高亲和力抗角蛋白人抗体的基因工程制备

目的 制备亲和力高、性能良好的人源性抗角蛋白抗体。方法 以人表皮角蛋白为抗原从噬菌体抗体库中克隆特异性抗角蛋白抗体,采用基因随机点突变和链替换(chain-shuffing)技术对所获抗体进行亲和力成熟,并对其生物学性能进行一系列鉴定。结果 经过筛选半合成抗体库和天然抗体库,成功获得了4株能与角蛋白特异性结合的人源性抗角蛋白IgG或IgM抗体;对抗体基因的随机突变未产生预期的性能改进,又选择其中活性最好的一株IgG抗体,通过轻链替换和重链替换使抗体亲和力得到了有效提高,达到8×10¹⁰/M的理想水平。结论 用基因工程的方法可以制备高质量的人源性抗角蛋白抗体。     

单克隆天然抗角蛋白抗体384抑制白念珠菌芽管生成的研究

目的观察单克隆天然抗角蛋白抗体384与自念珠菌结合及对芽管生成的影响。方法采用ELISA和流式细胞仪检测单克隆天然抗角蛋白抗体384与白念珠菌结合，并将抗体与真菌共孵育，检测白念珠菌芽管生成的变化。结果ELISA和流式细胞仪检测均发现384可以与白念珠菌结合；相对于同型对照组，384作用组真菌芽管生成率显著下降，两组差异有统计学意义。结论单克隆天然抗角蛋白抗体384可以与白念珠菌结合并抑制其芽管生成，提示天然IgM在机体抗真菌天然免疫中可能具有一定的作用。     

天然抗角蛋白自身抗体产生细胞的检测

目的明确产生天然抗角蛋白自身抗体(anti-keratin autoantibody,AK auto Ab)的B细胞的类群和定位。方法取SPF级C57BL/6小鼠的腹腔细胞及脾细胞,进行体外培养,采用ELISA方法分析培养细胞分泌AK auto Ab的水平,ELISPOT方法分析分泌AK auto Ab的细胞数。结果腹腔细胞中分泌AK auto Ab的细胞数远多于脾细胞,其分泌的抗体滴度也显著高于脾细胞。结论AK auto Ab主要来源于腹腔B细胞,B1细胞可能是产生AK auto Ab的主要细胞。     

角蛋白,抗角蛋白自身抗体和银屑病

被作为上皮类型和分化阶段的分子标志－角蛋白，在银屑病患者表皮内明显地表现异常，并且这种异常改变不仅仅出现在皮损区域。最新研究提示屑病患者角朊细胞本身存在缺陷，它们较正常角朊细胞分化能力低下。直接以不同分子量的角蛋白作为对象的抗角蛋白自身抗体，也与银屑病有着明显的联系。有的角蛋白和抗角蛋白自身抗体可以作为判断银屑病的病情以及疗效、治愈标准的指标。深入研究银屑病患者角蛋白、抗角蛋白自身抗体的变化对进一     

单克隆天然抗角蛋白抗体3B4抑制白念珠菌芽管生成的研究

目的 观察单克隆天然抗角蛋白抗体3B4与白念珠菌结合及对芽管生成的影响.方法 采用ELISA和流式细胞仪检测单克隆天然抗角蛋白抗体3B4与白念珠菌结合,并将抗体与真菌共孵育,检测白念珠菌芽管生成的变化.结果 ELISA和流式细胞仪检测均发现3B4可以与白念珠菌结合;相对于同型对照组,3B4作用组真菌芽管生成率显著下降,两组差异有统计学意义.结论 单克隆天然抗角蛋白抗体3B4可以与白念珠菌结合并抑制其芽管生成,提示天然IgM在机体抗真菌天然免疫中可能具有一定的作用.     

天然抗角蛋白IgM调理巨噬细胞吞噬金黄色葡萄球菌的作用

目的 探讨天然抗角蛋白IgM对金黄色葡萄球菌的结合反应和介导调理吞噬的功能。方法 ELISA法及间接免疫荧光法检测天然抗角蛋白IgM抗体3B4与金黄色葡萄球菌的结合。将3B4与金黄色葡萄球菌作用后与巨噬细胞共孵育,菌落形成实验及流式细胞仪分析3B4介导细菌的调理吞噬作用。结果 ELISA与间接免疫荧光均发现3B4可以与细菌结合,菌落形成实验显示3B4作用组菌落数量显著少于阴性对照组,流式细胞仪分析显示巨噬细胞对3B4作用后细菌的吞噬作用明显增强。结论 天然抗角蛋白IgM抗体3B4可以结合并介导调理吞噬金黄色葡萄球菌,提示天然IgM在抗细菌天然免疫中具有一定的作用。     

角蛋白、抗角蛋白自身抗体和银屑病

被作为上皮类型和分化阶段的分子标志——角蛋白,在银屑病患者表皮内明显地表现异常并且这种异常改变不仅仅出现在皮损区域。最新研究提示银屑病患者角朊细胞本身存在缺陷,它们较正常角朊细胞分化能力低下。直接以不同分子量的角蛋白作为对象的抗角蛋白自身抗体,也与银屑病有着明显的联系。有的角蛋白和抗角蛋白自身抗体可以作为判断银屑病的病情以及疗效、治愈标准的指标。深入研究银屑病患者角蛋白、抗角蛋白自身抗体的变化对进一步了解银屑病可能提供一些有益的启迪。     

抗角蛋白单克隆抗体5G5对培养角质形成细胞增殖的影响

目的 研究抗角蛋白单克隆抗体5G5在无血清培养的角质形成细胞中的免疫学活性,观察其对角质形成细胞增殖的影响。方法 免疫组化观察5G5对角质形成细胞的反应性;从培养的角质形成细胞中提取角蛋白,免疫印迹法检测5G5所识别的角蛋白区带;四甲基偶氮唑蓝比色法(MTT法)测定5G5对细胞增殖的影响。结果 5G5仅识别角质形成细胞中相对分子质量为50000的角蛋白区带,呈现为一条很强的染色带,而未与其它分子质量的角蛋白反应;免疫组化染色明显呈胞浆阳性;该单克隆抗体明显抑制培养的角质形成细胞增殖,并且存在剂量依赖关系。结论 特异性抗相对分子质量为50000角蛋白的抗体可能是角蛋白抗体家族中影响角质形成细胞增殖的有效成分。     

天然抗角蛋白自身抗体识别的角蛋白模拟表位的研究

目的 探索利用天然抗角蛋白自身抗体(AK auto Ab)淘筛噬菌体递呈的随机肽库,获得在体内具有功能活性的角蛋白模拟表位方法。方法 用角蛋白亲和层析柱从正常人混合血清中分离并纯化AK auto Ab,然后进行生物素标记;用生物素化的AK auto Ab对噬菌体递呈的随机15肽库进行3轮淘洗并进行ELISA检测;挑取23个阳性克隆进行DNA测序,分析所获数据并进行竞争实验。结果 DNA测序分析表明,AK auto Ab特异识别3个抗原表位区:SLSPMPTTNRR、PPLIPIPLRTM和TTPRPPMRIMLPRIT,其中SLSPMPTTNRR可能含有优势表位;携有这些短肽的噬菌体可与AK auto Ab特异结合,角蛋白可阻断这种特异的结合反应。结论 利用噬菌体随机肽库技术成功地获得了AK auto Ab所识别的角蛋白模拟表位。     

对一株基因工程人抗角蛋白抗体的免疫学鉴定

目的 对1株基因工程人抗角蛋白抗体识别抗原的特性进行鉴定。方法 利用从噬菌体抗体库中筛选到的特异表达抗角蛋白的Fab片段的质粒转化大肠杆菌,IPTG诱导表达出Fab片段,用ELISA鉴定抗原结合活性和特异性,用蛋白免疫印迹和竞争抑制性ELISA检测抗体所识别的角蛋白组分。结果 该株基因工程人抗角蛋白抗体的结合活性和特异性良好,所识别的抗原为相对分子质量46000角蛋白,为特异性人抗角蛋白K17抗体。结论 该抗体具有优良的免疫学特性,有必要对其生物学活性和临床应用前景做进一步探讨。     

抗角蛋白单克隆抗体对舌鳞癌细胞角蛋白酪氨酸磷酸化的作用

目的观察抗角蛋白抗体对角蛋白酪氨酸磷酸化的影响。方法以鼠抗人角蛋白的IgG单克隆抗体作用于培养中的Tca8113,以抗乙肝病毒表面抗原抗体做阴性对照,同时设置阳性对照和空白对照。细胞固定、包埋后以胶体金标记的羊抗鼠IgG抗体染色,用透射电镜观察。提取抗体作用过Tca8113细胞角蛋白,以抗乙肝病毒表面抗原抗体作用的细胞做阴性对照。不同分子量的角蛋白经SDSPAGE分离后转膜,用抗酪氨酸磷酸化抗体作用、显色。结果抗角蛋白抗体作用的Tca8133细胞胞质的中间丝有胶体金颗粒,与阳性对照组类似。阴性对照组及空白对照均未见胶体金颗粒。转膜后染色,在分子量大约58KD处出现阳性条带。阴性对照未出现条带。结论抗角蛋白抗体结合于胞浆中间丝,58KD角蛋白发生酪氨酸磷酸化。     

基因工程抗角蛋白抗体在正常皮肤和几种表皮增生性皮肤病皮损中的反应定位

目的　探索一株基因工程人源性抗角蛋白Fab抗体在正常皮肤及几种表皮增生性皮肤病皮损中的反应定位。方法　利用从噬菌体抗体库中筛选到的特异表达抗角蛋白Fab片段的质粒转化大肠杆菌 ,IPTG诱导表达出Fab抗体 ,纯化鉴定后用此抗体对正常皮肤及银屑病、鳞癌、基底细胞癌和脂溢性角化病皮损进行免疫组化染色。结果　正常皮肤表皮呈阴性染色 ,毛囊呈阳性染色 ,银屑病、鳞癌、基底细胞癌和脂溢性角化病皮损均呈现明显的阳性着色 ,其中银屑病皮损基底细胞层为强阳性。所有细胞染色部位均位于胞质 ,胞核未见着色 ,真皮为阴性。结论　该株人源性抗角蛋白Fab抗体主要与表皮组织结合 ,对银屑病等表皮增生性皮肤病的损害具有较高特异性。     

Keratin specificity analyses of eight anti-keratin monoclonal antibodies,and their immunostaining patterns in normal skin using formalin-fixed and paraffin-embedded tissue specimens

Keratin specificity analyses of eight anti-keratin antibodies (34B4 (K1), 35H11 (K8), Ks 13.1 (K13), Ks 19.1 (K19), PKK1, LP34 (CK1), KL1 and AE1) using keratin protein derived from normal thigh epidermis, normal parotid gland and a human squamous cell carcinoma cell line (HSC-5) were performed, and compared with those described in the data sheets. The reactivities of LP34, KL1 and PKK1 were markedly different from those mentioned in the data sheets. The immunostaining pattern of these antibodies in normal skin using formalin-fixed and paraffin-embedded tissue specimens was also examined. The staining patterns of suprabasal keratinocytes (K1, K13, CK1 and KL1 positive), basal cells of the epidermis (PKK1 and AE1 positive), inner cells of the ducts (K8, K13, CK1, KL1 and AE1 positive) and secretory cells of sweat glands (K8, K19, PKK1, KL1 and AE1 positive), mature cells (K8 and KL1 positive) and peripheral cells (CK1, KL1 and AE1 positive) of sebaceous glands and outer root sheaths (PKK1, CK1, KL1 and AE1 positive) were specific. Thus, we conclude that the differentiation of epidermis and skin appendages is possible by immunostaining with these eight anti-keratin antibodies using formalin-fixed and paraffin-embedded tissue specimens with proper protease pretreatment.     

角蛋白17的置换肽的克隆表达及纯化

目的克隆角蛋白17的置换肽(APL),表达并纯化置换肽。方法将人工合成的置换肽DNA片段连接至表达载体pGEX4T1,转化大肠杆菌,IPTG诱导表达融合蛋白,分析鉴定表达蛋白,并纯化蛋白。结果①连接到载体的DNA序列,序列测定证实与已知序列一致;②成功构建了融合表达载体;③表达了pGEX4TS12E融合蛋白;④得到纯化的融合蛋白。结论人角蛋白17的置换肽的克隆成功及融合蛋白的表达与纯化,为进一步探索置换肽的功能打下了基础。     

梅毒IgM抗体检测技术的现状

梅毒是由梅毒螺旋体引起的一种慢性传染病,主要通过性行为传播,也可通过母婴垂直传播,临床表现复杂.目前梅毒的诊断及疗效判断均依赖于实验室检测,其中血清学抗体检查起着重要作用.研究表明,IgM抗体检测有望成为梅毒早期感染、胎传梅毒、神经梅毒以及复发梅毒诊断的有效检测技术之一,对有关IgM抗体检测技术研究进展以及临床应用现状进行综述.     

人源性抗角蛋白单链抗体的构建及表达

目的 用基因工程技术制备人源性抗角蛋白抗体单链抗体(single chainFv,ScFv),并对其抗原结合特性等进行鉴定。方法 利用基因重组技术对从半合成噬菌体抗体库中克隆的人源性抗角蛋白抗体Fab片段进行改造,获得了人源性抗角蛋白ScFv片段,并进行DNA序列分析。同时用ELISA法鉴定ScFv的抗原结合活性和特异性。结果 DNA序列分析结果表明,单链抗体表达载体(pScFv)的Vκ和VH基因序列同Fab片段的Vκ和VH基因序列完全相同,表明在Fab片段改建成ScFv过程中未发生基因突变。可溶性表达的ScFv抗体能特异性地与角蛋白结合,而与其它抗原,如铁蛋白、胃蛋白酶、HBsAg等无关抗原不结合,说明人源性抗角蛋白Fab抗体改建为ScFv后具有较好的特异性,但可溶性表达的ScFv与角蛋白的结合活性低于可溶性Fab片段。结论 成功表达并鉴定了人源性抗角蛋白的ScFv可溶性片段,为人源性抗角蛋白抗体工程化、进一步研究该抗体的生物活性并提高其临床应用价值奠定了基础。