一种具有纤溶活性的蛋白酶的分离纯化及性质

目的分离纯化BacillussubtilisJin2 1发酵产生的具有纤溶活性的蛋白酶 ,并对其性质进行研究。方法通过硫酸铵分级盐析 ,SerineSepharose 2B和SephacrylS— 2 0 0色谱柱进行分离纯化 ,用SDS PAGE测定纯度 ,SDS PAGE和凝胶层析测定相对分子质量 ,纤维蛋白平板法测定酶活力。结果分离得到了电泳纯的酶 ,该酶的相对分子质量为 2 8kD ,等电点约为 8 6 ,最适 pH为 7 5 ,最适温度为 4 0℃ ,在 4 0℃以下较稳定 ,超过 5 0℃时酶活力开始下降 ;金属离子Mn2 + 对酶有明显的激活作用 ,而Zn2 + 对酶有抑制作用 ,二异丙基磷酰氟 (DFP)和苯甲基磺酰氟 (PMSF)完全抑制酶活性。结论该酶是一种丝氨酸蛋白酶 ,与纳豆激酶相似 ,有望开发成为一种新型口服溶栓药物     

盐对短杆菌肽S及其衍生物溶菌活性的影响

研究膜亲合抗生素短杆菌肤S对细菌细胞作用,认为该抗生素及其衍生物分子中鸟氨酸的游离氨基的溶菌活性,对悬浮在糖-磷酸盐缓冲液中的细菌细胞较之在糖水中的细菌细胞溶菌作用要大得多。短杆菌肽S对溶壁微球菌完整细胞膜的渗透作用的研究表明:只有在磷酸盐缓冲液中能提高抗生素的膜活性;在醋酸钠和碱金属氯化物等分子数磷酸盐缓冲液中则不改变抗生素的作用。本文就各种盐类对短杆菌肽S及其衍生物的细菌细胞溶菌活性影响进行比较研究。结果认为:在研究一系列氯化物对杆菌     

链霉菌RX-17溶菌酶的产生条件及溶菌特异性研究

通过液体及平板溶菌活性测定，证明了灰色链霉菌(Streptomyces griseus)RX-17发酵液中存在对变链球菌(Streptococcus mutans)lngbritt有强力溶解作用的物质-RX-17溶菌酶。产酶培养基碳、氮源最适配比为蔗糖3％、大豆蛋白胨1．25％、牛肉膏0．2％；最适产酶温度为33℃；高溶氧水平对酶的产生有利。溶菌特异性试验证实了RX-17溶菌酶对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、乳脂链球菌(S．cremaris)、保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)、短乳杆菌(L．brevis)、产氨短杆菌(Brevibacterium ammoniagenes)及铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)等多种G^ 、G^-细菌均有良好的溶解作用。     

猴头菌多糖的分离纯化及活性探讨

目的 :猴头菌多糖的分离纯化及活性探讨。方法 :人工栽培的猴头菌子实体经热水提取、去蛋白、超滤、醇化、真空干燥得多糖粗品 ,经 DEAE- 5 2、Sephacryl S- 4 0 0柱层析得到精品多糖 HEP,并对 HEP进行免疫活性研究。结果 :精品多糖HEP均一、分子量为 5 .5× 10 4 ,可明显增强细胞因子 IL- 2的生物活性。结论 :猴头菌多糖分离纯化工艺的建立及其免疫活性研究结果为以后进一步研究和开发猴头菌多糖提供了便利条件。     

菌丝霉素的高效表达、纯化及活性

将来自腐生子囊菌中的菌丝霉素成熟肽基因经大肠杆菌密码子优化后,克隆到pET32a(+)载体中,构建了含His-tag标签和TEV酶识别位点的菌丝霉素表达质粒pYG330,使含菌丝霉素的融合蛋白在大肠杆菌中以可溶形式高效表达.建立了菌丝霉素的纯化路线,将融合蛋白进行TEV酶切后脱盐再进行亲和色谱分离,收集目的蛋白冻干浓缩,通过高效液相色谱进一步纯化获得纯度72％的目的多肽.纯化所得菌丝霉素对临床耐药金黄色葡萄球菌M-2和枯草芽孢杆菌有明显的抑菌活性.     

快速蛋白液相色谱法纯化威廉环毛蚓纤溶酶及其活性研究

摸索威廉环毛蚓纤溶酶的分离纯化工艺和研究蚯蚓纤溶酶(earthw fibrinolytic enzyme，EFE)体内外的抗栓溶栓活性。通过提取，分步盐析，再经AKTAbasic蛋白快速液相色谱进一步纯化，得一组有纤溶活性的同工酶，其中一种比活较大达2000IU／mg。药理试验表明该酶有明显的抗拴溶栓活性。     

中国姥鲨软骨源溶菌酶样分子的分离纯化、部分氨基酸序列测定及体内抗肿瘤活性研究

用含0.02mol/L MES的1mol/L盐酸胍抽提新鲜中国姥鲨软骨组织,抽提物经Mr30000 PTTK膜超滤、 Sephacryl S-200和Superdex 75柱层析获得1种新的Mr为15200的高纯度蛋白质(Sp15),N-末端序列测定表明其与多种哺乳动物来源的溶菌酶具有相关性,并在体外具有显著的溶菌酶活性,其比活性高达223000U/mg ;Sp15在10μg/ml浓度下,可显著抑制血管内皮细胞的增殖,其抑制率高达75%;在8mg/kg剂量下,对小鼠移植的S180肉瘤的抑瘤率达33.3%,并可显著延长荷 S180 腹水瘤小鼠的生存时间.     

烟曲霉菌中抗真菌活性肽类物质的分离与纯化

目的从烟曲霉菌培养上清液中分离纯化具有抗真菌活性的肽类物质 (FIP)。方法用离子交换柱层析法分离 ,用反相高效液相色谱法进一步纯化 ,经聚丙烯酰胺凝胶电泳分析确定相对分子质量。结果从烟曲霉菌培养上清液中分离出一种具有抗真菌活性的FIP。纯化后得到高活性的精制FIP ,其相对分子质量约为 8kD ,MTT法测定结果表明 ,FIP对 5种真菌均具有明显的抗真菌效应。结论烟曲霉菌培养上清液中含有抗真菌活性的肽类物质。     

CK纤溶酶的分离纯化及其体外溶栓研究

目的:探索CK纤溶酶的分离纯化方法及观察其体外溶栓作用.方法:先用硫酸铵沉淀,然后通过羧甲基琼脂糖快速胶柱层析后进行分离纯化,并用SDS-PAGE测定纯度、相对分子质量,及其对人血凝块的水解活性.结果:得到了电泳纯的酶,其分子质量为27 000,且具有显著的体外溶栓作用.结论:CK纤溶酶有望开发成为一种新型口服溶栓药物.     

柱层析法纯化灯盏乙素的研究

目的优选灯盏乙素的柱层析纯化条件。方法采用高效液相色谱法检测纯度,考察了不同固定相和流动相对灯盏乙素分离效果的影响。结果灯盏乙素的最佳纯化工艺条件为:固定相200-300目的硅胶柱,流动相V(CH2Cl2)∶V(CH3OH)=5∶1,常压洗脱。结论该方法操作简单,分离效果好,使用成本低。     

连续硅胶柱色谱法快速纯化紫杉醇

采用连续中压硅胶柱色谱法纯化紫杉醇.优化的工艺条件为:以中压玻璃柱为色谱柱,120～160 μm层析硅胶为填料,1％紫杉醇负载量为2g/100g硅胶,样品二氯甲烷溶解上样,二氯甲烷:乙腈(7:3)洗脱,洗脱流速为60 mL/min.一次柱色谱过程即可得到纯度大于90％紫杉醇,回收率75％以上,甲醇:水3:1(v/v)重结晶后得纯度99％紫杉醇产品,低纯度组分作为层析原料再次纯化.使用后的层析柱用二氯甲烷:乙腈(1:1)再生,二氯甲烷平衡,平衡后的层析柱重复使用,使用5次柱分离效率仍不降低.与传统方法相比溶剂用量少、层析填料价格低、生产周期短、分离效果好,易于实现连续工业化清洁生产.     

γ-亚麻酸以柱色谱和甲酯化纯化的正交试验

富集月见草油中γ-亚麻酸(γ-linolenic acid,1)的方法主要有溶剂萃取法、银离子树脂色谱法、减压蒸馏法、低温结晶法、尿素包合法及超临界CO2萃取法等[1],国内主要采用尿素包合法[2].也可从月见草油中分离γ-亚麻酸甲酯[3].采用低温结晶法得到的1纯度仅30%～50%,减压蒸馏法可达50%～80%.国内合成前列腺E1是以二高γ-亚麻酸(dihomo-γ-linolenic acid,DGLA)为原料,而只有纯度大于90%的1才能合成得到较高纯度的二高γ-亚麻酸.采用银离子树脂色谱分离法可提高纯度,但也会引入银离子杂质,不利于药品质量控制.有报道用甲酯化工艺得到γ-亚麻酸甲酯的纯度为80%,收率50%[3].于世涛等[4]用酯交换法研究提高月见草油中1含量的工艺.但也未达到90%的纯度要求.为此本研究采用正交试验对纯度75%的1再次进行了柱色谱或甲酯化纯化.     

大孔吸附树脂联用硅胶柱层析法分离纯化冬凌草甲素

目的:建立大孔吸附树脂联用硅胶柱层析法分离纯化冬凌草甲素的工艺流程。方法:将冬凌草粉碎,用95%乙醇提取,浓缩成浸膏;以冬凌草甲素含量为指标,采用大孔吸附树脂联用硅胶柱层析法分离纯化冬凌草甲素,并用红外光谱、熔点测定和高效液相色谱(HPLC)法对重结晶产品的纯度和结构进行分析和表征。结果:优化的工艺为采用苯乙烯型大孔吸附树脂(HZ-841)先对浸膏进行粗分离,再选取乙酸乙酯-石油醚(6:4,V/V)为洗脱溶剂,石油醚-丙酮(2:3,V/V)为重结晶溶剂进行硅胶柱分离纯化,在此条件下,得到的冬凌草甲素含量为96.11%,提取率达到0.86‰。结论:所选工艺简单、可行,使用溶剂安全、无毒,提取效率高,可用于分离纯化冬凌草甲素。     

重组人血管内皮抑素的阳离子交换色谱复性与纯化条件研究

对rhEndostatin包涵体蛋白的色谱复性条件进行研究,摸索出最佳的复性、纯化条件,解决其在大肠杆菌中表达提取时遇到的蛋白变性问题。按实验条件对表达的rhEndostatin包涵体蛋白进行提取、洗涤、变性;利用正交法设计重组蛋白的色谱复性、纯化实验;利用SP-Sepharose Fast Flow阳离子交换柱对rhEndostatin包涵体蛋白进行了色谱复性、纯化。最佳复性条件为rhEndostatin上样浓度为2.5 mg/mL,洗脱体积流量为1/20床体积/min(3.5 mL/min),NaCl浓度0.1 mol/L,GSH/GSSG的浓度比为3/0.3 mmol/L。在此条件下纯度约97%,蛋白回收率为90%,重组蛋白的活性最高,IC50达到5μg/mL。     

果菠萝蛋白酶用TiO2多孔陶瓷柱层析结合超滤法纯化的研究

将TiO2、粘土、SiO2、CaCO3及活性炭混合，经高温烧结，制得可用于柱层析的TiO2多孔陶瓷。以陶瓷柱层析结合超滤法纯化果菠锣蛋白酶，产品比活力937u/mg蛋白，活力回收率48％，纯化倍8。     

门冬酰胺酶用DEAE-Sephadex A-50层析法纯化的研究

采用DEAE－SephadexA－50层析纯化门冬酰胺酶，HPLC检测结果表明，产品纯度和收经均有提高。     

SP-sephadex C25离子交换层析纯化细胞色素C的工艺研究

目的 :研究SP sephadexC2 5离子交换层析纯化细胞色素C的工艺。 方法 :用SP sephadexC2 5树脂取代AmberliteIRC 5 0树脂对细胞色素C进行纯化。结果 :SP sephadexC2 5离子交换纯化细胞色素C一次层析收率达 85 %以上 ,纯度达 98%左右。结论 :SP sephadexC2 5树脂用于细胞色素C的纯化 ,与用AmberliteIRC 5 0树脂相比 ,大大提高了层析得率和产品的纯度 ,提高了产品合格率。     

云南峨山番木瓜中木瓜蛋白酶的初步纯化及活性测定

应用FPLC系统对采自云南峨山县的番木瓜乳汁中的木瓜蛋白酶进行了初步纯化,同时,用基梅尔-史密斯法测定了番木瓜乳汁中木瓜蛋白酶的活性。结果表明:不同瓜形之间的木瓜蛋白酶活性大小没有明显差异,但与瓜的成熟度有关。     

银杏内酯的柱色谱制备

银杏内酯(1)是银杏叶提取物中的一类重要活性成分,包括银杏苦内酯(ginkgolideA、B、C,简称:GA、GB、GC)和白果内酯(bilobalide,简称:BB)。国内外学者研究表明[1],银杏苦内酯是特异性血小板活化因子(PAF)拮抗剂,PAF是多种疾病的介质之一。银杏叶提取物中1含量一般均在6%左右,我们对1原有提取方法作了改进[2],提取后成品1的含量可达95%以上,得率为4.2%。1　仪器与试剂银杏干浸膏(黄酮≥24%,内酯≥6%;邳州富伟生化制品有限公司)。2　方法与结果2.1　工艺条件取Al2O3100g干法装入30cm长色谱柱中,称取银杏干浸膏10g,用无水乙醇50ml加热溶…