人牙周膜成纤维细胞的体外培养及其生物学性状

采用组织块原代培养法 ,建立人牙周膜成纤维细胞有限细胞系 ,利用免疫组化方法鉴定其来源 ,观察其生长和形态特性。结果显示 ,所培养的细胞为来自中胚层的非上皮原性、非神经原性、非血管内皮原性的成纤维细胞 ,细胞倍增时间为 45.3 8h,细胞 1 2 h贴壁率为 95.3 %。染色体核型为正常人 2 3对染色体组型 ,倒置显微镜下细胞为长梭形 ,电镜下除胞浆内的各种细胞器 ,可见较多的胶原纤维束和微丝。细胞有突起 ,细胞外见较多的胶原纤维和基质。以上研究证实所培养的人牙周膜成纤维细胞来源可靠 ,可用于进一步的研究工作     

人循环成纤维细胞的体外培养和初步鉴定

自1994年Bucala等\[1\]首次确认了外周血中循环成纤维细胞这一白细胞亚群的存在后,其便逐渐成为了创伤及纤维化病变领域的研究热点。循环成纤维细胞以同时表达部分造血来源细胞（CD34、CD45RO、CD11等）和间质细胞分子（CollagenⅠ、Ⅲ等）标记为特征,可继续分化为肌成纤维细胞。此外,循环成纤维细胞还能够提呈抗原,启动炎症反应;分泌转化生长因子（TGF）-β等纤维形成因子,促进定植于组织中的成纤维细胞增殖、转化及迁移\[2-3\];分泌基质金属蛋白酶（MMPs）和血管内皮生长因子（VEGF）等血管形成因子,促进内皮细胞增殖、迁移,加快新生血管的形成\[4\]。通过以上多种作用参与创伤修复、脏器纤维化及血栓形成等病理过程。目前国内尚鲜有此方面研究。     

人肾间质成纤维细胞的培养与鉴定

目的:探讨体外培养人肾间质成纤维细胞(humanrenalinterstitialfibroblasts,hRIFs)的方法。方法:取人肾乳头组织培养,通过细胞形态、免疫细胞化学染色和右旋缬氨酸选择性培养基培养等手段进行细胞鉴定。结果:培养细胞呈梭形、单个核,表达波形蛋白,在选择性培养基内逐渐死亡。结论:该培养方法能获高纯hRIFs。     

用于修复组织缺损的人真皮成纤维细胞体外培养

目的　体外培养人真皮成纤维细胞。方法　利用胶原酶消化法培养人真皮成纤维细胞 ,然后通过细胞形态学、免疫组织化学等方法进行分析鉴定。结果　培养的细胞为长梭形 ,并表达成纤维细胞波形蛋白、Ⅰ型胶原蛋白。结论　培养出高纯度的人真皮成纤维细胞 ,可作为填充材料修复组织缺损     

人牙周膜成纤维细胞的体外培养

目的：建立人牙周膜成纤维细胞体外培养的方法。方法：采用组织块贴附法原代培养人牙周膜成纤维细胞并传代。结果：牙周膜成纤维细胞体外培养成功率为20％。5代后细胞生长旺盛。经免疫组织化学SABC法证实为来源于中胚层的成纤维细胞。结论：采用组织块贴附法培养原代人牙周膜成纤维细胞。胰酶消化传代后，生长状况良好，可作为人牙周膜成纤维细胞的实验模型。     

人皮肤成纤维细胞原代培养及生物学特性

目的 探索和建立人皮肤成纤维细胞原代培养的方法,为皮肤成纤维细胞在临床医学中的应用提供可靠的科学依据.方法 胰蛋白酶消化法分离培养人皮肤成纤维细胞;细胞生长曲线及MTT法测定细胞增殖能力;流式细胞仪测定细胞生长周期及细胞增殖指数;倒置显微镜下观察成纤维细胞生长状态;HE染色观察细胞爬片下的形态及着色;免疫组织化学染色观察成纤维细胞中间丝波形蛋白;电子显微镜下观察成纤维细胞超微结构,结果体外用胰蛋白酶消化法建立了人皮肤成纤维细胞;传5代内细胞及传5代内冻存复苏后人皮肤成纤维细胞增殖能力均很强;倒置镜下观察、HE染色、波形蛋白免疫组化染色及电镜下观察鉴定培养细胞的形态及生物学特性符合成纤维细胞.结论 本研究确立了体外人皮肤成纤维细胞原代培养.     

人皮肤成纤维细胞原代培养中组织块法及其注意事项

0引言 成纤维细胞是皮肤组织受损后的主要修复细胞.正常情况下,其处于相对静止状态,当皮肤受损或发生某些病变时,成纤维细胞表现为增生活跃和代谢旺盛[1].近年来,国内已有一些科研单位开展皮肤成纤维细胞的培养技术,以获得在体外稳定生长的正常皮肤成纤维细胞,从而为自体皮肤成纤维细胞的基因治疗和相关疾病的研究提供充足、可靠的靶细胞[2].国内各实验室在进行成纤维细胞原代培养时方法不一,多以组织块法和酶消化法为主.我们通过应用组织块法进行皮肤成纤维细胞原代培养而获得大量稳定细胞,并总结出皮肤成纤维细胞原代培养中组织块方法的注意事项,为今后进行细胞培养起到了一定的指导作用.     

不同口腔组织来源成纤维细胞的生物学特性比较

目的:初步探讨口腔不同组织来源的成纤维细胞生物学特性的差异,为深入研究口腔癌相关成纤维细胞(CAFs)的生物学行为奠定基础。方法:用组织块培养法获得原代CAFs和正常粘膜成纤维细胞(NMFs),0.25%胰蛋白酶消化传代和纯化细胞;通过形态学观察和免疫细胞化学染色对口腔CAFs和NMFs进行鉴定;采用半定量RT-PCR检测口腔CAFs和NMFs 4种基因的表达。结果:获得第三代纯化口腔CAFs和NMFs,CAFs表达Vimentin和α-SMA,NMFs只表达Vimentin,二者均不表达Cytokeratin;二者的形态、生长方式、生长速度明显有差异,与NMFs相比,口腔CAFs体积大,细胞呈长梭形,胞浆丰满,核圆形或椭圆形一侧有切迹,杂乱排列,生长速度快;半定量RT-PCR结果显示,口腔CAFs表达不同水平的VEGF、TGF-β1、MMP-9、Tenascin-C,而NMFs均不表达。结论:口腔CAFs的形态和生长速度改变以及口腔CAFs过表达上述4种基因可能是口腔CAFs与口腔癌细胞相互作用所致,为口腔癌细胞的生存和发展提供了有利的微环境。     

人皮肤成纤维细胞的分离和体外培养

基因治疗方式可分为间接体内法 (ｅｘｖｉｖｏ)和直接体内法(ｉｎｖｉｖｏ)。离体基因治疗方法亦称间接法是将患者的某种组织或细胞取出体外 ,在短期培养的条件下转入目的基因 ,进行筛选和富集整合有外源基因的阳性细胞 ,然后再回输到患者体内。该方法具有靶细胞明确 ,转染效率高的优点 ,因此在基因治疗中被较多采用。目前 ,国际上已有 10余种疾病的基因治疗研究采用皮肤成纤维细胞为靶细胞 ,并且越来越多的研究已进入临床Ⅰ期试验。本实验探讨了人皮肤成纤维细胞的分离及体外培养方法 ,观察总结了体外培养的生长特征 ,以获得在体外稳定生长的正常皮肤成纤维细胞 ,从而为自体皮肤成纤维细胞基因治疗的研究提供充足、可     

兔角膜基质细胞的体外培养及生物学特性

目的改进兔角膜基质细胞培养技术,观察其生物学特性。方法　先同时消化角膜上皮及内皮层,然后刮去上皮、内皮、前弹力和后弹力层,接着将剩余的基质层剪碎消化、接种,采用MTT法观察细胞生长情况,并对比有、无血清培养基对细胞生长的影响。结果　角膜基质细胞10d后形成细胞单层,增殖旺盛。有血清培养基培养到第8天左右达到生长高峰,无血清培养基培养的细胞生长较慢,第9天左右达到生长高峰。结论　改进的角膜细胞培养技术简便、成功率高,培养出的角膜基质细胞生长良好。血清对角膜基质细胞生长有一定的影响。     

体外胃癌间质成纤维细胞模型建立和生物学特性初步研究

目的：采用原代培养胃间质成纤维细胞（ human gastric mucosal fibroblasts ,HGMF）,构建体外胃癌间质成纤维细胞模型,研究其生物学特性。方法将调整培养条件的胃癌细胞系MKN-45的培养上清液加入HGMF中培养,使其发生转化。MTT法检测其细胞增殖,ELISA方法测定其肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor,HGF）、转化生长因子-β1（transforming growth factor beta 1,TGF-β1）、趋化因子9（chemokine ligand 9,CXCL9）、趋化因子5（chemokine ligand 5,CCL5）的表达变化,RT-PCR检测其端粒酶活性, BSA法检测蛋白合成能力。结果胃癌细胞培养上清液与HGMF共培养可使其发生转化,转化HGMF细胞增殖能力（0．860±0．055）较HGMF（0．639±0．074）增强,差异有统计学意义（P＜0．05）,HGF、TGF-β1、CCL5和CXCL9表达增强,差异有统计学意义（P＜0．01）,端粒酶活性增高,差异有统计学意义（P＜0．01）,蛋白质合成能力增强,差异有统计学意义（P＜0．01）。结论转化成纤维细胞与亲代细胞相比具有更强的生物学活性和分裂活性,蛋白质合成增强,能表达和分泌更多的与胃癌细胞生长相关的生长因子和趋化因子。     

人肝肿瘤耐药细胞亚系建立及生物学特性研究

目的:以阿霉素(DOX)诱导建立人肝肿瘤细胞系HepG2的多药耐药亚系HepG2/DOX,并对HepG2/DOX的生物学特性及耐药机制进行研究.方法:以浓度梯度递增方法,用DOX诱导HepG2产生耐药性.显微镜观察细胞形态,绘制生长曲线,作染色体常规及G带分析.MTT法检测HepG2、HepG2/DOX细胞对抗癌药物的敏感性.应用免疫组化法检测MDR-1基因产物PgP的表达.结果:HepG2/DOX与HepG2在形态上染色体数目和结构均有差异.细胞可在EOX浓度为0.1μg/ml培养基内生长,但生长速度减慢.DOX、顺铂(CDDP)、丝裂霉素(MMC)、氟脲嘧啶(5-FU)、氨甲喋吟(MTX)对HepG2、HepG2/DOX细胞的IC50值(μg/ml)分别为(0.070和1.161)、(0.214和1.317)、(0.162和0.498)、(0.313和1683)、(0.007和0.217).HepG2/DOX细胞PgP表达增高.在无DOX培养基内生长5周后,DOX对HepG2/BOX的IC50值(μg/ml)为0.684.结论:HepG2/DOX有多药耐药的特点,其耐药性与Pgp的表达增高及倍增时间延长有关.     

应用人皮肤成纤维细胞体外构建组织工程化肌腱

目的 探讨应用国产可吸收生物材料聚羟基乙酸(PGA)和人皮肤成纤维细胞在体外构建组织工程化肌腱的可行性.方法 酶消化法获得人皮肤成纤维细胞经体外培养、扩增至第2代,接种于PGA材料(将材料固定于U形弹簧)并给予持续张力作为实验组(n=15);接种成纤维细胞但不给予任何张力作为对照组1(n=15),即无张力组;给予张力但未接种细胞的单纯PGA为对照组2(n=3),即无细胞组;给予张力并接种肌腱细胞的作为对照组3(n=5,仅限第9周时间点),即肌腱细胞组.体外培养后分别于第2、5、9、14和18周取材进行组织学、生物力学和电镜检测.结果 第2周时,实验组与无张力组大体观察未见明显差异,组织学上主要是未降解的PGA纤维,电镜观察显示细胞在材料上黏附伸展良好.第5周时,除无细胞组外均有新生肌腱样组织形成,组织学检查提示胶原纤维形成.第9周时,无细胞组PGA发生断裂;实验组形成的肌腱组织直径为(1.18±0.25)mm,明显细于无张力组[(2.43±0.49)mm,P=0.017];实验组和肌腱细胞组除后者细胞数量略少外,在大体和组织学上较为相似.实验组形成的胶原包括Ⅰ型和Ⅲ型,细胞和胶原纤维沿受力方向排列,类似正常肌腱;无张力组则杂乱排列,且残留PGA较多.实验组的抗张强度为(2.75±0.59)MPa,接近肌腱细胞组[(3.08±0.30)MPa,P=0.439],明显强于无张力组[(0.82±0.21)MPa,P=0.006].第14周时,无细胞组的PGA基本降解;实验组胶原纤维直径增粗,死亡细胞增多,出现中空现象,但抗张强度比同组第9周时增加.第18周时,实验组中空现象更为明显,抗张强度下降,余与同组第14周时相似.结论 应用人皮肤成纤维细胞在体外可以构建出与肌腱细胞所构建的相类似的人肌腱样组织,施加一定张力可能更有利于组织形成,但体外培养时间不宜过长.     

人游离毛囊体外培养及动态观察

目的进行人发毛囊的体外培养,并对其中后期改变进行形态学、组织学观察。方法将美容除皱术中切除的头皮在无菌条件下分离出游离的毛囊,培养于含血清DMEM培养基中,动态观测毛囊的生长速度及形态学、组织学改变。结果成功进行了人发毛囊的体外培养,毛囊培养中后期呈退化期改变。结论在含血清DMEM培养基中生长的毛囊易较早进入退化期,简化了游离毛囊的常规病理制片方法。     

颞下颌关节骨关节病髁状突软骨细胞体外培养及细胞生物学特性研究

目的:从兔的颞下颌关节骨关节病模型动物获得髁状突软骨细胞并行体外培养.方法:采用部分关节盘手术切除的方法制造颞下颌关节骨关节病模型,组织大体观察、超微结构观察和组化检测方法确定骨关节病的存在.在此基础上,通过机械分离、胰蛋白酶和胶原酶联合消化的方法从骨关节病髁状突软骨组织中获得软骨细胞,进行体外环境下的贴壁培养;通过软骨细胞特异性蛋白的免疫组化方法进行细胞鉴定.四甲基偶氮唑盐法比较病理模型细胞与正常细胞的增殖能力差异.结果:上述颞下颌关节骨关节病模型全面地模拟了骨关节病变关节软骨组织的特征;利用机械分离、胰蛋白酶胶原酶联合消化的方法成功地从骨关节病髁状突软骨组织中分离出软骨细胞并在体外贴壁条件下培养成活;应用特异性的Ⅱ型胶原多克隆抗体和聚合性糖胺多糖单克隆抗体对培养细胞进行免疫组化检测鉴定,均显示阳性.骨关节病髁状突软骨细胞的增殖能力高于正常细胞.结论:成功地建立了骨关节病髁状突软骨细胞的体外模型;骨关节病早期的髁状突软骨细胞表现出增殖活跃的特性.     

丹参酮ⅡA对人肝癌BEL-7402细胞生长的影响及其机制

目的研究丹参酮ⅡA对体外培养的人肝癌细胞系BEL-7402细胞生长的影响及其作用机制。方法0~10 μg/ml丹参酮ⅡA作用人肝癌BEL-7402细胞72 h后,用倒置相差显微镜观察丹参酮ⅡA对BEL-7402细胞的生长抑制作用;荧光显微镜、透射电镜、DNA琼脂糖凝胶电泳检测细胞凋亡;流式细胞术检测不同浓度丹参酮作用后细胞凋亡率的变化。结果肝癌细胞经丹参酮ⅡA作用后,细胞生长明显受到抑制;荧光显微镜、透射电镜观察发现细胞皱缩、核质浓缩、核碎裂、细胞起泡及凋亡小体形成等凋亡特征性形态改变;琼脂糖凝胶电泳观察到DNA“梯状带”;流式细胞仪定量分析示浓度为0.5、1.0、2.0、5.0、和10.0 μg/ml的丹参酮ⅡA处理肝癌细胞72 h后,细胞凋亡率分别为(20.78±2.17)%、(24.64±2.07)%、(31.47±3.86)%、(43.65±4.04)% 和(52.36±3.75)%,与对照组[(2.37±0.29)%]比较,均有显著性差异。结论丹参酮ⅡA能抑制体外培养的人肝癌细胞系BEL-7402细胞的生长,其机制可能为诱导细胞凋亡。     

XPD/P44亚复合物对人肝癌细胞周期的调控

目的 探讨着色性干皮病互补基因D(XPD)/P44亚复合物对人肝癌细胞周期的调控机制.方法 重组质粒增强型绿色荧光蛋白(pEGFP)-N2/XPD,空载质粒pEGFP-N2分别通过Lipofectamine 2000转染SMMC-7721细胞,构建稳定表达的细胞株,再应用P44反义寡核苷酸阻断SMMC-7721-pEGFP-N2/XPD中P44的表达.实验分为6组:①空白对照组;②SMMC-7721-pEGFP-N2组;③SMMC-7721-pEGFP-N2/XPD组;④反义SMMC-7721-pEGFP-N2/XPD翻译起始部位组;⑤反义SMMC-7721-pEGFP-N2/XPD翻译终止部位组;⑥反义SMMC-7721-pEGFP-N2/XPD外显子5组.用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、Western印迹法检测转染各组细胞内P44、XPD以及cdk7、cdk2、c-myc和cdc25A的表达量,并用四甲基偶氮唑盐(MTr)和流式细胞仪检测细胞增殖及其细胞周期的变化.结果 ①、②组中P44、XPD的mRNA表达量均明显低于③组(均P<0.01).P44、XPD的蛋白变化趋势与其mRNA变化趋势一致;而细胞周期调控基因cdk7、cdk2、c-myc和cdc25A的mRNA及蛋白的表达量下调,细胞增殖力减弱,③组与①组、②组相比,停滞在G1期细胞多,进入S期细胞少.阻断P44后XPD的表达量下调,④、⑤、⑥组中XPD的mRNA表达量分别是③组的(0.55±0.09)、(0.65±0.05)、(0.61±0.11)倍,差异均有统计学意义(均P<0.01);④组、⑤组、⑥组中XPD蛋白的表达量分别为③组的(0.75±0.06)、(O.79±0.02)、(0.88±0.07)倍,差异均有统计学意义(均P<0.01).cdk7、cdk2、c-myc和cdc25A的mRNA以及蛋白的表达量上调;细胞增殖明显;与③组相比,④组、⑤组、⑥组的细胞进入S期细胞增多,停滞在G1期细胞减少.结论 XPD基因具有抑制癌细胞生长、促进癌细胞凋亡的功能;XPD的表达受其分子伴侣P44的调节,XPD/P44亚复合物可能是通过DNA损伤检控点来调控细胞周期的.     

大鼠心肌成纤维细胞体外培养的生物学特性及转基因研究

目的观察大鼠心肌成纤维细胞(CFs)体外培养的生长增殖情况及肌肉转录调节因子(MyoD)基因转染对其生物学特性的影响。方法采用改良的差速贴壁法培养大鼠CFs,利用携带MyoD cDNA的真核表达载体pLenti6/V5-DEST-MyoD转导培养的大鼠CFs,用稻瘟菌素筛选2周,挑选转基因单克隆细胞,传代培养,进行细胞形态观察、生长曲线以及细胞免疫化学鉴定。结果成功建立高纯度大鼠CFs的细胞培养模型,且具有良好的细胞形态、正常的生长增殖等生物学功能。转染细胞的MyoD cDNA基因表达阳性,其下游抗α-肌动蛋白(α-actin)呈阳性表达,胞质呈棕黄色,并且含有与细胞纵轴平行排列的肌丝,细胞核用苏木素复染后呈淡蓝色。在2.0×10~5/mL细胞密度的CFs接受转MyoD基因后,抗α-actin阳性率为(27.04±9.41)%。结论真核表达载体成功介导MyoD cDNA转导入体外培养的大鼠CFs,诱导其转化为具有潜在功能的类骨骼肌细胞,CFs可成为心血管疾病基因治疗的靶细胞。