共刺激分子CD28单克隆抗体制备的新策略

目的发展一种制备抗人ＣＤ２８单克隆抗体的新方法。方法构建编码人ＣＤ２８基因的逆转录病毒表达系统,感染 ＢＡＬＢ／ｃ小鼠骨髓瘤细胞ＮＳ－ｌ,使其细胞膜表达ＣＤ２８抗原并用于免疫小鼠,制备单克隆抗体。结果获得分泌抗人 ＣＤ２８单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为Ｅ６６－３Ｓ,ＩｇＧ亚类鉴定为ＩｇＧ１。该株单抗能够特异性识别ＣＤ２８阳性的Ｔ细 胞,并完全阻断标准ＣＤ２８抗体与细胞表面ＣＤ２８抗原结合。在亚剂量分裂原的共刺激下,具有促进Ｔ淋巴细胞活化和 增殖作用。结论Ｅ６６－３Ｓ具有高度特异性和共刺激活性,为临床免疫治疗奠定了基础,同时,也为进一步制备其它膜抗 原的单克隆抗体提供了一种新途径．     

抗蛋白S单克隆抗体的制备

目的 制备抗蛋白S(protein S)单克隆抗体.方法 用微量蛋白S抗原对Balb/c小鼠脾内包埋免疫,取小鼠脾细胞与SP2/O细胞融合,融合后对杂交瘤细胞进行筛选克隆化培养,建立了10株稳定分泌抗蛋白s单克隆抗体的杂交瘤细胞株.结景对其中的一株2E3进行研究,其分泌的抗体为IgG1亚类.腹水效价1:106阳性,采用饱和硫酸铵盐析法纯化腹水,Western blot测定显示单克隆抗体2E3可特异性地识别分子量为69,000的抗原分子.此杂交瘤细胞株体外传代培养6个月以上,ELISA检测抗体滴度无明显降低.结论脾内包埋法成功制备抗蛋白S单克隆抗体,使蛋白S的临床深入研究和应用成为可能.     

抗CD28分子单克隆抗体的制备及其免疫学特性

目的制备抗人CD28单克隆抗体,对其免疫学特性进行分析。方法利用多肽技术合成的CD28抗原免疫BALb/c小鼠,应用细胞杂交技术,获得抗CD28的单克隆抗体,并对其免疫学特性进行了分析。结果经过融合、亚克隆成功获得了9株抗人CD28的杂交瘤细胞株,均为IgG,4株为IgG2a,5株为IgG2b。利用竞争抑制实验分别对其中的5株进行了抗原位点测定,5株分别针对三个不同的抗原位点。结论此单抗细胞株的建立,对于深入研究CD28单抗对T淋巴细胞的作用机理有重要意义。     

T细胞亚群及共刺激分子表达与系统性红斑狼疮免疫病理的关系

目的：探讨T细胞亚群及共刺激分子表达与系统性红斑狼疮免疫病理的关系。方法；采用免疫荧光标记技术和流式细胞仪检测技术对系统性红斑狼疮（SLE）患者和正常人外周血T细胞亚群及外周血单个核细胞膜表面共刺激分子的表达进行分析。结果：（1）与正常人相比，SLE患者CD3^ ,CD4^ T细胞亚群显著减少，CD4／CD8比例失调，双标记CDr^ CD28^ ,CD8^ CD28^ T细胞亦显著减少；（2）患者共刺激分子CD28表达显著降低，4－1BB分子表达显著增高；（3）患者T细胞CD4／CD8与抗核抗体呈负相关，共刺激分子4－1BB与抗核抗体，尿蛋白呈正相关，而与CD4^ CD28^ T细胞亚群呈负相关。结论：T细胞亚群及共刺激分子表达异常在系统性斑狼疮发病机制中可能具有重要作用。     

抗SARS冠状病毒S1蛋白N端249至667的单克隆抗体的制备与鉴定

目的在获得了具有免疫原性的SARS冠状病毒S1蛋白片段的基础上,制备和鉴定特异性抗该段S1蛋白单克隆抗体(mAb)。方法原核表达含S蛋白受体结合区的SARS冠状病毒S1蛋白片段S1c(N端249-667氨基酸残基),其免疫原性经SARS病人恢复期血清鉴定后免疫BALB/c小鼠,按常规方法制备单克隆抗体,并采用ELISA间接法、免疫荧光和免疫印迹进行筛选和鉴定。结果筛选出3株特异性针对SARS冠状病毒S1蛋白N端249-667的mAb杂交瘤细胞株,IgG亚类鉴定1株为IgG1,2株为IgG2a,经免疫荧光鉴定与人冠状病毒株229E和OC43无交叉反应。结论获得3株抗SARS冠状病毒S蛋白受体结合区特异性单克隆抗体,为建立新的SARS冠状病毒检测方法的和进一步研究S蛋白的功能奠定了基础。     

鼠抗人TCR/CD3单克隆抗体的制备及其初步应用

目的应用B淋巴细胞杂交瘤技术,制备鼠抗人CD3单克隆抗体,并用于T淋巴细胞亚类检测。方法以本室纯化的CD3蛋白免疫Balb/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,成功地获得1株抗人CD3单克隆抗体。经间接ELISA测定,杂交瘤细胞培养腹水的抗体效价。结合SDS-PAGE实验考察单克隆抗体对CD3促T淋巴细胞增殖活性的作用。结果杂交瘤细胞培养腹水的抗体含量为20 mg/mL,效价为10-7,并对T淋巴细胞有促增殖活性,检测正常人外周血阳性T细胞百分率为（73±7）%。结论制备的抗人CD3单克隆抗体具备较高的纯度和活性,可用于T细胞亚类的检测。     

抗SARS冠状病毒S1蛋白N端249至667的单克隆抗体的制备与鉴定

目的 在获得了具有免疫原性的SARS冠状病毒S1蛋白片段的基础上，制备和鉴定特异性抗该段S1蛋白单克隆抗体(mAb)。方法 原核表达含S蛋白受体结合区的SARS冠状病毒S1蛋白片段Slc(N端249-667氨基酸残基)，其免疫原性经SARS病人恢复期血清鉴定后免疫BALB／c小鼠，按常规方法制备单克隆抗体，并采用ELISA间接法、免疫荧光和免疫印迹进行筛选和鉴定。结果 筛选出3株特异性针对SARS冠状病毒S1蛋白N端249-667的mAb杂交瘤细胞株，IgG亚类鉴定1株为IgG1，2株为IgG2a，经免疫荧光鉴定与人冠状病毒株229E和OC43无交叉反应。结论 获得3株抗SARS冠状病毒S蛋白受体结合区特异性单克隆抗体。为建立新的SARS冠状病毒检测方法的和进一步研究S蛋白的功能奠定了基础。     

人CTLA4单克隆抗体的制备和鉴定

目的 :制备人的细胞毒性T淋巴细胞相关抗原 4 (CTLA4 )的单克隆抗体。　方法 :利用蛋白纯化技术获得人CTLA4Ig蛋白免疫Balb/c小鼠。取免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞NS1融合 ,用ELISA法筛选分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株 ,并用Western印迹和流式细胞检测仪鉴定所制备的单克隆抗体。　结果 :获得一个稳定的分泌抗人CTLA4的杂交瘤细胞株。该细胞克隆培养上清中所含的单抗能和经过PHA刺激后的人T细胞结合 ,但不能和经过PHA刺激后的小鼠T细胞结合。　结论 :利用重组人CTLA4Ig制备获得高特异性的抗人CTLA4单克隆抗体。     

肺炎支原体种特异性单克隆抗体杂交瘤制备及鉴定

目的　制备抗肺炎支原体种特异性单克隆抗体。方法　以纯化的肺炎支原体膜蛋白抗原 (相对分子质量为43× 10 3)加福氏免疫佐剂免疫 8周龄雌性BALB c小鼠 ,取小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2 0 Ag14融合 ,以酶标记免疫吸附测定法 (ELISA)筛选和鉴定所制备的单克隆抗体。结果　共筛出 3株分泌抗肺炎支原体种特异单克隆抗体杂交瘤 ,经免疫鉴定其分泌的免疫球蛋白类型为IgG1、IgG2a及IgM ,与肺炎支原体有很强的亲和力 ,与种属相近的其它 6株支原体没有交叉反应。结论　本次筛选制备的单克隆抗体杂交瘤能分泌高浓度的肺炎支原体单克隆抗体 ,并且有很强的种特异性。     

基因重组人睫状神经营养因子单克隆抗体的制备及初步鉴定

目的　制备基因重组人睫状神经营养因子 (rhCNTF)单克隆抗体。方法利用rhCNTF免疫BALB/C小鼠 ,取其脾细胞与小鼠NS -1骨髓瘤细胞融合 ,制备 3株抗rhCNTF的单克隆抗体 ,分别命名为CA2 、CA6 和BB11。结果 3株抗体类型均为IgG2a,免疫印迹试验证明为特异性抗CNTF的单克隆抗体 ;抗体相加试验表明 3株单抗是针对CNTF两个不同的抗原决定簇。     

CD28、CD40通路共刺激对淋巴细胞增殖反应的影响及CsA的抑制作用

目的：探讨CD28、CD40通路共刺激后淋巴细胞增殖反应的变化及免疫抑制剂环孢素A(CsA)、抗CTLA4单克隆抗体对共刺激通路激活后淋巴细胞增殖反应的影响。方法：采用单克隆抗体与淋巴细胞表面CD3、CD28及CD40L分子结合产生相应刺激信号,根据刺激条件不同设组为：①抗CD3单抗单刺激(A组)(剂量为10μg／L、100μg／L、1000μg,／L);②抗CD3单抗 抗CD28单抗(B组);③抗CD3单抗 抗CD40L单抗(C组);④抗CD3单抗 抗CTLA4单抗(D组)共刺激(A、B、C、D组中抗CD3单抗剂量固定为100μg／L,其余3种单抗各设10μg／L、100μg／L、1000μg／L3种剂量);⑤抗CD3单抗 抗CD28单抗 抗CD40L单抗(E组);⑥抗CD3单抗 抗CD28单抗 抗CTLA4单抗(F组)共刺激(E、F组中抗CD3单抗和抗CD28单抗的剂量固定为100μg／L,抗CD40L单抗和抗CTLA4单抗的剂量各设10μg／L、100μg／L、1000μg／L);⑦CsA干预组：抗CD3单抗 CsA(G组);⑧抗CD3单抗 抗CD28单抗 CsA(H组);⑨抗CD3单抗 抗CD28单抗 抗CD40L单抗 CsA(I组),G、H、I组中所有单抗浓度均固定为100μg／L,CsA浓度设为10μg／L、100μg／L、1000μg／L。采用[^3H]-TdR同位素掺人法测定淋巴细胞增殖水平,液体闪烁计数仪测定放射性计数值。结果：用抗CD3单抗 抗CD28单抗共刺激后,淋巴细胞增殖反应明显高于抗CD3单刺激,而在抗CD3单抗 抗CD40L单抗刺激组,淋巴细胞增殖反应低于抗CD3单刺激组。抗CTLA4单抗所提供的刺激信号可抑制抗CD3单刺激及抗CD3 抗CD28共刺激导致的淋巴细胞增殖反应,并且随着抗CTLA4单抗剂量的增加,抑制作用增强。CsA对共刺激后的淋巴细胞增殖反应有抑制作用,且随着剂量增大其抑制作用也增强,但对单刺激后增殖反应的抑制作用更为明显。结论：CD28共刺激通路在淋巴细胞活化中起着关键作用。抗CD40L单抗的刺激作用可能被其对T细胞与抗原递呈细胞(APC,包括B细胞等)间的阻断效应所掩盖。抗CTLA4单抗及CsA对共刺激后淋巴细胞的增殖反应均有抑制作用。     

基因重组人睫状神经营养因子单克隆抗体的缺备及初步鉴定

目的 制备基因重组人睫状神经营养因子（rhCNTGF)单克隆抗体，方法 利用rhCNTF免疫BALB/C小鼠，取其脾细胞与小鼠NS-1骨髓细胞融合，制备3株抗rhCNTF的单克隆抗体，分别命名为CA2、CA6和BB11。结果 三株抗体类型均为IgG2a，免疫印迹试验证明为特异性抗CNTF的单克隆抗体；抗体相加试验表明三株单抗是针对CＮＴＦ两个不同的抗原决定簇。     

鼠-人嵌合抗粘蛋白1 IgG1全抗体的构建及其功能初步分析

目的获得鼠-人嵌合抗粘蛋白1(mucin1,MUC1)IgG全抗体,降低鼠源抗MUC1单克隆抗体(monoclonalantibody,mAb)的异种免疫原性,并在哺乳动物细胞中表达制备,初步分析其特性。方法 PCR扩增鼠mAb-6E3可变区编码基因,通过特异性限制性酶切位点克隆入含有人源IgG1抗体恒定区的哺乳动物细胞重组表达载体,获得IgG全抗体表达质粒,瞬时转染293T哺乳动物细胞,直接免疫荧光法确定细胞内人源IgG抗体表达,收获转染细胞培养上清,经亲和层析纯化后,经SDS-PAGE蛋白电泳、Western blot、流式细胞仪检测和表面等离子共振技术等分析所制备IgG抗体分子特点及其与MUC1抗原的结合活性及动力学参数。结果所构建鼠-人嵌合IgG表达质粒能够在哺乳动物细胞中有效表达并分泌到细胞上清,纯化后蛋白质电泳分析与预期IgG抗体分子大小一致,能够与变性或天然状态下的T47D肿瘤细胞表面MUC1特异性结合,经表面等离子共振技术分析表明抗体的亲和力约为KD=2.8×10-7M。结论获得鼠-人嵌合抗MUC1 IgG抗体,具有与MUC1特异性结合的生物学活性。     

抗AIB1-N单克隆抗体的制备及鉴定

目的获得有生物活性的抗乳腺癌扩增性抗原1氮端（amplified in brest cancer 1-Nterminal,AIB1-N）单克隆抗体。方法以谷胱甘肽转硫酶耦联的抗乳腺癌扩增性抗原1氮端蛋白（GST-AIB1-N）为免疫原,免疫BALB／c小鼠,采用杂交瘤技术制备抗AIBl一N单克隆抗体,用间接ELISA和Western-blot鉴定其亚类和抗原结合特异性。结果成功筛选出一株稳定分泌抗AIB2—N单克隆抗体的杂交瘤细胞株,其分泌抗体亚类为IgG1,经Western-blot鉴定该McAb特异性高,亲和力强。结论成功制备了抗AIB1-N单克隆抗体,为深入研究AIB1的表达及临床应用提供了有力的工具。     

重组创伤弧菌溶细胞素单克隆抗体的制备

目的：制备重组创伤弧菌溶细胞素（recombinant Vibrio vulnificus cytolysin,rVVC）鼠源性单克隆抗体,并对其特异性及免疫球蛋白类型进行鉴定,为创伤弧菌溶细胞素（Vibrio vulnificus cytolysin,VVC）致病机制的后续研究及创伤弧菌引起的食品污染中溶细胞毒素快速检测试剂盒的研发奠定基础。方法：IPTG诱导含pET28a（＋）-vvhA的大肠杆菌表达rVVC,将rVVC纯化、复性后经甲醛脱毒作为抗原免疫BALB/c小鼠。SDS-PAGE检测蛋白纯化后效果。采用杂交瘤技术和ELISA法制备并筛选分泌rVVC单克隆抗体的杂交瘤细胞株,有限稀释法对阳性孔克隆化培养。采用免疫双扩法鉴定单克隆抗体类型,ELISA法、免疫双扩法鉴定单克隆抗体的特异性。结果：将纯化复性后的rVVC作为抗原免疫小鼠后,经ELISA检测,血清有效稀释度达1：12800。共获得2株可持续分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别为B2C7和E3F4株,其抗体类型均为IgG1,且具有较高特异性,与多种其他细菌蛋白不发生免疫反应。结论：本研究成功免疫BALB/c小鼠,获得B2C7和E3F4两株可持续稳定分泌rVVC鼠源性单克隆抗体的杂交瘤细胞株,抗体类型为IgG1型。     

特异性SARS-CoV N蛋白单克隆抗体的制备及抗原表位初步分析

目的：用分段表达纯化的SARS冠状病毒（SARS-CoV）的核衣壳蛋白（nucleocapsid N蛋白）制备针对该蛋白不同区域抗原表位的高特异性单克隆抗体（McAb）,初步定位单克隆抗体识别表位所在区域。方法：用分段表达纯化的SARS～CoV的N蛋白（分别记为N1蛋白、N2蛋白）分别免疫Balb／c小鼠制备McAb,通过检测其亚类、效价及相对亲和力鉴定McAb的生物学特性,以Western blot鉴定单克隆抗体特异性,并对McAb结合表位进行初步分析。结果：筛选出7株抗SARS-CoV N1蛋白及2株抗SARS-CovN2蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株,IgG亚类鉴定6株为IgG1,2株为IgG2b,1株为IgG3,腹水效价10^5以上;亲和常数达10^8以上。Western blot证实所获的单克隆抗体可与SARS-CoVN蛋白发生特异性反应。ELISA相加实验结果显示2株N1 McAb识别相同的抗原表位,其余均识别不同的抗原表位。结论：通过分段表达纯化的SARS-CoVN蛋白而制备的特异性针对SARS-CoV N蛋白不同区域抗原表位的单克隆抗体中,N1单抗识别N蛋白N端（1-549bp）,N2单抗识别N蛋白C端（496～1269bp）,可初步定位单克隆抗体识别表位所在区域。     

CD69在人外周血活化的γδT细胞表面的表达

目的:观察CD69在人外周血γδT细胞表面的表达及与γδT细胞活化的关系.方法:抗CD3单克隆抗体及结核杆菌低分子多肽刺激人外周血单个核细胞(PBMC)及纯化的T细胞,流式细胞仪检测不同时相γδT细胞表面CD69分子的表达率.结果:抗CD3单抗、Mtb抗原刺激PBMC后3h,γδT细胞表面即表达CD69,24h达高峰;单独抗CD3或Mtb抗原刺激纯化的T细胞,CD69分子表达升高不明显,加入激发型抗CD28单抗作为第二信号,CD69表达率明显升高.结论:CD69分子在活化的γδT细胞表面高表达,可作为γδT细胞完全活化的一个指标.     

多肽-主要组织相容性复合体技术及其在肿瘤和传染病研究中的诊断性应用

CD8+T细胞具有细胞杀伤功能,是体内抗肿瘤和抗病毒的主力军.抗T细胞亚群单克隆抗体常常被用于检测T细胞亚群在肿瘤和病毒性疾病发生、发展过程中的变化以及治疗前后的变化,这对于肿瘤和病毒性疾病的免疫学基础研究以及临床应用研究的深入起到了很大的推动作用[1].但是抗T细胞亚群单克隆抗体区分不出这些CD8+T细胞的抗原特异性,而识别抗原特异性CD8+T细胞对于认识肿瘤和传染病免疫反应的本质十分重要.自从T 细胞被发现以来,人们一直在尝试能够识别出T细胞的抗原特异性.有限稀释法(limiting dilution analysis, LDA)曾经被用于检测抗原特异性T细胞[2,3]. 但该技术为间接功能测定法,不仅敏感性低而且繁琐费时.近年来,一种全新的能够直接定量检测不同抗原特异性T细胞的方法被发明使用.这种方法为多肽-主要组织相容性复合体(peptide-major histocompatibility complex,MHC)技术.     

基因重组人粒细胞集落细胞刺激因子单克隆抗体的制备及特性

采用高效免疫方法，利用rhG－CSF免疫BALB／C小鼠，经过两次融合制备了3株抗rhG－CSF的单克隆抗体，分别命名为1H11、2B3、2C3；抗体类型均为IgG2a。免疫印迹试验证明为特异性抗G－CSF的单克隆抗体；单抗相加试验和单抗竞争试验表明3株单抗针对G－CSF两具不同的抗原决定簇；中和试验表明2B、2C3识别的位点与G－CSF刺激NFS－60细胞增殖活性有关。     

宫颈癌组织中HLA-Ⅰ缺失与HPV16、18感染的相关性研究(英文)

目的　探讨宫颈癌与人类组织相容性抗原 (HLA)表达缺失和人乳头瘤病毒 (HPV) 16、18感染的关系。方法　采用免疫组织化学S -P法检测特异性鼠抗人HLAⅠ类分子单克隆抗体及HPV16、18E6蛋白在宫颈癌组织中表达情况。结果　 6 2例宫颈癌组织中有 4 2例HLAⅠ抗原呈阳性表达 ,2 0例呈阴性表达 ,阴性表达率 32 .3%。有 4 4例HPV16、18E6呈阳性表达 ,阳性率 70 .9% (4 4 / 6 2 )。在HPV16、18E6阳性表达组织中其HLAⅠ抗原缺失明显增加。HLAⅠ抗原阳性表达组织中CD3 T细胞和CD8 T细胞数量明显多于HLAⅠ抗原阴性表达组织 ,肿瘤恶性程度及淋巴结转移与HLAⅠ抗原下调有关。结论　宫颈癌组织存在HLAⅠ抗原部分缺失与HPV16、18感染密切相关。HLAⅠ抗原部分缺失 ,形成了免疫逃逸导致了肿瘤细胞的发生、发展、浸润、转移。