细胞外信号调节蛋白激酶1/2在介导周期性牵张力对牙周膜细胞成骨分化中的作用

目的 研究周期性牵张力刺激下细胞外信号调节蛋白激酶（ERK）1/2对牙周膜细胞成骨分化的分子调控机制。方法 组织块法培养人牙周膜细胞。采用多通道应力加载系统对细胞施加频率0.5 Hz、振幅10%的周期性牵张力（加力时间1、3、6、12、24 h）,以不加力的细胞作为对照,并分别在加力前应用ERK1/2通路特异性抑制剂U0126以及对细胞转染ERK1/2显性负相变异体（DN-ERK1/2）。采用实时荧光定量聚合酶链式反应（real-time PCR）及蛋白质印迹法研究人牙周膜细胞的基因蛋白水平变化。结果 加力后人牙周膜细胞的p-ERK1/2蛋白水平及骨钙蛋白（OCN） mRNA、骨涎蛋白（BSP）mRNA水平均显著升高,Runt相关基因（Runx）2 mRNA及蛋白水平在加力3、6 h均显著升高。加入抑制剂U0126或细胞转染DN-ERK1/2后,Runx2、OCN、BSP mRNA水平以及Runx2、p-ERK1/2蛋白水平均降低。结论 ERK1/2是周期性牵张力刺激下牙周膜细胞成骨分化的重要分子途径,力学刺激下激活的ERK1/2可能通过提高Runx2蛋白的表达水平而参与成骨基因OCN和BSP的转录表达。     

淫羊藿苷对人牙周膜细胞增殖及骨向分化的影响

目的：探讨淫羊藿苷对人牙周膜细胞增殖及骨向分化的影响,为淫羊藿苷在治疗牙周病方面的应用提供一定依据。方法：体外培养人牙周膜细胞,矿化诱导条件下将第3代细胞与10～0.001mg/L,6个浓度的淫羊藿苷作用,通过噻唑蓝（MTT）比色法、ALP活性测定及BSP表达水平,反应其对人牙周膜细胞增殖及分化的影响。结果：作用24h,各药物浓度均能促进人牙周膜细胞增殖（P〈0.05）。作用48h,1～0.001mg/L组可促进人牙周膜细胞增殖（P〈0.05）。作用72h,0.1～0.001mg/L组可促进人牙周膜细胞增殖（P〈0.05）,10mg/L组抑制人牙周膜增殖（P〈0.05）;作用72h,1～0.001mg/L组可促进人牙周膜碱性磷酸酶（ALP）活性（P〈0.05）;作用72h,0.1～0.001mg/L组的BSP表达水平较对照组显著增加（P〈0.05）。结论：淫羊藿苷在一定浓度范围内可促进人牙周膜细胞增殖及骨向分化。     

外源性碱性成纤维细胞生长因子对人腺样囊性癌细胞株ACC-2增殖和细胞外信号调节激酶、CyclinD1及p21~(waf/cip1)通路的影响

目的腺样囊性癌（ACC）是最常见的唾液腺恶性肿瘤之一。本研究拟观察碱性成纤维细胞生长因子
（bFGF）对人ACC- 2细胞增殖及细胞外信号调节激酶（ERK）、Cyclin D1及p21waf/cip1信号通路的影响。方法培养人
ACC- 2细胞，MTT比色法测定不同浓度的外源性bFGF对细胞增殖的影响；采用ERK活性测定试剂盒测定ERK活性；
免疫印迹法测定p- ERK1/2和下游的Cyclin D1及p21waf/cip1表达。并观察丝裂原蛋白活化激酶激酶（MEK）抑制剂U0126对
上述指标的干预作用。结果MTT实验显示bFGF明显增强ACC- 2细胞增殖，bFGF可上调ERK活性，免疫印迹法显
示bFGF明显增强p- ERK1/2、Cyclin D1表达及抑制p21waf/cip1表达。U0126可抑制bFGF的以上效应。结论bFGF可促进
人ACC- 2细胞增殖，其途径与上调p- ERK1/2活性、抑制p21waf/cip1表达进而增强Cyclin D1表达有关。本研究为ACC的发
病机制及治疗提供新思路。     

N-乙酰半胱氨酸抑制牙龈卟啉单胞菌脂多糖引起的成骨细胞氧化应激与凋亡

目的 探讨牙龈卟啉单胞菌脂多糖（Porphyromonas gingivalis, P.g）脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）对成骨细胞氧化应激与凋亡的影响及N-乙酰半胱氨酸（N-acetylcysteine, NAC）对其保护作用，为临床运用NAC预防和治疗牙周炎提供理论基础和实验依据。方法 CCK-8法检测不同浓度P.g LPS和NAC对小鼠成骨细胞增殖影响，确定最佳刺激浓度和时间。将细胞分为对照组、LPS组、NAC组、LPS+NAC组。流式细胞术检测各组细胞凋亡率，RT-PCR法检测各组Foxo1、Sod2、Bax基因表达水平，荧光显微镜下观察各组细胞内活性氧（reactive oxygen species, ROS）荧光强度，检测各组超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）、丙二醛（malondialdehyde,MDA）含量变化。结果 与对照组相比，LPS组成骨细胞内ROS,MDA含量增多，SOD活性下降，细胞凋亡率明显升高，Foxo1、Sod2 mRNA基因表达量降低，Bax基因表达水平上升。与LPS组相比，LPS+NAC能够...     

bFGF对人涎腺腺样囊性癌ACC-2细胞株增殖及MEK/ERK、NF-κB通路的影响

目的：观察碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）对人涎腺腺样囊性癌ACC-2细胞株增殖及MEK／ERK、核转录因子-κB（NF—κB）信号通路的影响。方法：培养人涎腺腺样囊性癌细胞株（ACC-2），MTT比色法测定不同浓度bFGF对细胞增殖的影响；免疫沉淀法纯化蛋白并ERK试剂盒测定ERK活性；Western—blot测定p-ERK及NF—κB抑制物（I-κBa）表达。并观察丝裂原蛋白活化激酶激酶（MEK）抑制剂U0126对上述指标的干预作用。结果：MTT实验显示bFGF明显增强ACC-2细胞增殖，免疫沉淀法显示bFGF上调ERK活性，免疫印记法显示bFGF明显增强p-ERK1／2表达及抑制I-κBα表达。U0126可抑制bFGF的以上效应。结论：bFGF可促进人涎腺腺样囊性癌ACC-2细胞株增殖，其途径与上调ERK活性，激活ERK、NF—κB信号通路有关。     

中药黄芩苷对脂多糖介导人牙周膜细胞增殖的时间效应和细胞周期的影响

目的:观察中药黄芩苷对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)介导体外培养的人牙周膜细胞(periodontal ligament cell,PDLC)增殖的时间效应和细胞周期的影响.方法:采用细胞培养技术培养PDLC,应用噻唑盐比色测定法(MTT)和流式细胞仪技术测定黄芩苷对LPS介导PDLC增殖的时间效应和细胞周期.结果:加入0.01 μg/ml黄芩苷3 h后,明显促进人牙周膜细胞的增殖(P＜0.05);加入100 μg/ml LPS 3 h后,即明显抑制人牙周膜细胞的增殖(P＜0.05),抑制作用随时间的延长而增强,而同时加入0.01μg/ml黄芩苷和100μg/ml LPS 3 h后,其抑制作用则显著减弱(P＜0.05).加入0.01μg/ml黄芩苷后12 h,DNA合成前期细胞所占百分比(G1%)较对照组降低,而DNA合成期细胞所占百分比(S%)较对照组增高;加入100 μg/ml LPS后12 h,G1%较对照组增高,而s%则降低;加入0.01μg/ml黄芩苷和100μg/ml LPS后12 h,G1%较LPS组显著降低(P＜0.01),S%则有显著提高(P＜0.01).结论:中药黄芩许能显著促进PDLC增殖分化,对LPS抑制PDLC的活性关系到有保护作用,原理可能足LPS抑制静止态的G1期细胞进入S期,从而抑制细胞的增殖;而黄芩苷则相反促进细胞由G1期细胞进入S期,从而促进细胞的增殖.     

依那西普对牙龈卟啉菌内毒素作用下原代培养牙周膜细胞影响的实验研究

目的　观察依那西普（Etanercept）对牙龈卟啉菌内毒素（lipopolysaccharide,LPS)作用下体外培养的人牙周膜细胞(HPDLCs)的增殖能力的影响。方法　体外原代培养人牙周膜细胞,经免疫细胞化学鉴定,加入LPS和1 μg/ml Etanercept+LPS,LPS浓度分别为10、50、100、200、300 μg/ml检测（吸光度）A值。采用MTT法测定细胞增殖能力。结果　 人牙周膜细胞原代细胞生长状态良好。第3代细胞进行鉴定,Vimentin染色呈阳性,Ck(pan)染色呈阴性。MTT法检测加入梯度浓度的LPS 24 h后,HPDLCs增殖率随着LPS浓度的增加,对HPDLCs的增殖抑制逐渐增强,200 μg/ml LPS能最大程度抑制HPDLCS的增殖,抑制率为46.21%(P<0.01)。Etanercept + LPS组对HPDLCs细胞作用相对增殖率与LPS组比较（P＜0.01）,能明显抑制LPS对HPDLCs的抑制作用。结论　TNF-α抑制剂Etanercept能明显抑制牙周膜细胞在内毒素刺激下的死亡。     

槲皮素对牙龈卟啉单胞菌脂多糖刺激的人牙龈成纤维细胞生物学行为的影响研究

目的研究槲皮素对牙龈卟啉单胞菌脂多糖(Porphyromonas gingivalis lipopolysaccharide,P.g LPS)刺激的人牙龈成纤维细胞(human gingival fibroblasts,HGFs)生物学行为的影响。方法采用DNA片段凝胶电泳、CCK-8法、细胞划痕法观察不同浓度槲皮素(10、20、50、100μmol/L)对体外培养HGFs的毒性作用,以及对HGFs增殖与迁移的影响。采用P.g LPS刺激HGFs来建立体外炎症刺激模型,通过流式细胞术、细胞活性氧(reactive oxygen species,ROS)检测、酶联免疫吸附试验(ELISA)和实时荧光定量PCR(qRT-PCR)进一步观察槲皮素对HGFs凋亡、ROS的产生及肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factorα,TNF-α)和前列腺素E2(prostaglandin E2,PGE2)表达的影响。结果槲皮素对HGFs无毒性作用,且对HGFs的增殖无影响(P>0.05)。各组细胞迁移率总的比较,差异有统计学意义(F=9.973,P<0.05),在处理48 h后,20μmol/L槲皮素处理组细胞迁移率大于10、50μmol/L槲皮素处理组以及对照组,差异均有统计学意义(均P<0.05)。槲皮素对P.g LPS刺激的HGFs凋亡具有抑制作用,且其能够抑制并预防P.g LPS刺激的HGFs中ROS相对产生量增加现象(均P<0.05)。槲皮素处理显著抑制了P.g LPS诱导的TNF-α表达增加现象(P<0.05),而槲皮素处理组PGE2的表达水平与对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论浓度为20μmol/L的槲皮素能够促进体外培养HGFs的迁移,且具有抗氧化、抗炎保护作用。     

LPS刺激对体外培养人牙龈成纤维细胞环氧合酶表达的影响

目的检测脂多糖（LPS）刺激后体外培养人牙龈成纤维细胞环氧合酶-1和环氧合酶-2（COX-1,COX-2）表达的改变,探讨牙龈成纤维细胞与牙周炎症发生发展的关系。方法组织块法原代培养正常人牙龈成纤维细胞并进行来源鉴定,MTT法检测不同浓度LPS刺激后活细胞数量的改变;以10ug/ml刺激第4代细胞,24h后用免疫细胞化学方法检测COX-1和COX-2在细胞中的表达,多功能彩色细胞分析管理系统进行图像分析和统计学分析。结果 LPS刺激可使牙龈成纤维细胞的增殖速度降低,生长曲线大致呈＂S＂形;10ug/ml LPS刺激24h后细胞数量未见明显变化。免疫细胞化学染色结果显示COX-1在LPS刺激前后均有表达但无显著差异（P〉0.05）,COX-2在LPS刺激前无表达,LPS刺激后则表达增强并有显著差异（P〈0.01）。结论 LPS对牙龈成纤维细胞生长增殖有抑制作用,不影响COX-1的表达强度,但可使COX-2表达显著增强,说明牙龈成纤维细胞对LPS刺激的反应可能影响牙周炎症进展。     

脂多糖对核转录因子kB在人牙龈成纤维细胞中的激活作用及意义

目的：探讨核转录因子kB（NF-kB）在牙龈成纤维细胞（GF）中活性的变化及其在牙周病发生中的意义,探讨NF-kB在牙周病调控中的作用及途径。方法：采用免疫细胞化学染色法,观察NF-kB在GF中活性的变化。结果：以10μg/mL的LPS作为有效刺激浓度刺激GF,6h后NF-kB核转位达峰值;以10～100μg/mL浓度的LPS作用GF时,NF-KB激活程度不同,表明10～100μg/mL浓度的LPS是NF-kB激活的有效浓度。结论：健康牙龈组织GF细胞中NF-KB处于非激活状态,LPS可诱导人GF细胞中NF-kB激活发生核转位,LPS通过调控NF-KB的激活调节炎症因子对牙周组织的破坏。     

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目的研究盐酸米诺环素对脂多糖（LPS）作用下人牙周膜成纤维细胞（HPDLF）的白细胞介素-6（IL-6）mRNA表达的影响。方法本研究于2011年10月至2012年2月在井冈山大学医学院重点实验室进行。培养HPDLF并分为以下5组：对照组（未加药）、高剂量组（0．01g／LLPS＋0．2班盐酸米诺环素）、低剂量组（0．0lg／LLPS＋0．05g/L盐酸米诺环素）、中剂量组（0．01g／LLPS＋0．1g／L盐酸米诺环素）、模型组（0．0lg／LLPS）,每组均复种3孔。实时荧光定量PCR检测各组HPDLF中的IL-6mRNA表达情况。结果对照组、高剂量组、低剂量组、中剂量组、模型组的IL-6mRNA相对表达量分别为：0．61±0．08、0．62±0．10、0．88±0．17、0．49±0．21、1．88±0．07。模型组IL-6mRNA的相对表达量高于对照组、高剂量组、低剂量组、中剂量组,且差异有统计学意义（P〈0．01）。对照组及低、中、高剂量组的IL-6mRNA相对表达量两两比较,差异均无统计学意义（P〉0．05）。结论盐酸米诺环素能够降低LPS作用下HPDLF中的IL-6mRNA的表达,这可能是盐酸米诺环素治疗牙周炙的作用机制之一。     

转化生长因子β3促进兔牙髓干细胞成骨向分化机制的初步研究

［摘要］ 目的 探讨转化生长因子β3（transforming growth factor β3,TGF-β3 ）体外联合兔牙髓干细胞(rabbit dental pulp stem cells,rDPSCs)诱导其成骨向分化的作用机制。方法 酶解组织块法分离获得rDPSCs;将rDPSCs分为实验组（rDPSCs+80ng/ml TGF-β3）,对照组（rDPSCs+矿化液）和空白组（rDPSCs）,三组细胞分别培养第7、14d行ALP活性定量检测;RT—qPCR检测COL-IA1、Runx-2, OPN, BSP和Smad4基因的表达;western blot法检测COL-1A1,Runx-2蛋白的表达情况;茜素红染色观察矿化结节形成情况。结果 成功分离获得rDPSCs;实验组ALP含量明显高于对照组和空白组（P＜0.05）;COL-1A1、Runx-2、OPN、BSP、Smad4基因的表达均高于空白组（P＜0.05）COL-1A1、Smad4基因的表达高于对照组（P＜0.05）; Western blot结果示实验组COL-1A1,Runx-2蛋白的表达均强于其余两组（P＜0.05）;实验组矿化结节较其余两组明显。结论 TGF-β3体外促进rDPSCs成骨向分化;TGF-β3促进rDPSCs成骨向分化可能通过激活Smad通路来实现。     

牙龈卟啉单胞菌侵入对人血管内皮细胞分泌MCP-1影响的研究

目的　通过研究牙龈卟啉单胞菌（porphyrmonas gingivalis,P.g）侵入对人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cell,HUVEC）分泌单核细胞趋化蛋白（MCP-1）的影响,了解P.g对其趋化功能的影响。方法　建立P.g侵入HUVEC的体外模型,采用酶联免疫吸附法（ELISA）研究P.g381和P.g33277菌株侵入HUVEC 6、24 h后的培养上清液中MCP-1浓度。结果　ELISA结果显示当P.g381侵入HUVEC 6、24 h和P.g33277侵入HUVEC 6 h时,HUVEC分泌的MCP-1水平升高（P＜0.01）;P.g33277侵入HUVEC 24 h时,HUVEC分泌的MCP-1水平恢复最初水平（P=0.46）;P.g381诱导HUVEC表达MCP-1的水平高于P.g33277（P＜0.01）。结论　P.g侵入HUVEC后可促进其表达MCP-1,从而上调其趋化功能,在牙周炎与心血管疾病的相关性中可能发挥作用。     

青蒿琥酯对口腔扁平苔藓T-bet和GATA-3平衡影响的研究

目的　探讨青蒿琥酯(artesunate,ART)对口腔扁平苔藓（oral lichen planus,OLP）患者外周血转录因子T-bet/GATA-3失衡表达的调节作用。方法　通过密度梯度离心法分离OLP患者外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells,PBMC）,分别用不同浓度(0、1、100 μmol/L)的青蒿琥酯和5%的碳酸氢钠溶液作用于PBMC 24 h,逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）测定法和免疫印迹法（Western blotting）检测OLP患者PBMC中T-bet和GATA-3 mRNA和蛋白的表达。结果　T-bet mRNA和蛋白的表达在 100 μmol/L青蒿琥酯组（0.54±0.26、0.93±0.40）均低于对照组（1.35±0.63、1.47±0.43）（P值均<0.01）,GATA-3 mRNA和蛋白的表达在1 μmol/L（0.62±0.33、1.11±0.69）和100 μmol/L（0.23±0.21、0.44±0.27）青蒿琥酯组中均低于对照组（1.40±0.66、1.68±0.61）（P值均<0.01）。结论　青蒿琥酯能够调节OLP患者T-bet和GATA-3的失衡表达。     

BMP-2、bFGF和Dex联合应用对犬牙牙周膜细胞成骨分化能力的影响

目的:观察骨形成蛋白(BMP-2)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和地塞米松(Dex)联合应用对犬牙周膜细胞(PDLCs)成骨分化能力的影响。方法:将第4代犬PDLCs分为5组:bFGF+Dex、BMP-2+bFGF、BMP-2+Dex、BMP-2+bFGF+Dex、对照组。检测各组碱性磷酸酶(ALP)活性,并应用RT-PCR检测各组PDLCs成骨关键基因OPN、COL-1的表达。结果:第7、14 d,各组ALP表达均较空白组显著增强(P<0.05),其中200μg/L BMP-2+10μg/LbFGF+10-8mol/L Dex诱导组犬PDLCs的ALP活性显著高于其他各组(P<0.05)。RT-PCR显示,200μg/L BMP-2+10μg/L bFGF+10-8mol/L Dex诱导组OPN、COL-1基因表达最为显著。结论:3种诱导因子两两结合均能增强犬PDLCs成骨能力,但在最佳浓度下3种因子联合应用诱导能力最强(P<0.05)。