TGF-β1对RPE细胞bcl-2/Fas mRNA和Caspase-3表达的影响

目的观察转化生长因子-β1（transforming grawthfactor-β1，TGF-β1）诱导人视网膜色素上皮细胞（retinal pigment epithelium，RPE）凋亡的作用机制。方法使用逆转录多聚酶链反应检测不同浓度TGF-β1作用下的人RPE细胞中凋亡相关基因bel-2和Fas mRNA的表达。使用Western-Blot蛋白印迹法检测不同浓度TGF-β1处理过的PRE细胞中Caspase-3蛋白的表达。结果逆转录多聚酶链反应正示，随着TGF-β1岛浓度的增高，人RPE细胞中bcl-2mRNA表达降低，Fas mRNA的表达逐渐增高；Western-Blot结果显示。随着TGF-β1浓度的增高，Caspase-3蛋白表达逐渐增高。结论TGF-β1可上调RPE细胞表面Fas基因的表达，从而激活Caspase-3的活性而诱导RPE细胞凋亡，Caspase-3在RPE细胞凋亡过程中起着非常重要的作用。[眼科新进展2006；26（3）：194-197]     

曲安奈德对培养人视网膜色素上皮细胞表达survivin的影响

目的 观察曲安奈德(TA)对体外培养的人视网膜色素上皮(RPE)细胞表达survivin基因的影响,探讨TA治疗增生性玻璃体视网膜病变(PVR)的机制.方法 四甲基偶氮唑盐比色(MTT)法和流式细胞术检测不同质量浓度(0.01、0.1、1.0 g/L)TA对人RPE细胞增生及凋亡的作用,免疫组织化学法、RT-PCR检测药物在蛋白和基因水平对survivin表达的影响. 结果 在不同质量浓度的TA作用下,人RPE细胞的增生受到抑制,凋亡率增加,在蛋白水平和基因水平,药物均对RPE细胞survivin的表达有明显的抑制作用,且均与药物的作用时间和剂量呈正相关.各组与对照组比较差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 TA能抑制人RPE细胞的增生及survivin蛋白和mRNA在人RPE细胞的表达,诱导RPE细胞的凋亡.     

过氧化氢诱导人视网膜色素上皮细胞转录和表达促红细胞生成素的研究

目的研究不同浓度的过氧化氢诱导人视网膜色素上皮（RPE）细胞转录和表达促红细胞生成素（EPO）的现象并探讨其发生机制。方法原代培养人胚胎RPE细胞,经鉴定后,分别应用0、200、400、600、800μmol／L浓度的过氧化氢作用6h,造成RPE细胞不同程度的氧化应激,测定细胞内超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）含量;采用半定量RT-PCR法检测RPE细胞氧化应激中EPO在转录水平的表达变化;免疫组织化学法检测EPO在RPE细胞中的表达部位和表达变化。结果过氧化氢导致RPE细胞内SOD含量下降,MDA含量升高。半定量RT-PCR法检测结果显示过氧化氢诱导EPOmRNA表达量增加,并在一定范围内随着过氧化氢浓度的增高而增加,在600μmol／L过氧化氢组EPOmRNA表达量达最高值,之后随着浓度的上升而下降。免疫组织化学染色法检测结果显示过氧化氢可以诱导人RPE细胞EPO表达增强,并在一定范围内随着过氧化氢浓度的增高而增强,在600μmol／L过氧化氢组EPO表达量达到高峰。结论过氧化氢导致的氧化应激可以诱导人RPE细胞转录和表达EPO,EPO的表达量与RPE存活和耐受程度有关。     

灯盏花素通过调节Bcl-2和Bax表达拮抗高糖诱导的RPE细胞损伤

目的:探讨灯盏花素对高糖环境下人视网膜色素上皮(RPE)细胞氧化应激的影响。方法:常规培养RPE细胞,分为对照组(葡萄糖浓度为5.5mmol/L)、高糖组(葡萄糖浓度为30mmol/L)、灯盏花素低浓度组(30mmol/L葡萄糖+1μmol/L灯盏花素)和灯盏花素高浓度组(30mmol/L葡萄糖+10μmol/L灯盏花素)。细胞划痕实验观察RPE细胞的迁移性,CCK-8法检测细胞活性,流式细胞术检测细胞内活性氧(ROS)水平变化,Hoechst染色法观察凋亡细胞比例,Western blot分析各组Bcl-2和Bax的变化。结果:细胞划痕实验结果显示,灯盏花素低浓度组和灯盏花素高浓度组RPE细胞形态较高糖组改善,细胞迁移性较高糖组增加;CCK-8结果显示,用1、10μmol/L浓度的灯盏花素处理后,RPE细胞存活率分别提高到61.06%±5.59%和79.81%±7.04%,与高糖组(40.63%±4.72%)比较有差异(P<0.05);2’,7’-二氯二氢荧光素二乙酸酯(H2DCFDA)荧光探针染色结果显示,灯盏花素抑制了RPE细胞内ROS水平;Hoechst染色法显示,1、10μmol/L灯盏花素处理后发生凋亡的RPE细胞数量逐渐减少;Western blot结果显示,灯盏花素增强了Bcl-2蛋白的表达,降低了Bax蛋白的表达。结论:灯盏花素可以抑制高糖诱导的RPE细胞氧化损伤和凋亡的发生,为糖尿病视网膜病变的治疗靶点研究提供了理论支持。     

Bcl-2及bFGF在维拉帕米诱导人视网膜色素上皮细胞凋亡中的表达

目的探讨维拉帕米(verapamil,Ver)对体外培养的人视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)细胞的凋亡作用,观察凋亡过程中原癌基因蛋白质(Bcl2)和碱性成纤维细胞生长因子(baic fibroblast growth factor,bFGF)的表达变化。方法应用80mg·L-1Ver作用于体外培养的人RPE细胞12h、24h、48h,吖啶橙(acridineorange,AO)荧光染色及透射电镜观察RPE细胞凋亡;逆转录聚合酶链反应(RTPCR)检测Bcl2mRNA和bFGFmRNA表达变化。结果经Ver作用的体外培养的人RPE细胞具有典型的凋亡形态学特征:核染色质浓染、边集;细胞体积缩小。同时RPE细胞Bcl2mRNA表达下降;而bFGFmRNA表达随着作用时间延长,呈增高趋势。结论Ver可诱导体外培养人RPE细胞凋亡,凋亡过程中Bcl2表达逐渐下降,而bFGF表达增强。     

视网膜色素上皮细胞培养基筛选及其相关生长因子的影响(英文)

目的:通过研究肿瘤坏死因子(TNF-α),血管内皮生长因子(VEGF)、β成纤维细胞生长因子(βFGF)、转移生长因子β2(TGFβ2)、干扰素-γ(IFN-γ)及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Casepase-3)在不同浓度胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)与胰岛素转铁蛋白亚硒酸钠(insulin-transferrin-sodium selenite,ITS)混合培养基中的表达及其对正常视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)细胞生长的影响以探索维持正常RPE细胞生长的理想培养基。方法:首先分别在不含RPE细胞和DMEM培养基的20,40,100mL/LFBS和10,20,30g/LITS中检测TNF-α,VEGF、βFGF、TGFβ2、IFN-γ及Casepase-3是否存在。然后取四十只C57BL/6系小鼠眼的RPE细胞分别培养于含20,40,100mL/LFBS以及20,40,100mL/LFBS与10g/LITS分别组合的DMEM培养基中。免疫组织化学染色以及细胞计数鉴定、评估RPE细胞的存在与生长状况。采用原代培养48h的第三代、第四代RPE细胞,分别用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)以及酶联免疫吸附(ELISA)法检测RPE细胞和上清液中TNF-α,VEGF、βFGF、TGFβ2、IFN-γ及casepase-3的表达强弱;用蛋白印记(Western blotting)法检测RPE细胞中Casepase-3的表达。结果:在20,40,100mL/LFBS中检测到了TNF-α,VEGF、βFGF、TGFβ2及casepase-3(IFN-γ没有表达)并且随浓度增加而表达上调。在10,20,30g/LITS中没有检测到上述生长因子。RPE细胞培养成功。在含20,40,100mL/L不同浓度的FBS以及20,40,100mL/LFBS与10g/LITS分别组合的DMEM培养基中随浓度增加,TNF-α,VEGF、βFGF、TGFβ2及casepase-3的表达呈上调趋势,各对应组组间的表达强度没有明显差异,但不同浓度组组内的表达强度有明显差异(P<0.01)。IFN-γ没有表达。上述因子在含20mL/LFBS与20mL/LFBS+10g/LITS的培养基中表达最低,但20mL/LFBS+10g/LITS的培养基中RPE细胞生长良好。结论:在RPE细胞和上清液中有TNF-α,VEGF、βFGF、TGFβ2及casepase-3的表达。20mL/LFBS+10g/LITS的混合培养基可能是维持正常RPE细胞生长的一种理想培养基。     

Bcl-2反义寡核苷酸抑制视网膜色素上皮细胞增生的实验研究

目的 探讨不同浓度的Bcl-2反义寡核苷酸(bcl-2AS-ODN)对人视网膜色素上皮(RPE)细胞增生活性的影响。方法 使用不同浓度(0、15、30、45、60μmol／L)的bcl-2AS-ODN和bcl-2 S-ODN处理人RPE细胞24h后，使用MTT、氚-标记脱氧胸苷掺人试验(^3H-TdR)测定RPE细胞增生的抑制率及DNA合成抑制率；使用流式细胞仪检测其对RPE细胞周期的影响；使用免疫组织化学染色法检测不同浓度bcl-2 AS-ODN作用下的RPE细胞bcl-2的表达。结果 不同浓度bcl-2 AS-ODN处理过的RPE细胞的抑制率和DNA合成抑制率随bcl-2 AS-ODN浓度的增高而升高，bcl-2 AS-ODN将RPE细胞阻滞在G0／G1期，免疫组化结果显示：bcl-2 AS-ODN可抑制RPE细胞bcl-2的表达。结论 bcl-2 AS-ODN对RPE细胞的增生有抑制作用且呈浓度依赖性，这一结果有可能成为增生性玻璃体视网膜病变(PVR)基因治疗的一个新靶点。     

INF-γ和TGF-β1对视网膜色素上皮细胞端粒酶活性的影响

目的 探讨不同浓度的干扰素-γ(interferon-γ，INF-γ)和转化生长因子-β1(transforming growth factor-βl，TGF—β1)对人视网膜色素上皮(RPE)细胞端粒酶活性的影响。方法 使用不同浓度的INF-γ和TGF—βl处理RPE细胞24h后，采用端粒重复序列扩增法定性、定量检测上述细胞因子作用下的RPE细胞端粒酶活性。结果 随着上述细胞因子浓度的增加，RPE细胞端粒酶活性逐渐降低，且呈剂量依赖性，2种细胞因子具有协同作用。结论 INF-γ和TGF—βl对RPE细胞端粒酶活性具有抑制作用，细胞因子有可能成为治疗增生性玻璃体视网膜病变的新靶点。     

TGF-β对体外培养人胚视网膜色素上皮细胞的影响

目的 研究转化生长因子-β（TGF-β）对体外培养人胚视网膜色素上皮（RPE）细胞的影响，从细胞生物学水平和分子生物学水平探讨近视眼的发病机制。方法 外源性TGF-β刺激人RPE细胞后，通过绘制生长曲线、MTT法检测细胞活性及观察透射电镜研究其细胞自身的生长情况；采用酶联免疫吸附实验（ELISA）测定其分泌HGF、bFGF和TGF-β的量；采用RT-PCR法检测其细胞表达HGF的情况，从而分析外源性TGF-β对体外培养的RPE细胞的影响。结果不同质量浓度的TGF-β均可抑制人胚RPE细胞的生长，随时间的延长作用更加明显；TGF-β可使RPE细胞超微结构发生变化；ELISA结果显示TGF-β对其他两种因子的分泌均有抑制作用，但对自身有促进作用，为正反馈调节；同时可明显抑制RPE细胞内HGF的表达。结论 TGF-β可影响RPE细胞增生、改变超微结构及抑制HGF的表达。     

内质网应激对光照诱导的人视网膜色素上皮细胞损伤的促进作用

背景 视网膜色素上皮(RPE)细胞的光损伤模型是多种视网膜变性类疾病的研究工具,光诱导RPE细胞损伤的主要病理基础是凋亡及炎症反应,但是内质网应激(ERS)反应是否参与其病理机制的研究国内外少有报道. 目的 探讨ERS对光损伤诱导的人RPE细胞凋亡的作用及其机制.方法 体外培养人RPE细胞株(ARPE-19),将培养的细胞分为正常对照组及光照3、6、12和24 h组,各光照组在培养箱内以(2 000± 500) lx的白色荧光灯光照细胞建立光损伤模型,正常对照组细胞在暗环境中培养且不给予光照射,筛选实验最适光照时间.将细胞分为正常对照组、光照组(光照12h)和苯基丁酸(4-PBA)预处理+光照组,4-PBA预处理+光照组先用ERS抑制剂4-PBA培养细胞30 min,然后光照细胞12h.采用流式细胞仪检测各组人RPE细胞的凋亡率和细胞内活性氧(ROS)的荧光强度;采用ELISA法检测各组细胞上清液中炎性因子白细胞介素-1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)质量浓度;分别采用实时荧光定量PCR和Western blot法检测人RPE细胞中ERS标志物活化转录因子-6(ATF-6)、C/增强结合蛋白同源蛋白(CHOP)和细胞凋亡标志物半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-12(caspase-12) mRNA及其蛋白的表达. 结果 光照后细胞形态呈长梭形改变,边界不清,细胞质脱颗粒,细胞碎片增多,且随光照时间的延长而加重.流式细胞仪检测发现,随光照时间的延长,人RPE细胞内ROS含量逐渐增加,细胞凋亡率逐渐升高,差异均有统计学意义(F=763.00、119.30,均P＜0.01).ELISA法检测发现,与正常对照组比较,光照后6h细胞上清液中IL-1β和TNF-α质量浓度均明显升高,12h达峰.实时荧光定量PCR和Western blot检测显示,与正常对照组比较,光照后人RPE细胞中ATF-6、CHOP和caspase-12 mRNA及其蛋白的相对表达量均明显升高,均于光照后12h达峰或升高,故选择光照12 h为最适光照时间作为后续研究.4-PBA预处理+光照组细胞中ATF-6、CHOP和caspase-12 mRNA的相对表达量均明显低于光照组,差异均有统计学意义(F=281.69、473.88、308.45,均P＜0.01);ATF-6、CHOP和caspase-12蛋白的相对表达量均明显低于光照组,差异均有统计学意义(F=47.86、57.93、106.59,均P＜0.01);细胞凋亡率、细胞上清液中IL-1β和TNF-α质量浓度均明显低于光照组,差异均有统计学意义(F=88.64、245.47、101.01,均P＜0.01). 结论 (2 000±500)lx的光照可诱导人RPE细胞内ROS增加,并激活细胞的ERS反应,导致RPE细胞凋亡及炎症反应.ERS抑制剂4-PBA可抑制光损伤导致的ERS反应,进而降低RPE细胞凋亡率并抑制炎症反应过程.     

胰岛素对人RPE细胞增殖及转化生长因子-β2分泌的影响

目的:探讨胰岛素对RPE细胞增殖和分泌转化生长因子-β2(TGF-β2)的影响。方法:将不同浓度的胰岛素(0.1～10×103U/mL)加入培养基刺激ARPE-19细胞不同时间(0～48h)。采用MTS法检测RPE细胞的增殖情况;采用ELISA法检测各种处理情况下RPE细胞分泌TGF-β2的情况,Real-time PCR法检测TGF-β2mRNA的表达情况。结果:MTS结果显示,作用12h后,各实验组与对照组比较RPE细胞明显增殖(P<0.05)。ELISA结果表明胰岛素可明显促进RPE细胞分泌TGF-β2,并呈时间及剂量依赖性。Real-time PCR结果显示,胰岛素作用24h后,TGF-β2mRNA表达上调(P<0.01),且10×103U/mL胰岛素组TGF-β2mRNA表达明显高于0.1×103U/mL胰岛素组(P<0.01)。结论:RPE细胞是眼内近视信号因子TGF-β2的重要来源,胰岛素可以通过促进RPE细胞增殖并分泌TGF-β2进行信号传递,促进近视发生。     

17-β雌二醇对高糖诱导RPE细胞保护作用的研究

目的:探讨17-β雌二醇对高糖诱导人视网膜色素上皮(retinal pigment epithelial,RPE)细胞的保护作用和可能机制.方法:RPE细胞传代培养,随机对照法分为四组:空白对照组:5.5 mmol/L葡萄糖常规培养基进行处理;高糖组:100 mmol/L葡萄糖作用12 h;17-β 雌二醇低浓度组:10μmol/L 17-β雌二醇孵育24 h后,加入100 mmol/L葡萄糖作用12 h;17-β雌二醇高浓度组:100μmol/L 17-β雌二醇孵育24 h后,加入100 mmol/L葡萄糖作用12 h.MTT比色法检测细胞活力,Hochest33258染色观察细胞凋亡,H2 DCFDA染色检测细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平,比色法检测过氧化氢酶(catalase,CAT)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和丙二醛(malondialdehyde,MDA)的表达.结果:随着葡萄糖浓度的增加,RPE细胞活性逐渐下降,17-β雌二醇能明显抑制高糖诱导的RPE细胞活力的下降,降低RPE细胞凋亡率,抑制细胞内ROS生成.此外,17-β雌二醇能明显增加RPE细胞内CAT、SOD表达,降低MDA的表达.结论:17-β雌二醇能有效抑制高糖对RPE细胞的损伤,从而为用于治疗视网膜相关疾病提供可靠的实验依据.     

转bak基因对培养的人视网膜色素上皮细胞增生的抑制作用

目的观察导入bak基因对人视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)细胞增生的抑制作用。方法用脂质体将bak基因导入人RPE细胞，通过原位杂交和免疫组化法检测bak mRNA和bak蛋白的表达。采用流式细胞仪检测细胞周期的变化，四甲基偶氮唑盐(tetrazolium，MTT)比色法检测bak对细胞生长的抑制作用。结果bak基因成功转入人RPE细胞。转染第3天bak mRNA阳性率68％，bak蛋白表达率62％．细胞周期分析见凋亡峰，凋亡率35％．bak基因对人RPE细胞的抑制存在时间一效应关系。结论转入bak基因可诱导人RPE细胞凋亡从而抑制其增殖。     

Bax过表达诱导培养的人视网膜色素 上皮细胞凋亡观察

目的研究外源性促凋亡基因bax过表达对培养人的视网膜色素上皮（retinal pigment epithelium ,RPE）细胞凋亡的影响。 方法通过脂质体Lipofectin介导法用含人全长bax 基因片段的真核表达载体P^MDNA3-hbax质粒转化体外培养的RPE细胞,用流式细胞仪检测细胞周期的变化,提取实验组细胞DNA进行DNA梯度电泳。结果Zn^2+可诱导P^MDNA3-hbax转化组RPE细胞出现明显的凋亡峰 ,凋亡峰位于单倍体和二倍体之间,凋亡率为36%,DNA电泳可见DNA梯状条带,P^MDNA3空载体组及未转染组RPE细胞未见亚二倍峰和DNA梯状条带出现。结论外源性促凋亡基因bax过表达可诱导RPE细胞凋亡。(中华眼底病杂志,2001,17:132-134)     

全反视黄酸对培养的人视网膜色素上皮细胞的影响

目的观察全反视黄酸（all-trans retinoic acid,ATRA）对培养的视网膜色素上皮细胞（retinal pigment epitheli-um,RPE）的形态、增殖以及对RPE细胞中转化生长因子-β2（transforming growth factor-β2,TGF-β2）表达的影响,并探讨ATRA与近视的关系。方法RPE传代至第3代后以1×10^5/孔的密度接种于96孔板或以1×10^6的浓度接种于250ml培养瓶,以10%FBS的F12培养液培养48h后转为0.5%FBS的F12培养液,12h后培养液转换为F12和1nM/ml、5nM/ml、10nM/ml、20nM/ml、30nM/ml的ATRA。以未加ATRA组作对照。48h后观察RPE细胞形态,并以MTT法测定其增殖情况,以流式细胞技术检测其细胞凋亡情况,以免疫组化方法检测RPE细胞TGF-β2表达,并以酶联免疫吸附实验（enzyme-linked immunosorbnent assay,ELISA）方法测定其上清液的TGF-β2浓度。结果不同浓度的ATRA对RPE细胞的形态、增殖有不同的影响。〈10nM/ml的ATRA对RPE细胞的增殖无影响,细胞形态正常,MTT法显示在这些浓度下ATRA对RPE的增殖影响差异无显著性（P〉0.05）;10nM/ml、20nM/ml、30nM/ml的ATRA抑制RPE的增殖,MTT法显示ATRA对RPE有明显的抑制作用（P值分别为P〈0.05,P〈0.01,P〈0.001）,该效应呈剂量依赖性反应。RPE细胞增大变平,突起减少,部分裂解,活力减弱。流式细胞技术检测提示,10nM/ml、20nM/ml、30nM/ml浓度下细胞凋亡率分别为14.58%、19.95%和21.69%。免疫组化方法检测提示,当RPE的ATRA浓度大于10nM/ml时,TGF-β2的表达随浓度增高而增加。ELISA结果显示,ATRA浓度〉10nM/ml时,RPE分泌TGF-β2的浓度增加。结论1nM/ml、5nM/ml的ATRA可维持培养的人RPE的生长,≥10nM/ml引起RPE的增殖抑制,并可诱导RPE的凋亡。10nM/ml及以上的ATRA引起的RPE病理性改变为理解近视眼的RPE改变提供了一条思路,≥10nM/ml的ATRA诱导RPE的TGF-β2表达增加可能导致TGF-β2拮抗碱性成纤维细胞生长因子的作用增强,使后者抑制近视发生的作用减弱而促进近视的发展。     

非促分裂haFGF对H2O2损伤的人RPE细胞的保护作用

目的 研究非促分裂人酸性成纤维细胞生长因子(nm-haFGF)对H2O2 损伤的人视网膜色素上皮(RPE)细胞的保护作用.方法 利用H2O2 建立人RPE细胞氧化损伤模型,采用MTT法检测RPE细胞的存活率,核染色观察RPE细胞的核形态,流式细胞仪检测RPE细胞死亡率以及Western blot检测bcl-2的表达.结果 nm-haFGF预处理可以提高H2O2 损伤的REP细胞的存活率;nm-haFGF质量浓度在0～10 mg/L的范围内,RPE细胞存活率从67.4%上升至92%;nm-haFGF刺激后,RPE细胞的bcl-2表达增加.结论 nm-haFGF对H2O2 氧化损伤RPE的细胞具有保护作用,并在一定范围内呈质量浓度依赖性.其保护机制可能是通过bcl-2的增加而产生抗凋亡作用.     

人视网膜色素上皮细胞累积性氧化损伤的机制探讨

目的探讨累积性氧化损伤对培养的人视网膜色素上皮（human retinal pigment epithelium,RPE）细胞生长的影响及其影响机制.方法体外培养的人RPE细胞中加入600 μmol/L过氧化氢（hydrogen peroxide,H2O2）,分别培养1、6、12、24、72 h,采用四甲基偶氮唑盐比色（MTT）法检测不同时段H2O2对人RPE细胞生长的影响,应用荧光素标记的连接素V-碘化丙锭（annexin V-fluorescein isothiocyanate-propidium iodium,Av-FITC-PI）双染色流式细胞法测定人RPE细胞凋亡.采用免疫印迹法检测衰老相关蛋白Clusterin的表达.结果（1）MTT法检测结果：600 μmol/L的H2O2作用6 h,即可抑制人RPE细胞生长,H2O2作用时间延长至24 h,其作用时间与人RPE细胞增长抑制率成正比.（2）Av-FITC-PI法检测结果：600 μmol/L的H2O2作用6 h,可诱导人RPE细胞凋亡,且随时间的延长而增加,差异有统计学意义（P＜0.05）;而72 h后则引起细胞的坏死.（3）免疫印迹法检测结果：Clusterin蛋白在正常人RPE细胞呈弱表达,H2O2作用12 h可见Clusterin蛋白表达增强,24 h组表达开始减弱,72 h组仅见微弱表达.结论600μmol/L的H2O2长时间作用可抑制人RPE细胞生长,诱导人RPE细胞凋亡;同时诱导衰老相关蛋白Clusterin的表达;而更长时间的累积损伤则造成人RPE细胞的坏死.H2O2氧化损伤可以模拟人RPE细胞的老年性改变.     

不同波长的光照射对视网膜色素上皮细胞生长及其分泌生长因子的影响

背景近视的发病机制是眼科研究的一个热点,近年来发现,由神经视网膜细胞及视网膜色素上皮（RPE）细胞分泌的细胞因子可能参与近视的发病,RPE细胞因子的分泌功能受光照射的影响,而RPE细胞对不同波长光的吸光度（A）值是不一样的。目的研究不同波长的光照射对人胚RPE细胞增生及其分泌肝细胞生长因子（HGF）、碱性成纤维细胞生长因子（bVGF）和转化生长因子-β（TGF—β）的影响,从细胞水平和分子生物学水平探讨近视的发病机制。方法第4～5代人胚RPE细胞置于白光、波长为775nm的红光及波长为480nm的蓝光下照射和培养48h,MTT比色法检测各组人RPE细胞的增生情况,并用透射电子显微镜观察各组传代细胞的超微结构。分别于光照射后12、24、48、72h收集培养液,采用酶联免疫吸附实验（ELISA）测定培养基中HGF、bFGF和TGF—β的质量浓度。用逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）检测不同波长光照射24h后RPE细胞中HGFmRNA的表达水平,分析蓝光、红光、白光照射对体外培养RPE细胞的影响。结果蓝光组、红光组、白光组和对照组RPE细胞的A490值分别为0．0218±0．0014、0．0353±0．0025、0．0371±0．0024和0．0445-0．0046。4个组中RPE细胞的增生速度明显不同,差异有统计学意义（F=12．579,P〈0．05）,蓝光组和红光组A490值均明显低于对照组,差异均有统计学意义（t=2．043、t=2．024,P〈0．05）。ELISA结果显示人胚RPE细胞可以分泌HGF、bFGF和TGF-β,在受到不同波长的光照射后,不同时间点HGF、bFGF和TGF—β的分泌量不同,随着时间的变化,4个组HGF、TGF—β的质量浓度均逐渐升高,二者在72h和48h均高于12h（P〈0．05）,红光组与蓝光组更为明显,与对照组比较差异均有统计学意义（P〈0．05）。各波长组bFGF的质量浓度随着光照时间的延长在RPE细胞中的表达均逐渐降低,72h与12h时相比差异均有统计学意义（P〈0．05）。RT—PCR结果显示,不同波长光照射后RPE细胞中HGFmRNA的表达水平不同,蓝光下培养的RPE细胞HGFmRNA表达量最少,白光组、红光组和蓝光组HGFmRNA的表达量（A490）与对照组比较差异均有统计学意义（P〈0．05）。透射电子显微镜下红光组、白光组人胚RPE细胞与对照组相比超微结构均无明显变化,但蓝光组RPE细胞核染色质稀疏变淡,细胞器减少,细胞界膜不清或消失。结论不同波长的光照射可影响人RPE细胞的增生及其分泌HGF、bFGF和TGF—β的功能,提示近视的形成可能与不同波长的光相互作用有关。     

视网膜色素上皮细胞体外凋亡过程中钙离子平衡与caspase-3基因表达

目的:研究钙通道拮抗剂-维拉帕米(verapamil,Ver)诱导视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)细胞凋亡过程中钙离子及凋亡基因caspase-3变化。方法:应用80mg/L的Ver分别作用健康人眼RPE细胞12,24及48h诱导凋亡,设立对照组。逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测凋亡基因caspase-3的表达,采用Fluo-3/AM负载技术,MetaFluo4.5/coolsnapfx/IX70细胞内钙离子荧光成像系统测定每组20个RPE细胞钙荧光值,并计算RPE细胞内钙浓度([Ca2+]i)。结果:对照组RPE细胞Ca2+荧光分布胞核最强,胞质次之。Ver作用12,24及48h后,细胞内[Ca2+]i明显降低(P<0.01)。对照组RPE细胞可见caspase-3的mRNA有少量的表达。Ver作用12h后,可见caspase-3的mRNA有较高的表达,与对照组比较,具有显著性差异(P<0.01)。随着Ver作用时间的延长,caspase-3的mRNA表达逐渐增强,在48h时有所下降。结论:Caspase-3基因表达上调及RPE细胞内钙离子稳态失调可能在Ver诱导RPE细胞凋亡中起关键作用。     

TGF-β1诱导体外培养角膜成纤维细胞结缔组织生长因子的表达

目的观察转化生长因子β1(transforminggrowthfactorβ1,TGFβ1)对体外培养的角膜成纤维细胞结缔组织生长因子(connectivetissuegrowthfactor,CTGF)的诱导表达作用。方法体外培养的角膜成纤维细胞分实验组和对照组,对照组弃原培养液,加无血清培养液继续培养,实验组用不同浓度的TGFβ1(0.1μg·L-1、1μg·L-1、10μg·L-1)处理24h,用RTPCR方法检测角膜成纤维细胞CTGFmRNA的表达情况。结果1μg·L-1和10μg·L-1TGFβ1处理组CTGF/GAPDH像素比值分别为0.35±0.05和1.25±0.10,均较对照组高(0.13±0.02),差异具有统计学意义,同时CTGF/GAPDH比值随TGFβ1浓度增加而增加。结论TGFβ1可以诱导角膜成纤维细胞CTGF的表达,在角膜成纤维细胞中CTGF也可能是TGFβ1对细胞起作用的下游信号分子。