HO-1siRNA表达载体的构建及其稳定转染SGC7901细胞系的建立

目的:构建携带绿色荧光蛋白的HO-1基因siRNA表达载体,通过将载体转染入胃癌细胞株SGC7901筛选稳定转染细胞株.方法:参照前期工作,构建可用于筛选阳性克隆并带有绿色荧光的HO-1基因siRNA表达载体,采用脂质体转染法将载体转入SGC7901细胞中,并用G418进行阳性克隆筛选,获得稳定转染细胞系.结果:经酶切和测序验证,证实表达载体构建成功,将HO-1 siRNA表达载体转入SGC7901后,通过G418筛选获得稳定转染细胞系,经检测HO-1的表达水平明显低于为未转染的细胞.结论:本实验成功地构建了HO-1基因siRNA表达载体,筛选出HO-1基因沉默的稳定转染胃癌细胞系,为今后研究HO-1基因的作用机制提供了实验基础.     

Klf4基因在人神经胶质瘤细胞U251中的稳定表达

目的:建立稳定表达Klf4基因的神经胶质瘤细胞U251 ,为探讨该基因在神经胶质瘤细胞中的功能奠定基础.方法:以低表达Klf4基因的人胶质瘤细胞系U251为材料,以Klf4基因转染U251细胞系,G418筛选,获取G418抗性单克隆进行培养,扩增后分别用免疫荧光技术、免役印迹技术(Western blot)验证获得的表达细胞株.结果:经转染和G418筛选后,荧光显微镜下见有明显表达Klf4基因的细胞,Western blot检测到转染基因Klf4后细胞KLF4蛋白的表达增高,而作为对照的转空载体的细胞Klf4的表达较低.结论:该方法成功建立了稳定转染基因Klf4的人胶质瘤U251细胞系,为进一步探讨该基因在肿瘤细胞的功能奠定了一定基础.     

人肽脱甲酰基酶基因真核表达载体的构建及在NIH3T3细胞中的表达

目的:构建人肽脱甲酰基酶(HsPDF)基因的真核表达载体并转染NIH3T3细胞,研究HsPDF基因在真核细胞中的表达及功能.方法:通过RT-PCR从人宫颈癌细胞系HeLa中扩增获得HsPDF基因,克隆到真核表达栽体pcDNA3.1(一),利用阳离子脂质体转染NIH3T3细胞,G418筛选建立稳定表达细胞系;RT-PCR检测转染后HsPDF基因的mRNA转录水平;MTT法测定转染后细胞增殖能力的变化;苏木精-伊红(HE)染色观察HsPDF对NIH3T3细胞形态的影响.结果:成功构建重组表达载体peDNA3.1(一)-HsPDF.该载体被转染入NIH3T3细胞后,外源HsPDF基因获得了有效的转录与稳定表达.HsPDF显著促进NIH3T3细胞的增殖,并使细胞呈现出一定的恶变特征.结论:HsPDF基因在NIH3T3细胞中获得了稳定表达并表现出明显的生物学功能,为深入研究奠定了基础. G418筛选建立稳定表达细胞系;RT-PCR检测转染后HsPDF基因的mRNA转录水平;MTT法测定转染后细胞增殖能力的变化;苏木精-伊红(HE)染色观察HsPDF对NIH3T3细胞形态的影响.结果:成功构建重组表达裁体peDNA3.1 一)-HsPDF.该载体被转染入NIH3T3细胞后,外源HsPDF基因获得了有效的转录与稳定表达.HsPDF显著促进NIH3T3细胞的增殖,并使细胞呈现出一定的恶变特征.结论:HsPDF基因在NIH3T3细胞中获得了稳定表达并表现出明     

抗G418小鼠胚胎干细胞饲养层的制备

目的:建立具有G418抗性的3T3细胞系,用于转染pTet-on基因的ES阳性克隆筛选的饲养层.方法:通过脂质体转染的方法,将含有neo基因的质粒pWL/neo导入3T3细胞中,利用G418的药物选择特性,对转染细胞进行压力筛选,并对其进行PCR鉴定.结果:经500μg/ml的G418压力筛选后,获得了抗G418细胞克隆.抗性3T3细胞的形态和生长速度与正常3T3细胞没有差异,用特异性核苷酸引物检测抗性细胞基因组DNA,可以扩增出对应的核苷酸片段,Southern blot鉴定结果表明neo基因片段已整合入G418抗生3T3细胞中.结论:成功地培育了G418抗性的3T3细胞,为进行pTet-on基因转染ES细胞的阳性细胞克隆筛选奠定了基础.     

稳定表达外源性p53基因U14细胞系的建立及鉴定

目的建立稳定表达外源性p53基因的U14细胞系。方法将提取的含p53质粒DNA用脂质体介导的转染方法导入U14细胞，经含G418选择培养基筛选得到稳定转染的细胞系．用间接免疫细胞化学法鉴定外源性p53基因的表达情况。结果筛选得到的U14细胞系可检测到外源性p53蛋白的表达。结论建立了稳定表达外源性p53基因的U14细胞系，为进一步研究p53基因用于肿瘤免疫治疗奠定基础。     

ABCE1基因siRNA 稳定转染小细胞肺癌细胞株阳性克隆的筛选

 目的构建携带绿色荧光蛋白的ABCE1基因的siRNA 表达载体,通过将载体转染入小细胞肺癌细胞株NCI-H446,筛选稳定转染细胞株。方法根据的DNA 序列设计3 对siRNA 引物,构建可用于筛选阳性克隆且带有绿色荧光的基因siRNA 表达载体ABCE1-pRNAT-U6.1/Neo-siRNA-1、ABCE1-PRNAT-U6.1/Neo-siRNA-2 及ABCE1-pRNAT-U6.1/Neo-siRNA-N,采用FUGENE-HD法将载体转染入NCI-H446 细胞中,并以G418 进行阳性克隆筛选,筛选ABCE1基因沉默的稳定转染细胞系。结果经酶切和DNA测序验证,证实ABCE1-pRNAT-U6.1/Neo-siRNA 表达载体构建成功。将基因siRNA表达载体成功转染小细胞肺癌细胞NCI-H446 后,小细胞肺癌细胞内可见绿色荧光,通过G418 筛选,获得了基因沉默的小细胞肺癌细胞系,该细胞系的ABCE1水平明显低于未转染siRNA 的小细胞肺癌细胞。结论成功的构建了基因siRNA 表达载体ABCE1-pRNAT-U6.1 /Neo-siRNA。筛选出ABCE1基因沉默的稳定转染小细胞肺癌细胞系,为今后应用ABCE1基因siRNA 表达载体研究基因的作用机制提供实验基础。     

稳定表达野生型DNA聚合酶β的细胞系的建立

目的建立稳定表达野生型DNA聚合酶β的细胞系。方法将已构建的野生型DNA聚合酶β的真核表达载体用脂质体法转染中国仓鼠卵巢细胞,经G418筛选后得到稳定转染的细胞株,用免疫印记方法鉴定野生型DNA聚合酶β蛋白水平的表达。结果成功转染和筛选出表达外源性DNA聚合酶β基因的中国仓鼠卵巢细胞株,并检测到该基因蛋白水平的高表达。结论建立稳定表达DNA聚合酶β的细胞株,为进一步研究DNA聚合酶β高表达对细胞生物学特性的影响奠定基础。     

转染Livin基因对膀胱癌细胞凋亡的影响

目的 探讨凋亡抑制基因Livin对膀胱癌细胞凋亡的影响.方法 采用脂质体转染法将Livin基因转入膀胱癌T24细胞系,经G418筛选后获得稳定表达Livin的亚克隆细胞系T24/Livin+及仅转染载体的T24/pcDNA3.1(+).用丝裂霉素C(MMC)分别作用于转染前后的膀胱癌细胞系,应用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检测转染前后细胞生长抑制率,应用流式细胞仪(FCM)及吖啶橙(AO)染色检测细胞凋亡.结果 成功建立了稳定表达Livin的亚克隆细胞系T24/Livin+;经MMC作用24 h后,T24/pcDNA3.1(+)细胞与T24的细胞凋亡率分别为(21.4±2.3)%和(19.6±2.3)%,而T24/Livin+的细胞凋亡率则为(8.7±1.5)%,差异有统计学意义(P＜0.01).结论 Livin基因提高了T24膀胱癌细胞的抗凋亡能力,特别是在膀胱癌化疗中显示出更强的抗凋亡能力.     

稳定表达GFP-LC3的RAW264.7细胞系的建立

目的:建立稳定表达GFP-LC3的小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞系.方法:构建pcDNA3.1-GFP-LC3真核表达载体,应用转染技术将该质粒导入RAW264.7细胞,用G418筛选稳定表达的细胞系.真核细胞中GFP-LC3的表达分别用荧光显微镜与Western blot方法检测,并利用该稳定表达细胞系观察内质网应激时细胞发生自噬的情况.结果:成功获得2株转染并经G418反复筛选的RAW264.7细胞系,在倒置荧光显微镜下观察可见绿色荧光的表达率在95%以上,Western blot结果证实了GFP-LC3融合蛋白的表达.激光共聚焦显微镜和Western blot均证明内质网应激可以诱导自噬的发生.结论:用peDNA3.1-GFP-LC3转染的RAW264.7细胞经G418筛选,可成功建立GFP-LC3稳定表达系,从而为后续功能实验提供有用的细胞研究模型. ern blot方法检测,并利用该稳定表达细胞系观察内质网应激时细胞发生自噬的情况.结果:成功获得2株转染并经G418反复筛选的RAW264.7细胞系,在倒置荧光显微镜下观察可见绿色荧光的表达率在95%以上,Western blot结果证实了GFP-L 3融合蛋白的表达.激光共聚焦显微镜和Western blot均证明内质网应激可以诱导自噬的发生.结论:用peDNA3.1-GFP-LC3转染的RAW264.7细胞经G418筛选,可成功建立GFP-LC3稳定表达系,从而为后续功能实验提供有用的细胞研究模型.     

稳定表达GlyRα1的HEK293细胞系的建立

目的:建立稳定表达甘氨酸受体α1亚基(GlyRα1)真核表达载体的人胚肾细胞(HEK293)细胞系.方法:构建pcDNA3.1-GlyRα1真核表达载体,应用脂质体介导的转染技术将该质粒导入HEK293细胞,再用G418筛选表达稳定的细胞系.真核细胞中GlyRα1的表达分别用RT-PCR与Western blot方法检测.结果:在7株转染并经G418反复筛选的HEK293细胞系中,有4株细胞系明显表达GlyRα1的mRNA及其蛋白质,其余3株细胞表达较弱或者没有表达.结论:用pcDNA3.1-GlyRα1转染的HEK293细胞经G418筛选,可成功建立GlyRα1稳定表达系.     

人G250真核表达载体的构建及稳定转染B16细胞系的建立

目的构建人G250真核表达载体,建立稳定表达人G250的小鼠黑色素瘤细胞系。方法采用PCR方法扩增出人G250基因的cDNA编码区序列,利用DNA重组技术将其定向插入到真核表达载体pIRES-neo-sig中,并加入酶切位点和FLAG标签,得到重组表达质粒pIRES-neo-sig-FLAG-G250。利用阳离子脂质体介导法将其稳定转染入小鼠黑色素瘤B16细胞,经G418加压筛选出阳性克隆。RT-PCR及免疫荧光检测人G250在B16细胞中的表达。结果经限制性内切酶鉴定及序列分析,pIRES-neo-sig-FLAG-G250重组质粒构建正确,最终建立的表达人G250基因的B16细胞系阳性率接近100%。结论成功构建了真核表达载体pIRES-neo-sig-FLAG-G250,建立的稳定转染人G250小鼠黑色素瘤细胞系能够高效表达G250基因。该稳定转染细胞系的建立为G250在肿瘤免疫治疗中的应用奠定了研究基础。     

稳定表达促血管生成素基因肝癌细胞系的建立及产物的检测

目的 构建携带促血管生成素(Angiopoietin)基因并稳定表达的肝癌细胞系SMMC7721，为进一步研究奠定基础。方法 选择本身不表达Angiopoietin的肝癌细胞系SMMC7721，通过脂质体介导的基因转染方法将Angiopoietin基因导入SMMC7721肝癌细胞系，并用G418筛选稳定表达的细胞克隆，构建携带Angiopoietin基因并稳定表达的SMMC7721肝癌细胞系。用RT-PCR方法从RNA水平以及用免疫荧光法从蛋白水平均检测新构建的肝癌细胞系是否携带了Angiopoietin基因并能稳定表达其蛋白产物。结果 成功构建了携带Angiopoietin基因的肝癌细胞系，新的细胞系可以稳定表达外源基因及其蛋白产物。结论 脂质体介导基因转染法是一种高效转染方法，新细胞系的建立将为进一步的促血管生成素在肝癌血管的生成和转移中的作用研究奠定基础。     

人LIGHT基因的克隆及其在293T细胞中的表达

目的克隆人LIGHT分子的全长cDNA,构建重组真核表达质粒pCI-neo-LIGHT并在293T细胞上获得稳定表达.方法从人T细胞cDNA文库中用PCR技术克隆人LIGHT全长cDNA,装入T-Easy载体,测序证实后,将LIGHT cDNA装入质粒pCl-neo中构建真核表达载体.用电穿孔法转染293T细胞,经G418筛选后,用流式细胞仪检测LIGHT分子的表达.结果测序证实克隆的LIGHT全长cDNA阅读框正确完整,酶切证实LIGHT-pCI-neo中LIGHT插入方向正确.转染的293T细胞经G418筛选3个月后,流式细胞仪检测有78.69%的细胞表达人LIGHT分子.结论成功克隆LIGHT基因并获得稳定表达膜型LIGHT分子的293T细胞系.     

稳定转染维生素D受体反义cDNA的人骨肉瘤细胞系的建立

目的：建立稳定转染维生素D受体（VDR）反义cDNA的人骨肉瘤细胞系,方法：构建VDR反义cDNA的真核表达载体,用Lipofectamine法转染人骨肉瘤细胞系HOS－8603,经G418筛选后获得稳定转染细胞株,并用免疫组化技术检测内源性VDR蛋白折表达情况,采用瞬时转染报告基因技术从靶基因水平检测VDRas3细胞内VDR的转录激活功能,结果“筛选出6株抗G418细胞克隆（VDRas1-6),其中VDRas3细胞内源性VDR蛋白的表达量低于对照细胞,激素作用72h后,对照组细胞的报告基因氯霉素乙酰转移酶（CAT）转录活性增加约3．5倍,而VDRas3细胞CAT的转录基本不受激素诱导。结论：获得了稳定转染VDR反义cDNA的细胞系,为今后进一步研究1,25（OH）2D3及其类似物调节细胞增殖分化的分子机制提供了一个良的细胞模型。     

稳定高表达人GPC3的SK-Hep-1细胞系的构建

目的获得稳定高表达人GPC3的SK-Hep-1细胞系。方法构建人GPC3真核表达载体pc DNA3. 1-GPC3,通过电穿孔的方法转染至SK-Hep-1细胞,利用G418进行细胞筛选,获得稳定高表达GPC3的细胞系。再利用Western blot和流式细胞术进行鉴定,分析稳定转染细胞表面GPC3蛋白的表达情况。结果成功构建的真核表达质粒pc DNA3. 1-GPC3,检测发现SK-Hep-1细胞G418最佳筛选浓度为700μg/m L,利用该浓度G418筛选转染SK-Hep-1细胞,获得了细胞表面能够稳定高表达人GPC3蛋白的SK-Hep-1细胞系。结论建立高表达人GPC3蛋白的SK-Hep-1稳定细胞系,为研究靶向GPC3肝癌抗体提供了物质基础。     

诱导型一氧化氮合酶基因在3T3成纤维细胞中的转染和意义

目的观察人诱导型一氧化氮合酶基因(iNOS)转染3T3成纤维细胞的可能性.方法用阳性脂质体将含人诱导型一氧化氮的真核表达载体pcDNA3.0-iNOS转染至3T3细胞,用G418筛选,通过RT-PCR、免疫组化的方法鉴定.结果 pcDNA3.0-iNOS基因转染的3T3细胞有人iNOS基因mRNA的表达,细胞中有iNOS蛋白的表达,空载体和对照组没有表达.结论人iNOS基因能够在3T3成纤维细胞得到稳定转染和表达.     

人MCHR2真核表达载体的构建及稳定转染CHO细胞系的建立

目的 构建人MCHR2真核表达载体,转染CHO细胞,建立稳定转染的CHO细胞系.方法 采用PCR方法,以人胎脑cDNA文库为模板扩增人MCHR2基因的全长cDNA编码区序列,利用DNA重组技术将其定向插入到真核表达载体pcDNA3.1( ),经酶切和测序鉴定后,用脂质体转染法转染CHO细胞,通过G418筛选,建立稳定转染的CHO细胞系,用RT-PCR、Western blot及免疫荧光法检测MCHR2的表达.结果 成功构建了pcDNA3.1( )/MCHR2真核表达载体,并建立了稳定转染的CHO细胞系,成功地表达目的基因.结论 真核表达载体成功构建和稳定转染CHO细胞系的建立为进一步研究MCHR2的功能奠定良好的实验基础.     

LRIG2基因短发夹RNA表达载体的构建、鉴定和稳定株的筛选

目的 构建针对富含亮氨酸重复序列免疫球蛋白样蛋白2(LRIG2)基因的短发夹RNA(shRNA)表达载体,建立稳定转染的细胞株,观察其对目的 基因表达的影响.方法 根据GenBank中LRIG2基因序列设计2条RNA干扰序列,命名LRIG2-shRNA1、LRIG2-shRNA2,同时设计1条非特异性序列作为阴性对照.据此设计合成各自的寡核苷酸链,退火后连接入pGenesil 2载体,转化扩增后进行序列测定.用不同浓度的G418作用于GL15细胞,得到G418对于GL15细胞的筛选浓度.3种重组表达载体转染胶质瘤细胞系GL15细胞,用G418筛选后挑单克隆后扩增获得稳定株.逆转录RT-PCR和Western印迹法分别在mRNA和蛋白水平上检测LRIG2的表达.结果 3种重组表达载体(pGenesil 2-LRIG2-shRNA1、pGenesil 2-LRIG2-shRNA2和pGenesil 2-negative shRNA)经限制性酶切及DNA测序分析证明序列插入正确.G418对于GLl5细胞的筛选浓度为600μg/ml,筛选出稳定转染三种质粒的GL15细胞,转染pGenesil 2-LRIG2-shRNA2组细胞LRIG2 mRNA和蛋白表达明显低于转染pGenesil 2-LRIG2-shRNA1、pGenesil 2-negative shRNA组.结论 成功构建了针对LRIG2基因的shRNA表达载体(pGenesil 2-LRIG2-shRNA2),转染细胞后可抑制LRIG2基因表达,为研究LRIG2基因的功能提供了基础.     

人DR5真核表达载体的构建及稳定转染NS-1细胞系的建立

目的:构建人死亡受体5(DR5)真核表达载体,转染NS-1细胞,建立稳定转染的NS-1细胞系。方法:采用RT-PCR方法,以人Jurkat细胞cDNA为模板扩增人DR5基因的cDNA编码区序列,利用DNA重组技术将其定向插入到真核表达载体pcDNA3.0,经酶切和测序鉴定后,用脂质体转染法转染NS-1细胞,通过G418筛选,建立稳定转染的NS-1细胞系,用FACS法检测DR5的表达。结果:成功构建了pcDNA3.0/DR5真核表达载体,并建立了稳定转染的NS-1细胞系,成功地表达目的基因。结论:真核表达载体成功构建和稳定转染NS-1细胞系的建立为进一步进行基因治疗研究奠定良好的实验基础。     

脂质体载体法转染HERGA基因到HEK-293细胞及其鉴定

目的 验证脂质体载体法将HERGA基因有效转染到HEK-293细胞。方法 用LIPOFACRAMINE2000转染试剂将HERGA基因转染HEK-293细胞，经G418筛选，用全细胞膜片钳技术检测HERGA基因在HEK-293细胞中的稳定表达情况。结果 G418筛选，培养4周阳性克隆形成。全细胞膜片钳技术检测，证实HERGA基因得到了稳定表达并记录到了转染成功的正常HERGA电流。结论 初步证实脂质体载体法能有效地将HERGA基因导入HEK-293细胞，且HERGA在细胞中的稳定表达。