定性。结果：煮沸法提取蜡样芽胞杆菌DNA,浓度为227 mg·L^-1,纯度为1.50～1.60。采用多重PCR体系同时检测蜡样芽胞杆菌3种毒素致病基因,于退火温度56℃时,蜡样芽胞杆菌基因引物nhe499的扩增片段为499 bp,基因引物cytK191的扩增片段为191 bp,基因引物entFM363的扩增片段为363 bp。PCR体系扩增蜡样芽胞杆菌3种毒素基因后条带清晰明亮,且无非特异性条带,与金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌和铜绿假单胞菌均无扩增,表明蜡样芽胞杆菌基因引物nhe499、cytK191和entFM363特异性强;3种引物在同一反应体系中互不干扰。灵敏度检测,多重PCR体系最低检测限可同时达到10^...     

云南省1例输入性三日疟实验室检测分析

目的对云南省1例输入性疟疾患者的血样进行实验室检测分析。方法采用疟原虫属特异性引物和种特异性引物对该样本进行巢式PCR检测,将PCR扩增结果进行序列测定,并对获得的序列进行Blast比对,分析其分子性状。结果使用疟原虫属特异性引物r PLU5和r PLU6对血样进行PCR检测,第一轮未扩增出预期条带;使用疟原虫种特异性引物对血样进行PCR检测,扩增出预期大小约141bp的三日疟条带,无对应大小的恶性疟、间日疟和卵形疟扩增条带产生。序列分析表明,扩增片段长度为115bp,进行Blast比对发现,与Genbank中注册编号为gb|KJ934253.1的三日疟对应部分的基因序列同源性为96%。结论通过使用巢式PCR、序列测定分析等方法,基本证实该病例为三日疟原虫感染。     

LAMP和PCR法检测痢疾志贺菌的特异性和灵敏性比较

目的建立环介导等温扩增技术(LAMP)快速检测痢疾志贺菌,并对其特异性、灵敏度与传统PCR进行比较。方法以痢疾志贺菌侵袭性质粒抗原H基因(ipaH)为靶序列,设计6条特异性引物(内引物、外引物和环引物各2条),优化LAMP反应体系及反应条件,检测LAMP反应的灵敏度、特异性及模拟样品,同步与PCR进行比较。结果 LAMP法和PCR均能特异性地扩增出志贺菌靶DNA,而其他非志贺菌均未扩增出特有条带。检测细菌纯培养物和模拟食品的灵敏度LAMP法分别为5.3×101cfu/ml、6.8×101cfu/ml,PCR法分别为5.3×102cfu/ml和6.8×102cfu/ml。结论利用LAMP技术,可快速、灵敏、简便地检测痢疾志贺菌,与PCR方法比较,特异性强、操作简便、检测成本低、耗时短,有望发展成为快速检测痢疾志贺菌的有效手段。     

1996～1997年江西省南昌地区流感监测

为了监测流感动态确定优势病毒株,在江西省南昌地区进行了流感病毒分离和鉴定研究。从1996年5月～1997年4月共采取感冒病人鼻咽拭子1440份,全部用双腔接种法接种鸡胚,部分标本又进行细胞培养。采用血凝抑制试验（HAI）鉴定病毒株的型及亚型,对细胞培养获得的20株病毒同时应用间接免疫荧光试验（IFA）鉴定病毒株的型别,取HAI法检测为甲型的任意20株进行多聚酶链反应（PCR）试验。结果：共分离得流感病毒47株,其中,甲1型（H1N1）26株,占55．32％;甲3型（H3N2）10株,占21．28％;乙型（B）11株,占23．4％,优势流行株是甲1型,发现了甲1、甲3、乙型在同一地区同时流行的现象,也发现了“O”相毒株。因流感病毒的变异均局限在量变范围内,预计短期内没有大流行的危险。IFA法PCR试验结果全部与HAI法一致,故结论可靠,IFA、PCR法也是快速准确鉴定流感病毒的好方法。     

NDM1基因常规PCR与荧光定量PCR检测方法的建立及其检测结果比较

目的：建立NDM1基因常规PCR和荧光定量PCR（FQ-PCR）检测方法,并对其检测结果进行比较。方法：设计3对NDM1基因常规PCR与FQ-PCR引物,建立常规PCR与FQ-PCR反应体系和条件,比较2种检测方法的特异性、灵敏度和对模拟临床样品的检测效果。结果：成功建立NDM1基因常规PCR和FQ-PCR检测方法;特异性检测,常规PCR与FQ-PCR检测7种常见病原菌均为阴性;灵敏度检测,常规PCR检测限为10⁶ mL^-1 ,FQ-PCR检测限为10⁴ mL^-1;模拟临床样品检测,常规PCR和FQ-PCR检测结果一致。结论：常规PCR与FQ-PCR均有很好的特异性,FQ-PCR灵敏度比常规PCR高100倍。     

双重实时荧光PCR检测副溶血性弧菌和创伤弧菌方法的建立

目的建立双重实时荧光PCR检测副溶血性弧菌和创伤弧菌的方法。方法在Gen Bank数据库查找序列并比对后设计tdh和vvh A基因引物和探针。对PCR反应退火温度、引物、探针、Mg2+、Taq DNA聚合酶及d NTPs浓度进行优化,确定反应体系和反应条件,并对新建方法的特异性、灵敏度等方面进行分析,对模拟样品进行检测。结果建立了双重实时荧光PCR检测副溶血性弧菌和创伤弧菌的方法。该方法的特异性较好,检测限为103 CFU/ml。结论建立的双重荧光PCR方法可快速、灵敏、特异地检测副溶血性弧菌和创伤弧菌。     

巢式PCR扩增诊断播散性毛孢子菌病的动物实验研究

目的探讨应用PCR技术诊断播散性毛孢子菌病的可行性.方法建立动物模型后,于接种3、7、14 d分别采集小鼠眶静脉血和肝脏组织标本,进行真菌培养和巢式PCR扩增.结果小鼠静脉接种3、7、14 d后血清培养的阳性率分别为0、20%、0,而巢式PCR的阳性率分别为80%、90%、88.9%;在上述时相点,肝脏组织真菌培养阳性率分别为50%、40%、22.2%,而巢式PCR的阳性率分别为90%、90%、88.9%.血清和肝脏组织真菌培养阳性率与巢式PCR阳性率差异均具有统计学意义(P＜0.05,P＜0.01).结论巢式PCR扩增T. asahii特异性DNA片段,可作为播散性毛孢子菌病的一种特异、灵敏、快捷的早期诊断手段.     

瑞戈非尼通过CSF1-R信号通路调节肿瘤相关巨噬细胞增强PD-1抗体在结直肠癌中疗效的研究[1]

目的 探讨瑞戈非尼（Regorafenib，Reg）通过CSF1-R信号通路调节肿瘤相关巨噬细胞（Tumor-associated macrophages，TAMs）增强PD-1抗体（PD-1 antibody，anti-PD-1）在结直肠癌中的疗效，并分析其机制。方法 接种结肠癌细胞CT26于BALB/c小鼠，建立结直肠癌移植瘤模型，模型小鼠随机分为CT26组、CT26+Reg组、CT26+anti-PD-1组和CT26+Reg+anti-PD-1组，进行药物治疗后观察荷瘤小鼠移植瘤的生长情况。取肿瘤组织，通过Western Blot和免疫组化检测瘤内p-CSF1-R和CSF1-R表达，流式细胞术检测肿瘤单细胞悬液中TAMs并区分M1、M2表型。提取小鼠骨髓来源巨噬细胞（Bone marrow-derived macrophages，BMDMs），分别诱导成M1、M2型巨噬细胞，并用Reg处理细胞，qRT-PCR检测相关基因表达水平，Western Blot检测巨噬细胞表面CSF1-R蛋白表达。结果 相较于CT26组，药物处理后肿瘤体积和质量均显著减小，与单独使用Reg或anti-PD-1相比，Reg和anti-PD-1联合用药物使移植瘤的体积和重量进一步减小；Western Blot和免疫组化结果显示，Reg处理后，瘤内p-CSF1-R表达显著下调；流式结果显示Reg处理后，M2型巨噬细胞比例显著下降，M1型巨噬细胞比例显著增加；qRT-PCR结果也表明，Reg处理能增加BMDMs中M1表型比例并下调M2表型比例，同时Western Blot结果显示，Reg处理能显著下调M2型巨噬细胞表面p-CSF1-R蛋白的表达水平。结论 Reg通过CSF1-R信号通路调控TAMs，增强anti-PD-1在结直肠癌中的疗效。     

胆囊癌肝转移模型的建立和高转移细胞亚群的筛选

目的建立胆囊癌肝转移模型并通过模型筛选高转移亚群细胞,为胆囊癌肝转移研究提供良好的实验工具。方法胆囊癌GBC-SD细胞在含10％胎牛血清的RPMI1645体外培养、胰蛋白酶分离、生理盐水制备细胞悬液1×107／ml,4-6周龄裸小鼠脾脏接种建立胆囊癌转移模型;从实验动物肝转移灶中分离肿瘤细胞,经过原代、传代培养,同样的方法建立转移模型,进行第二轮和第三轮高转移表型胆囊癌细胞亚群的筛选。光镜下观察转移灶和筛选细胞的形态特征;抽提细胞与实验动物肝组织DNA,PCR扩增三对人类特异的微卫星序列。结果建立了裸小鼠胆囊癌肝脏转移模型,转移灶分布肝实质各处,但以边缘为主。左叶多受侵犯,部分全肝转移。组织学观察转移病灶为腺癌。第一轮、第二轮、第三轮出转移模型在接种后10周、7周、5周形成肉眼转移灶,转移率为60％、70％、90％。从第三轮转移灶中筛选出高转移胆囊癌细胞亚群,命名为GBC-SD／M3。与亲代细胞GBC-SD相比,所筛选的GBC-SD／M3具有相似的形态特征。GBC-SD、GBC-SD／M3在微卫星D14S68、D18S69、D20S199位点扩增产物片段完全相同,荷瘤裸鼠肝脏没有扩增出相应的产物片段。结论本实验成功建立了胆囊癌肝转移模型;从转移模型中筛选出高转移胆囊癌细胞亚群GBC-SD／M3,与亲代细胞GBC-SD相比,形态和遗传背景保留一致性,但具有更高转移能力。     

检测弓形虫的PCR法和ELISA法的比较

目的:建立快速、敏感、特异的PCR方法,用于检测弓形虫感染。方法:选择弓形虫B1基因194bp片段作为扩增模板,优化反应条件,并测定其敏感性和特异性;以104弓形虫RH株速殖子腹腔接种小鼠,用PCR法检测感染动物全血DNA,并与ELISA法检测血清IgM进行比较。结果:本实验中,PCR方法的检测阈值为0.2pg弓形虫DNA,并且与人、小鼠、疟原虫、旋毛虫等DNA均无交叉反应。用PCR法检测感染动物全血DNA,感染后第2d即可测出阳性,总阳性数为1(313/15);而ELISA法检测血清IgM则到感染后第6d才测出阳性,总阳性数为2(2/15)。经统计学检验,二者存在显著差异(P<0.05)。结论:PCR是一种快速、敏感、特异的检测方法,可用于弓形虫病的早期诊断。     

Original Article Simultaneous Detection of 13 Key Bacterial Respiratory Pathogens by Combination of Multiplex PCR and Capillary Electrophoresis

Objective Lower respiratory tract infections continue to pose a significant threat to human health. It is important to accurately and rapidly detect respiratory bacteria. To compensate for the limits of current respiratory bacteria detection methods, we developed a combination of multiplex polymerase chain reaction (PCR) and capillary electrophoresis (MPCE) assay to detect thirteen bacterial pathogens responsible for lower respiratory tract infections, including Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Moraxella catarrhalis, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Mycoplasma pneumoniae, Legionella spp., Bordetella pertussis, Mycobacterium tuberculosis complex, Corynebacterium diphtheriae, and Streptococcus pyogenes. Methods Three multiplex PCR reactions were built, and the products were analyzed by capillary electrophoresis using the high-throughput DNA analyzer. The specificity of the MPCE assay was examined and the detection limit was evaluated using DNA samples from each bacterial strain and the simulative samples of each strain. This assay was further evaluated using 152 clinical specimens and compared with real-time PCR reactions. For this assay, three nested-multiplex-PCRs were used to detect these clinical specimens. Results The detection limits of the MPCE assay for the 13 pathogens were very low and ranged from 10-7 to 10-2 ng/μL. Furthermore, analysis of the 152 clinical specimens yielded a specificity ranging from 96.5%-100.0%, and a sensitivity of 100.0% for the 13 pathogens. Conclusion This study revealed that the MPCE assay is a rapid, reliable, and high-throughput method with high specificity and sensitivity. This assay has great potential in the molecular epidemiological survey of respiratory pathogens.     

pcDNA3.1/myc-His-DJ-1M26I重组载体构建及其对NIH3T3细胞增殖和凋亡研究

目的 构建pcDNA3.1/myc-His-DJ-1和pcDNA3.1/myc-His-DJ-1M26I重组表达载体,为研究DJ-1M26I突变与细胞增殖、凋亡的关系及建立转基因动物模型奠定基础.方法 采用突变试剂盒将DJ-1蛋白第26位氨基酸进行突变,分别构建pcDNA3.1/myc-His-DJ-1和pcDNA3.1/myc-His-DJ-1M26I重组表达载体,并采用脂质体介导的方法分别将其转染入NIH3T3细胞,500 μg/mL G418压力筛选稳定克隆,对2种转染细胞在DNA水平、RNA水平和蛋白质水平进行鉴定,采用MTT染色方法和AnnexinV-FITC试剂盒进行转染阳性克隆细胞的细胞活力与细胞凋亡检测.结果 pcDNA3.1/myc-His-DJ-1和pcDNA3.1/myc-His-DJ-1 M26I重组质粒转染NIH3T3细胞经G418筛选后,PCR方法检测分别获得1个和3个阳性细胞克隆,RT-PCR及western blot方法进行DJ-1 -His基因表达检测,结果均证明外源插入基因的表达,MTT实验结果初步证明转染DJ-1M26I基因的NIH3T3阳性细胞组细胞增殖速率低于正常NIH3T3细胞组(P＜0.05),转染DJ-1基因的NIH3T3阳性细胞组细胞增殖速率与正常NIH3T3细胞相比无明显差别;细胞凋亡检测表明转染DJ-1M26I基因的NIH3T3阳性细胞组细胞凋亡率高于正常NIH3T3细胞,转染DJ-1基因的NIH3Ｔ3阳性细胞组细胞凋亡率低于正常NIH3T3细胞(P＜0.05).结论 成功构建pcDNA3.1/myc-His- DJ-1和pcDNA3.1/myc-His-DJ-1M26I重组表达载体,成功筛选出稳定表达人DJ-1及DJ-1M26I的NIH3T3细胞.DJ-1M26I基因突变更易导致NIH3T3细胞的凋亡.