移植物转染反义细胞外信号调节激酶-2基因减轻慢性移植物血管病

目的 研究转染反义ERK2基因对慢性移植物血管病的抑制作用及其机制.方法 构建含有反义ERK2基因和带有LacZ基因的腺病毒载体.以BN大鼠为供者,Lewis大鼠为受者,制作大鼠腹主动脉移植模型.ERK2组接受转染反义ERK2基因的腹主动脉移植,LacZ组接受转染LacZ基因的腹主动脉移植,对照组接受不进行处理的腹主动脉移植.移植后60 d,取各组移植血管和血清样本,以2,3-二羟基丙醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)为内参照,计算ERK2条带灰度与GAPDH条带灰度的比值(ERK2/GAPDH,即为ERK2的相对表达强度);测量移植血管内膜厚度(I)和中膜厚度(M),计算I/(I+M)之百分比;检测移植血管平滑肌细胞(VSMC)的数目和分布;检测血清血小板源性生长因子-BB(PDGF-BB)的浓度.结果 对照组、LacZ组和ERK2组ERK2/GAPDH的比值分别为1.21±0.15、1.02±0.06和0.47±0.09,后者显著低于前二者(P<0.05).对照组和LacZ组移植血管呈典型的移植物血管病表现,两组I/(I+M)比值分别为84.1%和79.9%;ERK2组移植血管呈移植动脉内膜炎表现,该组I/(I+M)比值为13.7%,显著低于前两组(P<0.05).对照组和LacZ组内膜增厚处散在分布大量VSMC,计数分别为(71.3±9.2)个和(76.4±11.3)个;ERK2组内膜处VSMC计数为(34.8±5.3)个,明显少于前两组(P<0.05).对照组和LacZ组受者血清PDGF-BB浓度分别为(1075±70)pg/ml和(1200±25)pg/ml,ERK2组为(626±27)pg/ml,ERK2组明显低于对照组和LacZ组(P<0.05).结论 转染反义ERK2基因可减轻慢性移植物血管病,并延缓其进展,其机制可能与VSMC增殖和迁移受到抑制以及PDGF-BB表达下调有关.     

非小细胞肺癌中细胞外信号调节激酶表达的意义

目的 探讨细胞外信号调节激酶ERK1和ERK2蛋白在非小细胞肺癌组织中的表达及其意义。方法 应用固定化蛋白质印迹法检测52例非小细胞肺癌及癌旁正常肺组织中ERK1、ERK2及磷酸化的ERK（P—ERK）蛋白的表达;应用免疫组织化学法分析其在细胞内的定位。结果 肺癌组织中ERK1、ERK2及P—ERK蛋白的表达水平明显高于癌旁正常组织,分别为癌旁组织的1．5、1．8和1．7倍（P〈0．01）;ERK1与ERK2蛋白表达水平呈正线性相关（r=0．64,P〈0．01）。免疫组织化学显示ERK蛋白主要位于细胞浆内。结论 ERK蛋白的过表达可能在非小细胞肺癌的发生、发展过程中起着重要的作用。     

异丙酚对小鼠海马脑片细胞外信号调节激酶ERK1/2磷酸化水平的影响

目的 观察异丙酚对小鼠海马脑片细胞外信号调节激酶ERK1／2磷酸化水平的影响。方法BALB／C小鼠，体重18～22g，雌雄不拘，迅速断头取脑，取海马用震动切片机切成450μm厚的脑片。量效实验随机将脑片分为空白对照组（C组）及不同浓度异丙酚组[10^-4mmol／L（P1组）、10^-5mmol／L（P2组）、10^-6mmol／L（P3组）、10^-7mmol／L（P4组）、10^-8mmol／L（P5组）、10^-8mmol／L（P6组）]；分别以不同浓度的异丙酚36℃恒温孵育海马脑片1h。时效实验应用5μmol／L异丙酚孵育脑片，分别于孵育即刻、1、2、5、7、9、12、15、30、60min取出脑片；取5μmol／L异丙酚孵育5min后的部分脑片，以人工脑脊液洗出异丙酚，分别于洗出2、4、7、10、25min取出脑片。应用SDS-PAGE和Westem blot生化技术及Gel Doc凝胶成像系统半定量检测小鼠海马p-ERKI／2水平。结果 异丙酚能降低ERK1／2磷酸化水平，降低呈时间、浓度依赖性（P〈0．05）。随异丙酚孵育5min后洗出时间延长，ERK1／2的磷酸化水平逐渐恢复，但洗出25min时仍明显低于药物处理前水平（P〈0．01）。结论 异丙酚能显著地抑制小鼠海马脑片细胞外信号调节激酶ERK1／2磷酸化水平。     

细胞外信号调节激酶对人血管平滑肌细胞的作用及其机制

目的观察磷酸化细胞外信号调节激酶(ERK)对离体培养的平滑肌细胞增殖、凋亡和表型改变的影响。方法培养人大隐静脉平滑肌细胞,实验组培养液中加入PD98059对磷酸化ERK进行阻断后,观测平滑肌细胞的增殖活性,凋亡细胞所占比例以及细胞表型,并与对照组比较。结果实验组与对照组相比,细胞增殖活性明显低于对照组(P<0.01),电镜和荧光染色测定凋亡细胞所占比例明显高于对照组(P<0.01),电镜检测合成型细胞所占比例明显低于对照组(P<0.01),收缩型细胞所占比例较对照组明显为高(P<0.01),α肌动蛋白免疫荧光化学检测显示处理组荧光表达强于对照组。结论对离体培养的人大隐静脉平滑肌细胞磷酸化ERK进行阻断后,平滑肌细胞的增殖受抑,凋亡增加,细胞由合成型向收缩型转变。     

与人汗腺细胞共培养的人骨髓间充质干细胞表型转化中细胞外信号调节激酶通路的作用

目的观察人骨髓间充质干细胞(MSC)与热休克的人汗腺细胞(SGC)间接共培养后,其表型转化情况及细胞外信号调节激酶(ERK)通路所起的作用。方法体外分离和培养人MSC、SGC,采用二步免疫细胞化学法鉴定其均为纯化的SGC、MSC。将原代培养的SGC于47℃下行热休克处理后收集上清液。将第3代MSC作为实验对象并分组。对照组:行常规培养;SGC上清液组:采用含体积分数30％SGC上清液、体积分数1％胎牛血清、1×105U／L青霉素和0．1 g／L硫酸链霉素的DMEM／F12培养基培养;SGC上清液+表皮生长因子(EGF)组、SGC上清液+PD98059组同SGC上清液组处理后,分别添加50μg／L EGF、10μmol／L PD98059继续培养。培养7 d时用流式细胞术检测各组细胞中细胞角蛋白(CK)7、癌胚抗原(CEA)的阳性表达率,以蛋白质印迹法检测ERK和磷酸化ERK(pERK)的表达水平。结果SGC上清液组CK7、CEA阳性表达率分别为(5.76±0．10)％、(2．01±0．09)％;SGC上清液+EGF组分别为(7．31±0.21)％、(7．27+0.12)％;SGC上清液+ PD98059组分别为(1．63±0．11)％、(1．54±0．07)％。与对照组比较,前两组两项指标均明显升高(P<0.01),后一组却与之相近。各组细胞均表达ERK;但pERK水平以SGC上清液+EGF组最高,其次为SGC上清液组,SGC上清液+PD98059组和对照组几乎无表达。结论人MSC、SGC间接共培养可诱导MSC表型转化,ERK通路参与该过程并起着积极作用。     

细胞外信号调节激酶及其上游激酶在人乳腺癌发生发展中的意义

目的　研究人乳腺癌组织、良性肿瘤以及瘤旁乳腺组织中细胞外信号调节激酶 (ERK1、ERK2 )及其上游激酶 (MEK1、MEK2 )的表达 ,以及术前化疗对MEK1、MEK2、ERK1、ERK2蛋白表达的影响。　方法　应用蛋白质印迹法检测 5 6例患者乳腺癌组织、8例乳腺良性肿瘤以及相应瘤旁组织中MEK1、MEK2及ERK1、ERK2蛋白的表达情况 ,其中 16例患者术前接受环磷酰胺 ,表阿霉素加 5 氟脲嘧啶或泰素加表阿霉素方案化疗。应用免疫组织化学方法检测乳腺癌组织及癌旁组织中MEK1、MEK2及ERK1、ERK2蛋白的表达。　结果　 4 0例未行术前化疗的乳腺癌组织中MEK2、ERK1、ERK2蛋白表达水平高于癌旁组织 ,分别为癌旁组织的 4 76、1 4 8和 2 0 9倍 (t值分别为 7 2 4 4 ,5 95 9,3 735 ,P <0 0 1) ;MEK1水平低于相应癌旁组织 (t=2 2 0 6 ,P <0 0 5 ) ;未行术前化疗的乳腺癌组织中MEK2、ERK1、ERK2蛋白表达水平高于乳腺良性肿瘤 (t值分别为 2 932 ,2 0 82 ,2 0 2 1,P <0 0 5 ) ;MEK1水平低于良性肿瘤 (t=2 0 75 ,P <0 0 5 ) ;雌激素受体阴性的乳腺癌中MEK2蛋白表达水平高于雌激素受体阳性的肿瘤 (t=2 4 0 ,P <0 0 5 ) ,MEK1蛋白表达水平低于雌激素受体阳性的肿瘤 (t =2 5 8,P <0 0 1) ;术前化疗的乳腺癌组织中MEK2蛋白表达     

胫骨癌痛大鼠脊髓细胞外信号调节激酶5活性的变化

目的 评价胫骨癌痛大鼠脊髓细胞外信号调节激酶5(ERK5)活性的变化.方法 雌性未交配SD大鼠108只,体重160～ 180 9,采用随机数字表法,将其分为3组(n=36):对照组(C组)、假手术组(S组)和胫骨癌痛组(BCP组).BCP组胫骨骨髓腔内注射Walker256乳腺癌细胞混悬液制备大鼠胫骨癌痛模型;S组胫骨骨髓腔内注射等容量生理盐水;C组不作任何处理.于接种前1d、接种后3、5、7、14和21 d时,测定机械痛阈.C组和S组于接种后21 d痛阈测定结束后随机处死6只大鼠,BCP组分别于接种后3、5、7、14和21 d痛阈测定结束后随机处死6只大鼠,取脊髓组织,采用Westernblot法测定脊髓背角磷酸化ERK5(p-ERK5)、ERK5和Fos蛋白的表达.结果 C组和S组各时点机械痛阈、脊髓背角p-ERK5、ERK5和Fos蛋白的表达差异无统计学意义(P＞0.05).与C组和S组比较,BCP组接种后7-21 d时机械痛阈下降,接种后5-21 d时脊髓p-ERK5和Fos蛋白表达上调(P＜0.05),ERK5表达差异无统计学意义(P＞0.05).结论 大鼠胫骨骨髓腔内注射肿瘤细胞可能通过增强脊髓ERK5活性,导致其下游Fos蛋白的释放,从而诱发骨癌痛.     

细胞外信号调节激酶激酶5在膀胱尿路上皮癌中的表达及与其预后的相关性

目的 检测细胞外信号调节激酶激酶5（MEK5）在膀胱尿路上皮癌（BUC）中的表达情况,并探讨与其预后的相关性。方法 选取2016年1月至2017年12月本院收治的113例膀胱癌患者的临床资料,术中收集癌灶组织113例,癌旁组织70例,记录患者性别、年龄、肿瘤数目、肿瘤大小、病理分级、临床分期、淋巴结转移等信息。采用免疫组织化学法检测组织中MEK5表达情况,比较癌灶组织与癌旁组织MEK5表达的差异,并分析其与BUC患者临床病理特征的关系;采用乘积极限法（Kaplan-Meier）分析BUC患者24个月的预后状况,并采用Log Rank检验进行显著性比较;采用Cox模型分析BUC患者不良预后的影响因素。结果 与癌旁组织相比,癌灶组织的MEK5阳性表达率较高（P<0.05）;BUC组织中MEK5表达与性别、年龄、肿瘤数目、肿瘤大小均无相关性（均P>0.05）,与病理分级、临床分期、淋巴结转移均有相关性（均P<0.05）;与MEK5阴性表达相比,MEK5阳性表达的终点事件发生率较高（39.13% vs. 68.66%,P=0.002）,无进展生存期较低（21.512个月vs. 19.294个月,P=0.001）;MEK5阳性表达、肿瘤直径≥3 cm、高级别病理分级、T2～T4期、伴淋巴结转移均是影响BUC患者预后的独立危险因素（P<0.05）。结论 BUC患者癌灶组织中MEK5阳性表达率较高,与患者临床病理特征密切相关,可为评估患者病情及预后提供临床参考依据。     

细胞外信号调节激酶在胃癌中的过表达与胃癌的恶性潜能相关

目的 探讨胃癌中细胞外信号调节激酶ERK－1和ERK－2蛋白的表达与活性及其与胃癌临床病理因素的关系。方法 用固定化蛋白质印迹法检测42例胃癌及邻近正常胃粘膜中ERK-1和ERK－2蛋白及磷酸化ERK（P－ERK）的表达;免疫组织化学法分析其在细胞内的定位。结果 胃癌中ERK－1和ERK－2的蛋白表达水平明显高于正常胃粘膜（P＜0．01） ;ERK蛋白表达水平与肿瘤大小及组织学分化无关（P＞0．05）;Ⅲ、Ⅳ期胃癌中ERK－1和ERK－2蛋白表达水平高于Ⅰ、Ⅱ期胃癌（P＜0．05）;有淋巴结转移胃癌中ERK－1和ERK－2蛋白表达水平高于无淋巴结转移胃癌（P＜0．05）;侵犯浆膜胃癌中ERK－1和ERK－2蛋白表达水平高于无浆膜侵犯的胃癌（P＜0．05）;ERK－1与ERK－2蛋白在胃癌中的表达阳性呈正相关（r=0.550,P＜0．01）。ERK－1和ERK－2的蛋白表达水平与P－ERK表达水平一致。ERK蛋白主要表达于细胞浆,胃癌组织中的表达量明显高于癌旁正常胃粘膜。结论 ERK－1和ERK－2蛋白的过表达可能在胃癌的发生发展过程中发挥重要作用,与胃癌TNM分期、浆膜侵犯及淋巴结转移有关。     

反义细胞外信号调节激酶-2基因治疗移植物动脉血管病内膜病变

目的 观察移植物动脉血管病(TA)的内膜病变机制和反义细胞外信号调节激酶2基因腺病毒载体(Adanti-ERK2)基因治疗的效果.方法 建立Brown-Norway(BN)-Lewis移植物动脉血管病模型,分为同系组、Control组、LacZ组和Adanti-ERK2组(给予5×109 pfu Adanti-ERK2基因治疗),每组各6例.术后60 d检测各组内膜病变和血管腔内膜/(内膜+中膜)比,α-肌动蛋白(α-actin)和血小板源性生长因子-BB(PDGF-BB)染色检测移植动脉平滑肌细胞(VSMCs)增殖和分泌功能,评估移植动脉新生毛细血管情况并检测移植动脉中环氧化酶-2(COX-2)的表达.结果　术后60 d同系组内膜无异常,Control组和LacZ组典型内膜增殖改变,Adanti-ERK2组内膜病变较轻;内膜/(内膜+中膜)比各组分别为7.6%、81.4%、85.9%、15.9%;α-actin阳性细胞(内膜平滑肌细胞)每视野计数各组分别为0、71.3±9.2、76.4±11.3、34.8±5.3;PDGF-BB阳性细胞每视野计数各组分别为0.9±0.5、28.4±3.4、29.1±3.2、8.6±1.7;移植动脉中膜和内膜新生毛细血管检测各组分别无、丰富、丰富、少量;COX-2新生血管阳性细胞计数各组分别为0、36.3±8.3、40.9±9.2、10.4±3.9.Adanti-ERK2组与其他组别间比较,差异有统计学意义(P＜0.05).结论　内膜增生,血管腔缩窄,PDGF-BB诱导内膜平滑肌细胞募集分化并激发血管新生是TA重要病理生理环节,AdantiERK2基因治疗可有效干预各发病环节,达到治疗效果.

Abstract：

Objective To explore the mechanisms of intimal injury underlying transplant arteriosclerosis (TA) and to clarify the treatment effect of adenovirus-mediated anti-extracellular signal regulated kinase 2 (Adanti-ERK2) gene therapy on TA. Methods The Brown-Norway (BN)-Lewis TA model was employed. According to different gene therapy, the recipients were divided into isograft group, control group, LacZ group, which were used as control, and Adanti-ERK2 group (5 × 109 pfu Adanti-ERK2 was transferred into the graft before transplant, 6 cases in each group). The grafts were harvested on the day60 post-transplantation to evaluate the intimal injury and calculate the ratio of intima/( intima + media). The staining of α-actin and PDGF-BB was performed to analyze proliferation and secretion of vascular smooth muscle cells (VSMCs). The angingenesis was evaluated and the cyclooxygenase-2 (COX-2) staining was detected. Results The intima was normal in the isograft group but a typical intimal proliferation was observed in the control group and the LacZ group. A mild intima injury was obtained in the Adanti-ERK2 group. The ratio of intima/( intima + media) was 7.6%, 81.4%, 85.9% and 15.9% in isograft, control, LacZ and Adanti-ERK2 groups, respectively. The α-actin staining-positive cells, which indicated VSMCs, were counted per vision-field as 0, 71.3 ± 9.2, 76. 4 ± 11.3 and 34. 8 ± 5.3, respectively. The platelet derived growth factor-BB (PDGF-BB) positive cells were counted as 0. 9 ± 0. 5, 28.4 ± 3.4,29. 1 ± 3.2 and 8.6 ± 1.7, respectively. The angiogenesis was detected as none, abundant, abundant and few, and COX-2 positive cells were counted as 0, 36. 3 ± 8. 3, 40. 9 ± 9. 2 and 10. 4 ± 3.9, respectively (P ＜ 0. 05 between Adanti-ERK2 group and other groups). Conclusion Intimal proliferation, luminal narrow, VSMCs recruitment and differentiation induced by PDGF-BB in intima and the following angiogenesis are the important pathophysiological process of TA. Adanti-ERK2 gene therapy modulates the process and then ameliorates TA.     

大鼠供肾转染反义ERK2基因减缓肾移植后慢性移植肾肾病的作用及机制

目的 研究腺病毒介导的反义ERK2(A-dant-ERl(2)基因转染供肾对减缓肾移植后发生慢性移植肾肾病(CAN)的作用及机制.方法 建立大鼠间肾移植模型.按供肾移植前处理方式的不同分为对照组、空载病毒组和基因转染组,每组6只.对照组供肾灌注无菌HTK液0.5 ml,空载病毒组供肾灌注含5x109>pfu LaeZ基因腺病毒(Ad-LacZ)的HTK液0.5 ml,基因转染组供肾灌注含5x 109>pfu Adanti-ERK2的HTK液0.5 ml.肾移植术后24周行移植肾的病理学观察,免疫组织化学法观察肾小管上皮细胞表面标志蛋白E-Cadherin、Vimentin、TβRⅠ的表达以及CD4+、CD8+T淋巴细胞和ED-1+细胞的浸润情况;酶联免疫法检测受者血清中转化生长因子β1>(TGF-β1>)的含量.结果 肾移植术后24周,对照组和空载病毒组移植肾呈CAN表现;肾小球硬化,肾小管萎缩明显,伴严重间质纤维化以及明显的CD4+、CD8+T淋巴细胞和ED-1+细胞浸润;病变区肾小管上皮细胞E-Cadherin表达减少,Vimentin、TβRⅠ表达显著增多.基因转染组移植肾间质内仅有少量CD4+、CD8+T淋巴细胞和ED-1+细胞浸润;肾小管上皮细胞E-Cadherin表达正常.对照组和空载病毒组血清中TGF-β1>,含量明显高于基因转染组.结论 Adanti-ERK2基因转染移植肾可减缓CAN的发生,对移植肾具有保护作用.这种保护机制可能与减少炎症细胞的浸润、下调TGF-β1>,等致纤维化因子的表达以及抑制肾小管上皮细胞向间充质细胞的转化有关.     

右美托咪定对大鼠离体肺缺血-再灌注损伤时ERK 1/2和Akt激活的影响

目的评价右美托咪定对大鼠离体肺缺血-再灌注损伤(lung ischemia-reperfusion injury,LIRI)时胞外信号调节激酶(ERK 1/2)和丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(Akt)激活的影响。方法成年雄性SD大鼠45只,随机分为三组:对照组(C组)、缺血-再灌注组(IR组)和右美托咪定组(DEX组),每组15只。C组大鼠离体肺在IL-2离体肺灌流系统内维持正常的生理活动,只通气和灌流150 min;IR组和DEX组大鼠离体肺在IL-2离体肺灌流系统中维持15 min后,停止通气和灌流60min后再通气和复灌75 min;DEX组复灌开始时于离体灌流液中加入右美托咪定10 nmol/L。C组和IR组分别于灌流75 min和复灌开始时在离体灌流液中加入等体积生理盐水。检测肺泡损伤率(IAR)。采用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)法测定肺组织ERK 1/2、Akt m RNA表达量,Western blot法测定磷酸化-ERK(p-ERK 1/2)、磷酸化-Akt(p-Akt)蛋白含量。结果与C组比较,IR组和DEX组IAR、肺组织ERK 1/2、Akt m RNA表达量和p-ERK 1/2及p-Akt蛋白含量均明显升高(P0.05);与IR组比较,DEX组IAR、肺组织ERK 1/2、Akt m RNA表达量和p-ERK1/2及p-Akt蛋白含量均明显降低(P0.05)。结论右美托咪定可减轻大鼠离体LIRI,其机制可能与其抑制ERK 1/2和Akt的激活有关。     

Caveolin-1下调细胞外调节蛋白激酶1/2抑制血管吻合口再狭窄

目的 探讨Caveolin-1对新西兰兔颈总动脉血管吻合口再狭窄的作用,以及与细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases,ERK)的关系.方法 40只新西兰兔,随机分为正常对照组、手术组、空转染组和Caveolin-1转染组.行左侧颈总动脉血管端端吻合,并局部转染Caveolin-1质粒(转染组)或空质粒(空转染组).于术后第7天各组中分别取5只新西兰兔血管标本,用于Western blot和逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测蛋白和mRNA的表达;其余新西兰兔于术后28 d处死取颈总动脉,通过HE染色观察内膜增生情况,用Image-Pro Plus6.0软件测量内膜与中膜面积比值(IA/MA).结果 血管HE染色后测量内膜与中膜面积比值:Caveolin-1转染组的血管内膜/中膜面积比值较手术组降低约50％;与手术组比较,转染组Caveolin-1的mRNA和蛋白的表达明显升高,差异有统计学意义(t=36.59,P＜0.01);而在高表达Caveolin-1的血管吻合口上,ERK1/2的mRNA的表达以及蛋白质的活性都显著低于手术组(t值分别为:32.64和7.28,两者均P＜0.01).结论 Caveolin-1抑制吻合口再狭窄的作用可能与调节ERK1/2的活化有关.     

瘦素对人乳腺癌细胞系MCF-7增殖的影响及其作用机制探讨

目的 观察瘦素对人乳腺癌细胞系MCF-7增殖的影响，探讨其作用机制。方法 免疫荧光检测人乳腺癌细胞系MCF-7瘦素受体（OB．Rb）的表达。于MCF-7细胞中分别加入不同浓度的瘦素（0、10、50、100、150μg／L），作用不同的时间（6、12、24h），噻唑蓝（MTr）法检测各组细胞的增殖情况，同法分别检测STAT3抑制剂AG490和ERK1／2抑制剂PD98059对瘦素刺激MCF-7细胞增殖的影响。采用免疫印迹法（Westernblot）检测瘦素（100μg／L）作用于MCF-7细胞不同时间（0、20、40、60min）STAT3和ERK1／2的磷酸化水平。结果 免疫荧光检测证实MCF-7细胞存在瘦素受体（0B—Rb）表达。瘦素能明显促进MCF-7细胞的增殖，并呈时间和剂量依赖性，于100μg／L瘦素作用24h时增殖效应最大，100μg／L组与150μg/L组差异无统计学意义（P〉0．05）；不同浓度的AG490与PD98059均可明显抑制瘦素对MCF-7细胞的增殖，随着AG490与PD98059浓度增高，抑制作用逐渐增强；MCF-7细胞经100ng／ml瘦素处理后，随时间延长STAT3和ERK1／2磷酸化程度逐渐增高，且持续至少达60min。结论 瘦素可能通过激活STAT3和ERK信号通路促进入乳腺癌细胞系MCF-7的增殖。     

急性内脏痛大鼠脊髓背角神经元ERK1/ERK2磷酸化水平的变化

目的 探讨脊髓背角神经元细胞外信号调节激酶(ERK)是否参与急性内脏痛的形成.方法 第一部分成年雌性SD大鼠30只,随机分为5组(n=6),假手术组(S组)不行宫颈扩张,UCD25组、UCD50组、UCD75组和UCD100组分别采用25、50、75、100 g的强度进行宫颈扩张10 s,10 min后处死大鼠,采用免疫组化方法测定颈段(C5～8)、胸段(T5～8)、胸腰段(T12～L2)及腰骶段(L6～S1)脊髓背角神经元磷酸化ERK1/ERK2(p-ERK1/ERK2)表达水平.第二部分成年雌性SD大鼠20只,宫颈扩张(强度为75 g)10 s,于宫颈扩张后10、30、60及120 min时分别处死5只大鼠,测定胸腰段(T12～L2)p-ERK1/ERK2表达水平.结果 与S组比较,其它各组胸腰段p-ERK1/ERK2表达上调,其中UCD75组和UCD100组最明显(P<0.05),其他脊髓段p-ERK1/ERK2表达差异无统计学意义(P>0.05).宫颈扩张后60 min时胸腰段p-ERK1/ERK2表达达高峰(P<0.05).结论 胸腰段脊髓背角神经元ERK参与了宫颈扩张诱发大鼠急性内脏痛的形成.     

Raf/MEK/ERK1/2信号通路与阴茎勃起功能关系的研究进展

阴茎勃起功能受海绵体平滑肌舒张功能的调控。在细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)信号通路研究过程中人们认识到Raf/MEK/ERK1/2信号通路与海绵体平滑肌及内皮系统功能关系密切。ERK1/2信号主要通过一氧化氮合酶(NOS)的磷酸化作用参与阴茎勃起功能的调控。目前认为,ERK1/2在勃起过程中磷酸化抑制内皮性NOS(eNOS)活性降低阴茎海绵体平滑肌(CCSMC)舒张及阴茎勃起功能,但其磷酸化抑制的作用位点尚不清楚。在CCSMC及内皮细胞中,ERK1/2信号与其他信号通路之间的相互作用从而调控阴茎勃起功能。本文总结了近年以来Raf/MEK/ERK1/2信号通路的研究进展,阐述其在勃起功能中的作用机制及各信号通路之间的相互作用,为进一步探索阴茎勃起过程的分子机制奠定基础。     

Adenovirus-mediated anti-sense ERK2 gene therapy inhibits tubular epithelial-mesenchymal transition and ameliorates renal allograft fibrosis

Purpose

Epithelial-mesenchymal transition (EMT) plays an important role in progress of renal allograft fibrosis. The adenovirus-mediated anti-sense extracellular signal-regulated kinase 2 (Adanti-ERK2) gene therapy was used to block ERK signaling pathway, and its effect on EMT and renal allograft fibrosis both in vivo and in vitro was explored.

Methods

We first generated an in vitro EMT model by connective tissue growth factor (CTGF) stimulation in a HK-2 cell culture system, and then applied Adanti-ERK2 gene therapy on it. The transition of epithelial marker (E-cadherin) to mesenchymal markers (??-SMA, Vimentin) and the cell mobility function alteration were monitored for the observation of EMT progress. In vivo, a rat renal transplant model with Fisher-Lewis combination was employed and the Adanti-ERK2 gene therapy was given. The tubular EMT changes and pathology of allograft fibrosis were examined.

Results

In vitro, Adanti-ERK2 gene therapy inhibited CTGF-induced tubular EMT and attenuated the cell motility function induced by CTGF. In vivo, Adanti-ERK2 gene therapy attenuated tubular EMT, modulated the infiltration of macrophages and CD8⁺, CD4⁺T lymphocytes, and ameliorated fibrosis effectively in the renal allografts 24 weeks after transplantation.

Conclusions

Adanti-ERK2 gene therapy inhibits tubular EMT and attenuates renal allograft fibrosis. It is possible to develop promising molecular drug(s) in the future based on ERK signaling pathway.     

ERK1/2 MAPK通路在TIMP-1抑制高糖诱导的大鼠肾小球系膜细胞凋亡中的作用

目的 探讨细胞外信号调节激酶(ERK1/2)丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)通路在基质金属蛋白酶1组织抑制剂(TIMP-1)抑制高糖诱导的大鼠肾小球系膜细胞凋亡中的作用。 方法 将人正义、反义TIMP-1用脂质体法转染大鼠肾小球系膜细胞，并将细胞分为正常对照组、未转染组、空载体组、正义转染组和反义转染组。各组细胞分别用高糖(25 mmol/L)和(或)MEK(ERK1/2通路中的MAPK激酶)特异性抑制剂PD98059(50 μmol/L)刺激24 h。应用透射电镜观察细胞内部结构变化。Western 印迹观察磷酸化(p)的ERK1/2、P90rsk、Bad及总的P90rsk、Bad、Bcl-2蛋白的表达。 结果 加入PD98059后，各组细胞内可见凋亡小体形成、细胞皱缩、核固缩、染色体边集及膜泡样突变等现象，与未转染组比较，以反义转染组最明显，凋亡细胞数目最多；正义转染组细胞形态改变不十分明显，凋亡细胞数目相对较少。此外，加入PD98059后，ERK1/2、P90rsk、Bcl-2及Bad的磷酸化明显减少(P < 0.05)，ERK1/2和P90rsk的磷酸化以正义转染组最明显(P < 0.01)；总P90rsk、总Bad表达量在各组之间无显著差异。 结论 ERK1/2 通路在TIMP-1抑制高糖诱导的大鼠肾小球系膜细胞凋亡过程中起重要作用。     

p38MAPK与 ERK1/2的协同效应及对成骨细胞分化的调控

 目的探讨骨髓间质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)向成骨细胞分化过程中 p38MAPK与 ERK1/2的协同效应及其机制。方法以成骨细胞分化添加剂诱导小鼠 BMSCs向成骨细胞分化,测定碱性磷酸酶活性和钙沉积量。检测磷酸化 p38MAPK和磷酸化 ERK1/2(p-ERK1/2)的表达水平评估通路的激活状况。以 SB203580或 PD98059阻断 p38MAPK或 ERK1/2通路,观察对成骨细胞分化的影响。以 SB203580或亚砷酸钠阻断或激活 p38MAPK通路,观察 p-ERK1/2的变化。以冈田酸抑制蛋白磷酸酯酶 2A(protein phosphatases type 2A,PP2A)活性,观察 p-ERK1/2的变化及对成骨细胞分化的影响。通过免疫共沉淀实验观察 PP2A和 ERK1/2间的结合及 SB203580对结合的影响。结果成骨细胞分化添加剂诱导 BMSCs向成骨细胞分化的过程伴有 ERK1/2和 p38MAPK通路的激活, SB203580剂量±赖性抑制成骨细胞分化,PD98059剂量±赖性增强成骨细胞分化。 SB203580使 p-ERK1/2表达增加,亚砷酸钠减弱其表达。冈田酸使 p-ERK1/2表达增加,并使成骨细胞分化受到抑制。 PP2A可直接与 ERK1/2结合,SB203580使 PP2A与 ERK1/2的结合减弱。结论 p38MAPK可通过 PP2A与 ERK1/2产生协同效应,并调节 BMSCs向成骨细胞分化。