多种纯化方法提取接触性DNA检材在法医学中的应用

目的观察分析多种纯化方法提取接触性DNA检材在法医学中的应用效果。方法将自2014年12月至2016年11月间我处留置的各类常见接触性DNA检材为研究对象(烟蒂、饮料瓶、手套),并采用三种方法(Chelex-100纯化法、M48磁珠法、硅珠法)进行提取检测,后对评价指标进行统计分析对比。结果 3种方法在烟蒂中的检出率基本接近,P0.05,无统计学意义。硅珠法在饮料瓶的检出率优于M48磁珠法和Chelex-100纯化法(后两种方法基本接近,P0.05),P0.05;在手套的检出率上硅珠法优于M48磁珠法,M48磁珠法优于Chelex-100纯化法,相互间P0.05;硅珠法对3种样本的OD比值分别为1.275、1.244、1.276优于其它两种方法,P0.05;均有统计学意义。结论硅珠法对接触性DNA检材具有较高的DNA检出率,且提取效果更佳,适合法医学中的DNA提取测定应用。     

接触性生物检材提取DNA方法的比较

目的 建立提取接触性生物检材DNA的新方法.方法 用PrepFiler ExpressTM法医DNA提取试剂盒提取各类接触性生物检材DNA并STR分型;将检验成功并可以重复的检材各取5份,用Chelex-100法、M48磁珠法和Chelex-100+纯化法3种方法提取接触性检材DNA,洗脱体积为50 μL,用Identifiler Plus复合扩增,并对检验结果分析比较.结果 对于接触性生物检材,采用PrepFiler ExpressTM法医DNA提取试剂盒STR分型的成功率最高,并将该方法加以实际应用.结论 PrepFiler ExpressTM法医DNA提取试剂盒是提取接触性生物检材DNA的一种新方法,可应用于法医实际案件检验.     

实验模型下两种全基因组扩增技术对指纹DNA检验的效能

目的对简并寡核苷酸引物PCR（Begenerate oligonucleotide-primed PCR,DOP-PCR）和扩增前引物延伸PCR（Primer extension pre-amplification PCR,PEP-PCR）用于指纹检材DNA检验的价值进行研究。方法建立2种指纹检材DNA模型,分别用普通PCR、DOP技术和PEP技术三种方法对指纹DNA样本进行STR分型,对三种方法的效能进行比较评价。结果实验模型1条件下,三种方法均不能获得满意分型结果;模型2条件下,DOP和PEP两种方法可以增加STR分型的成功率和信息量。结论 DOP和PEP技术必须结合高效的DNA提取技术才能最大程度发挥其检验效能。     

微量接触DNA的浓缩与回收

目的对纯化后的微量DNA进行进一步浓缩,提高DNA检验成功率。方法将30ml（约600pg）纯化后的微量DNA,分别采用Amicon离心超滤管和DNAClean＆ConcentratorTM-5试剂盒进行浓缩回收,用Identifiler试剂盒进行PCR扩增及分型检测,比较STR分型图谱的平均峰高、峰面积和等位基因丢失率。检验24枚白纸上的汗潜指纹,比较浓缩前后的检验效果。结果经过Amicon离心超滤管回收后,STR分型平均峰高85．3RFU,平均峰面积为1130．8,等位基因丢失率为66．13％。经过DNAClean ＆ ConcentratorTM-5试剂盒回收后,STR分型平均峰高147．5RFU,平均峰面积为1960．2,等位基因丢失率为35．14％。汗潜指纹的DNA检验通过DNAClean＆concentralor^TM-5试剂盒纯化浓缩,获得有效分型的数量由浓缩前的9枚提高为20枚。结论DNAClean＆C0ncentrator^TM-5试剂盒可以明显提高微量DNA检材的检验成功率,效果优于Amicon离心超滤管。对白纸上的指纹,DNAClean＆Concentrator^TM-5试剂盒浓缩后检验成功率升高。     

线粒体单核苷酸多态性复合扩增体系在疑难检材中的法医学应用研究

目的应用线粒体单核苷酸多态性(SNPs)的复合PCR扩增体系应用于法医检验案件中的陈旧血痕、脱落细胞检材、腐败降解检材及骨组织等疑难检材,为解决法医学检验疑难检材的难题提供一种新的方法。方法用IdentifilerTM试剂盒进行目前使用的STR分型及已建立的18个线粒体SNPs(16个位于编码区和2个控制区)位点复合扩增毛细管电泳荧光检测体系,并行对照检验案件中的陈旧血痕、脱落细胞、腐败肌肉、软骨以及牙齿、骨等各种疑难检材。结果对于上述检材,STR与线粒体SNPs的检验成功率均达到80%以上,线粒体SNPs高于STR。对于高度腐败的肌肉及软骨、骨骼检材,线粒体SNPs的检验成功率明显高于STR。结论所建立的线粒体SNPs复合PCR扩增体系在疑难检材检验中具有良好的应用前景。     

无毛囊发干遗传分析新标记的应用

 目的 解决法医检验工作中自然脱落的毛发、严重降解的骨骼及牙齿这类检材检验难度大且检出完整DNA分型的成功率低的问题。方法 应用一类特殊的DNA序列——逆转座子(retrotransponson,RE)进行检验鉴定,用作遗传分析的RE DNA片段长度多在60～125 bp,利用21个基因座组合的RE个体识别系统计算似然比(likelihood,LR),并计算亲缘关系鉴定中的累计非父排除率(combined paternity index,CPI)。 结果 本系统对无毛囊的发干、严重降解的生物检材有较高的检出成功率,LR值多在108～1012,完全能够达到同一认定的水平。计算CPI值后发现难以得出支持假设的结论,多个案例计算的CPI数值小于10 000。结论 21个基因座的RE系统可以用于个体识别鉴定,亲缘关系的鉴定仍需增加基因座。     

3种提取接触性检材脱落表皮细胞DNA方法的实验研究

目的对3种提取接触性检材脱落表皮细胞DNA的方法进行实验研究和比较,以获得最佳的方法.方法分别采用Chelex-100小体系法、磁珠法、改良磁珠法法对脱落表皮细胞的DNA进行提取,并对检测结果进行分析比较,探讨提取接触性检材脱落表皮细胞DNA的方法.结果磁珠法和改良磁珠法均能获得较高质量的细胞核DNA STR基因座分型,且后者的分型效果更好.Chelex-100小体系法的STR基因座分型效果不佳.结论磁珠法和改良磁珠法均能有效检测接触性检材脱落细胞DNA,故在法医检案中遇到接触性检材时考虑选择改良磁珠法.     

DNA微条形码技术在降解检材种属鉴定中的应用及法医学意义

【立题依据】 标准DNA条形码技术是基于COI基因序列分析而建立的一种物种鉴定方法,但由于目的基因扩增片段长达645bp,在法医物证降解检材中的应用受到限制。因此,本研究拟建立DNA微条形码技术,以解决法医物证特殊检材种属鉴定的难题。 【设计思路】 设计分别扩增不同近缘动物COI基因的通用引物,构建相应的复合扩增体系,并从种属特异性、林敏性、稳定性、案件适应性等方面进行验证。 【实验内容】 DNA提取及处理:有机溶剂法提取实验样本的基因组DNA;制备DNA<200bp的降解检材和两种动物DNA不同比例混合的混合检材。引物设计与合成:设计4对种属特异性引物和1对无种属特异性的ND3引物,并合成COI基因的标准引物。PCR扩增:①以10种动物基因组DNA为模板,分别用自行设计的4对引物进行扩增,以检验引物种属特异性;②以10种动物不同浓度基因组DNA为模板,分别用对应种属特异性的引物进行扩增,以检验引物扩增效能;③以降解检材基因组DNA为模板,分别用自行设计引物和标准引物进行扩增,以评估引物应用价值。PCR复合扩增:在确定自行设计引物特异性、扩增灵敏度的基础上,通过调整引物量和退火温度构建含有5对引物的复合扩增体系,并用于单一样本和混合样本基因组DNA的扩增。扩增产物检测:用聚丙烯凝胶电泳结合银染的方法检测各种动物模板DNA的扩增效果,以判定引物的扩增特异性和灵敏度,及降解检材和混合检材的扩增效果;用循环测序的方法获得各扩增产物的碱基序列,并通过BLAST软件与DNA数据库比对及遗传距离分析,判定检材的种属来源。 【实验材料】 常见家禽(鸡、鸭、鹅、鹌鹑、鸽子)和常见家畜(水牛、黄牛、山羊、绵羊、马、驴、犬)共7科18种动物及人类血液样本各5例。 【可行性】 (1)不同种属动物COI基因序列可从相应DNA数据库获得;(2)熟练掌握引物设计的操作方法和PCR技术;(3)具备本研究所需的各种仪器、设备和试剂。 【创新性】 为法医物证降解检材的种属鉴定提供一种有效的方法。     

STR 试剂盒在快速数据库建设中的应用

目的：评价 STRtyper-21G Plus 试剂盒在 DNA 数据库建设中的应用。方法针对各种纸质血样本特性，优化扩增体系和引物量、样本的取样量及循环次数，缩短 PCR 扩增时间，以建立适合批量样本直接快速扩增检验的方法，将其应用于2000份数据库样本的检验中，并与 PowerPlex?21试剂盒进行比较。结果采用10μL 扩增体系时，得到了 STRtyper-21G Plus 试剂盒批量样本检验的最适取样量和扩增循环次数，建立了快速扩增反应程序，2000份样本的直接快速扩增检验成功率为98．7％，批量检验92份样本（1个96孔板）从取样到电泳结束只需5 h；PowerPlex?21试剂盒分别为98．1％和6 h。结论STRtyper-21G Plus 试剂盒的应用，省去样本 DNA 提取过程，操作方法简单、快速，获得信息量大，适用于 DNA 数据库建设的需要。     

口腔粘膜脱落细胞DNA多态性分型检测在法医学应用的初步研究

目的研究各类口腔粘膜脱落细胞的微量生物性捡材中DNA提取和检验的方法,初步论证牙刷等载体作为法医物证检材的可能性。方法分别采用Chelex-100法、有机萃取法、联合抽提法三种方法提取口腔粘膜脱落细胞载体的样本DNA,进行CTTv四个STR位点单步复合扩增和两步级联扩增两种STR-PCR方式的扩增及各位点的等位基因检测。结果实验样本中,除了1例牙刷和2例牙签未能STR位点的正确分型外,其余各无关个体口腔粘膜脱落细胞载体均可以得到与标准血痕阳性相同的STR基因型。结论根据检材的PCR相对模板DNA量,选择适宜的DNA多态性检测分型方法,各类常见的含有口腔粘膜脱落细胞检材可以进行DNA检测分型,这类检材在法医检案中具有应用价值。     

基于高效液相色谱法的建昌帮四制香附指纹图谱相似度评价

目的:研究建昌帮四制香附炮制过程中炮制品HPLC图谱,并与生品香附、醋制香附的HPLC图谱进行相似度评价,从指纹图谱中各成分峰的变化探索四制香附的炮制特色及炮制工艺。方法:选用色谱柱为Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm,5μm);流动相:以甲醇-水二元梯度洗脱(0～10min:甲醇30%～70%,10～35min:甲醇70%～100%);检测波长:250nm;流速:1.0ml/min;进样量:20μl。采用"中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版"进行评价。结果:l2个香附样品指纹图谱与对照共有峰HPLC指纹图谱比较,中位数相关系数在0.806～0.979之间,均值相关系数在0.863～0.984之间。结论:香附不同炮制品指纹图谱相似度存在差异,综合比较分析含量、共有峰等因素可知建昌帮四制法为较优的炮制方法。     

不同载体上人体脱落细胞富集方法的比较

目的 对不同载体上人体脱落细胞的富集方法进行比较研究.方法 选取使用过的口罩、衣服、手套, 分别采取负压吸附、粘取、剪取和擦拭4种方法富集脱落细胞.用QIAGEN QIAamp DNA Investigator Kit提取DNA, 用AB Identifiler系统进行PCR扩增, 用AB 3130 XL自动遗传分析仪进行扩增产物的电泳分离, 用Genemapper ID v3.2软件进行STR分型.结果 口罩、手套类体积小的载体, 采取负压吸附、粘取、剪取、擦拭的方法, 均能得到完整的STR分型图谱;而对于大件的衣服载体, 采用负压吸附和直接剪取明显斑迹处可得到完整的STR分型图谱.结论 对于纺织类渗透性载体, 体积较大时可采用负压吸附法富集人体脱落细胞;对于有明显斑迹的, 可直接剪取可疑斑迹进行检测;体积较小的载体, 可采用脱落细胞富集器粘取, 富集尽可能多的人体脱落细胞.     

鸭乙型肝炎病毒核酸荧光定量PCR方法的建立及应用

目的：建立鸭乙型肝炎病毒核酸(DHBV DNA)荧光定量的方法。方法：根据DHBV DNAS基因区的序列设计扩增所需3条引物，通过偶联反应用AmpliSensor荧光信号标记半巢式引物，经过前期不对称扩增、半巢式扩增及在线检测建立DHBV DNA阳性标准品QPCR的标准曲线，并将70份鸭血清分别用荧光定量PCR方法和地高辛标记的DHBV DNA探针斑点杂交的方法检测，比较结果的相关性。结果：DHBV DNA阳性标准品经过30次循环后，扩增产物经2％琼脂糖凝胶电泳检测，可以看出有180bp、70bp两个片段，与设计的片段大小相符，扩增产物的浓度与标准品的起始浓度成正比，扩增指数的数值大小与该循环时己合成的扩增产物的量成正比，起始浓度的大小与要合成的一定扩增产物的量所需的循环次数成反比。用荧定量PCR方法和斑点杂交的方法检测血清中DHBV DNA的结果有良好的相关性(r＝0．97，P＜0.01，ν＝58)。结论：荧光定量PCR方法可作为检测DHBV DNA含量的一个重要手段。     

大黄高效液相色谱法指纹图谱分离条件的优化

目的　优化大黄高效液相色谱法指纹图谱 (HPL C- FPs)的分离条件。方法　以 RP- HPL C法 ,使用Shim- pack CL C- ODS柱 (6 .0 m m i.d.× 1 5 0 m m,5μm ) ,流动相为甲醇 - 1 m l/ L磷酸溶液 ,检测波长为 2 5 4 nm ,柱温为 4 0℃ ,考察大黄总提取物在不同梯度洗脱条件下的分离情况。结果　优选出的大黄 HPL C- FPs分离条件 ,可使大黄总提取物中各组分达到较佳分离 ,稳定性、精密度、重现性好。结论　该色谱分离条件可用于建立大黄药材HPL C- FPs的分离条件     

吸痰管导引经鼻气管插管在ICU中的应用

目的探讨吸痰管导引经鼻气管插管在ICU危重症患者中的应用价值。方法选择2009年5月-2011年5月淮北矿工总医院ICU收治的危重症呼吸衰竭患者78例,采用吸痰管导引经鼻气管插管建立人工气道行机械通气,观察插管成功率及插管并发症。结果本组患者70例一次插管成功,成功率90%,插管时间20～60 s,4例患者在气管插管钳帮助下插管成功,3例患者改经口气管插管,1例患者经口气管插管失败,改气管切开。3例患者出现鼻腔少量出血,很快自行停止,无喉痉挛、严重心律失常、支气管痉挛、大咯血、心跳骤停等并发症发生。结论采用吸痰管导引经鼻气管插管能快速、简便、安全地建立人工气道,有较高的插管成功率,并发症少,值得在临床推广应用。     

中药材指纹体系

建立反映中药材整体信息的指纹体系是现阶段全面、有效控制中药材质量的手段。中药材指纹体系是采用化学指纹图谱和基因指纹图谱来分别表述、控制中药材的多元化学组份和源于生物体的特性，从有效成分和遗传物质两方面实现对中药材质量的控制。基因指纹图谱可从遗传物质上进一步佐证中药区别于化学药品的特性。基因指纹与化学指纹相结合，对于中药的品种鉴定、质量评价、药用优良品种的选育都具有重要的意义。实施中药材指纹体系，首先要建立药典品种的含多种检测方法的化学指纹和基因指纹图谱库，其次要建立指纹图谱的计算机模式识别系统。     

HPLC法同时测定龙甘胃舒分散片中5种成分的含量

目的:建立同时测定龙甘胃舒分散片中5种成分含量的高效液相色谱法。方法:以Dikma Platisil ODS色谱柱(4.6mm×250mm,5μm)为固定相;采用甲醇(A)-0.1%磷酸(B)为流动相系统,按梯度(0~15 min,40%A;15~50min,40%A→90%A;50~60 min,90%A;60~70min,40%A),以1mL/min为流速洗脱;柱温30℃;检测波长283 nm。结果:甘草苷、甘草酸铵、橙皮苷、大黄素以及大黄酚浓度分别在8.328~208.2μg/mL、4.384~109.6μg/mL、17.136~428.4μg/mL、4.064~101.6μg/mL、3.398~84.96μg/mL范围内与峰面积均呈良好的线性关系(r=0.9999),平均加样回收率分别为98.93%、98.95%、102.57%、99.67%、103.43%,RSD分别为1.85%、1.27%、0.52%、0.89%、0.43%。结论:该方法简便、快速、准确、重复性好,可用于龙甘胃舒分散片的质量控制。     

肺上叶切除术后单根胸管持续负压引流的临床分析

目的探讨肺上叶切除术后单根胸管持续负压吸引引流对残腔闭合的影响。方法将2002年1月至2012年6月间在沧州市人民医院接受肺上叶切除的138例患者随机分成两组,试验组66例,采取单根胸管引流新型胸瓶持续负压吸引;对照组72例,采取上下双胸管引流普通胸瓶不接负压吸引,观察胸腔残腔闭合情况。结果试验组的术后平均残腔气液平面存留数少于对照组,且差异有统计学意义(χ2=4.87,P<0.05);试验组和对照组的术后胸腔平均引流总量分别为560mL和1000 mL,比较差异有统计学意义(χ2=7.75,P<0.01)。结论采用单根胸管引流新型胸瓶持续负压吸引的术后残腔闭合时间和引流量均优于上下双胸管引流普通胸瓶不接负压吸引的方式。     

腹腔镜下自体血液回输在妇科急腹症中的应用

目的:对采用腹腔镜下自制自体血回收装置进行自体血回输治疗情况总结分析。方法:2007年7月-2010年10月急诊腹腔镜下手术治疗的腹腔内出血患者86例。术中,将一条输血器的一头固定在手术台上,与腹腔镜吸引器头连接,另一头插入无菌空生理盐水瓶盖内,输液管一端插入预先加有100∶1枸橼酸钠的空盐水瓶内,另一端连接吸引器装置。将回收瓶内血液直接通过输血器滤过输给患者。观察患者腹腔出血与回输量、术前、后第1天的血常规、肝肾功能等指标。结果:86例患者的腹腔内平均失血量为(1 748.34±910.21)ml,术中直接回输自体血350~2 000ml,平均为(944±721)ml。与术前比较,患者术后第1天RBC、Hb、红细胞压积(HCT)、TP均有一定程度的升高,而WBC下降,差异均有统计学意义。所有患者均未见不良反应。结论:在腹腔镜操作和具备自制自体血回输装置前提下,对伴有腹腔内出血的常见妇科急症既可快速寻找到病灶止血,并可最大限度自体血回输,安全可靠值得推广。     

辅助性治疗手套对手外伤功能障碍患者日常生活活动能力的影响

目的:观察自制辅助性治疗手套对外伤后手功能障碍患者日常生活活动能力的影响?方法:40例患者被随机分成治疗组与对照组?两组患者均接受每周5天,每天1次康复治疗,治疗组患者每次另增加配戴辅助性治疗手套15 min?分别于治疗开始前和治疗结束后的次日,选用简易上肢机能检查箱(STEF)中的搬运70 mm大球?木方项目?Milliken手康复中心日常生活活动(ADL)评定表中的10项活动?以及在孔板上插直径为2 mm的细金属棒活动,重点对患者的患侧手功能和日常生活活动能力进行评定?结果:经治疗,两组患者各项评定指标均得到改善?除开饮料瓶项外,治疗组的其他项评定指标的改善均明显优于对照组,比较结果呈现显著性差异(P < 0.05)?结论:自制辅助性治疗手套可以改善手外伤功能障碍患者的ADL能力?