不同类型标本的衰老相关-β-半乳糖苷酶染色方法

目的：研究衰老相关-β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)组化染色在不同类型组织切片中的应用。方法：比较血涂片、冰冻切片及石蜡切片在不同条件下SA-β-Gal的显色效果。结果与结论：冰冻切片结果良好;石蜡切片经抗原修复后,结果不及未经抗原修复者;血涂片以g／L多聚甲醛固定min者效果最佳。SA-β-Gal可用于不同类型的组织标本。     

青光眼患者小梁网细胞线粒体的电镜观察

目的:原发性开角型青光眼(POAG)是一种发病隐匿的不可逆性致盲性眼病,发病机制有待进一步探讨。本研究通过电镜检测方法从小梁细胞线粒体形态改变及细胞连接的异常认识小梁细胞退行性改变,探讨POAG的发病机理。方法:原代培养POAG小梁网(GTM)与正常人的小梁网(NTM)细胞,电镜下对比观察小梁细胞线粒体和细胞连接的形态结构。结果:透射电镜可见培养的NTM细胞胞质内线粒体数量较多,结构完整,嵴的数目和形态正常,细胞连接以缝隙连接为主,结构完整,并可见丰富的粗面内质网,偶可见高尔基体等细胞器;GTM细胞线粒体数目少,形状多为空泡状,嵴多不可见,难以找到完整的细胞连接结构,其它细胞器明显减少。结论:(1)POAG患者小梁细胞的线粒体发生了病理学形态的退行性改变;(2)POAG患者小梁细胞的细胞连接连接出现了病理学形态的异常。提出POAG患者小梁细胞线粒体的形态与功能异常以及小梁细胞的细胞连接异常可能导致小梁网功能异常,推测其与眼压升高及POAG发病密切相关。     

糖基化终末产物诱导心肌细胞老化的机制

目的:研究糖基化终末产物(advanced glycation end products,AGEs)诱导心肌细胞老化的机制?方法:AEGs?抗AGE受体(RAGE)抗体干预乳鼠心肌细胞48 h?通过Western blot和β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)染色分别检测老化相关蛋白p53?p16的表达及SA-β-Gal活性;采用JC-1?DCFH-DA分别测定线粒体膜电位?细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS);通过Western blot检测自噬相关蛋白LC3?Beclin1?结果:AGEs干预细胞48 h后与对照组相比,AGEs组SA-β-Gal活性明显增高,p53?p16的表达量明显增加(P < 0.01),同时伴随线粒体膜电位的降低(P < 0.01)及细胞内ROS水平增加(P < 0.01),LC3与Beclin1表达量明显增加(P均 < 0.01);给予抗RAGE抗体干预后与AGEs组相比,SA-β-Gal活性降低,p53?p16的表达量明显降低(P < 0.01),线粒体膜电位增高(P < 0.01),细胞内ROS减少(P < 0.01),LC3与Beclin1表达量降低(P < 0.05和P < 0.01)?结论:AGEs与其受体RAGE作用可能通过氧化应激及线粒体损伤与自噬诱导心肌细胞老化?     

三丁基过氧化氢通过调控细胞周期诱导Sca-1+造血干/祖细胞衰老

目的 探讨三丁基过氧化氢(t-BHP)诱导Sca-1+造血干/祖细胞(HSC/HPC)衰老的细胞周期调控机制。方法免疫磁性分选法分离纯化小鼠Sca-1+ HSC/HPC后分为对照组（常规培养细胞）,衰老模型组（用t-BHP复制细胞体外衰老模型）。通过衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)染色、细胞周期测定和造血祖细...     

纤维型肌动蛋白对间充质干细胞衰老的调节作用及其机制

目的：探讨纤维型肌动蛋白（F-actin）调节人骨髓来源间充质干细胞（hBMSCs）衰老的作用,初步阐明hBMSCs衰老的分子生物学机制。方法：将分离得到的hBMSCs进行体外培养并分为对照组（P2代hBMSCs）、F-actin抑制剂组（2.5 μmol·L^-1 F-actin抑制剂Latrunculin B处理P2代hBMSCs 1 h）和P11代hBMSCs组（P2代hBMSCs连续传代得到P11代hBMSCs）。成骨、成脂和成软骨诱导液诱导各组hBMSCs,采用茜素红染色、SO染色和油红O染色确定诱导效果。免疫荧光染色观察各组hBMSCs中Ki67阳性细胞数、F-actin的形态和聚合情况、YAP在细胞内的亚细胞定位。SA-β-Gal染色检测各组hBMSCs中SA-β-Gal染色阳性细胞数。结果：茜素红染色、SO染色和油红O染色,hBMSCs具有成骨、成脂和成软骨分化的能力。免疫荧光染色和SA-β-Gal染色,对照组hBMSCs中的微丝纤维束较多较粗,F-actin长度较长,YAP主要集中在细胞核（YAP在细胞核内为活化态）;与对照组比较,P11代hBMSCs组中Ki67阳性细胞数较少,SA-β-Gal阳性细胞较多,F-actin更短更细,YAP主要集中在胞浆,且YAP出核的细胞SA-β-Gal染色呈阳性;F-actin抑制剂组hBMSCs中YAP出核失活,SA-β-Gal染色阳性的hBMSCs衰老细胞更多。结论：抑制YAP入核可以促进hBMSCs衰老,F-actin可以通过调节YAP活性影响hBMSCs衰老。     

白藜芦醇通过保护线粒体功能延缓骨髓间充质干细胞衰老

目的: 探讨白藜芦醇对骨髓间充质干细胞（MSC）衰老的影响及其机制。方法: 分离SD乳鼠（7日龄）MSC,传代培养至第3代后检测0、1、10、50 g/L D-半乳糖对MSC衰老的影响,确定D-半乳糖诱导MSC衰老的最佳浓度。再将细胞随机分为10、50、100 μmol/L白藜芦醇组及对照组。衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）染色观察各组细胞衰老变化;DCFH-DA染色检测总活性氧水平;MitoSOX Red染色检测线粒体活性氧水平;线粒体膜电位检测试剂盒（JC-1法）检测线粒体膜电位变化;纯化线粒体膜通道孔（mPTP）比色法检测线粒体膜通道开放水平;蛋白质印迹法检测衰老相关蛋白p53、p16、γ-H2AX表达和细胞质内线粒体细胞色素C外泄水平。结果: 10、50 g/L D-半乳糖可明显增加SA-β-gal染色阳性MSC数量和线粒体活性氧水平（均P < 0.01）。与对照组比较,白藜芦醇组SA-β-gal染色阳性细胞数减少（均P < 0.01）,p53、p16和γ-H2AX表达减少,细胞内总活性氧和线粒体活性氧水平下降（均P < 0.01）,线粒体膜电位下降（P < 0.05或P < 0.01）,膜通道开放水平降低（P < 0.05或P < 0.01）,细胞质内细胞色素C外泄减少。结论: 白藜芦醇可保护MSC线粒体功能,延缓MSC衰老。     

鱼藤酮诱导青光眼患者小梁网氧化损伤的研究

目的:原发性开角型青光眼(POAG)是一种发病隐匿的不可逆性致盲性眼病,发病机制有待进一步探讨。本研究通过激光共聚焦显微镜及流式细胞方法检测鱼藤酮对青光眼患者小梁细胞氧化损伤的影响,探讨POAG的发病机理。方法:原代培养POAG患者及正常人小梁网细胞,采用激光共聚焦显微镜、流式细胞技术观察不同浓度鱼藤酮对小梁网细胞内ROS水平的影响。结果:原代POAG患者小梁网细胞内ROS水平明显高于正常人,差异有统计学意义(P<0.05)。ROT对GTM小梁网细胞ROS的诱导作用呈时间-浓度依赖性,而正常人原代小梁网细胞NTM经过ROT处理后,结果显示ROT浓度高于5μmol/L时对正常人小梁网细胞内ROS产生有显著诱导作用(P<0.01);而≤5μmol/L时,ROT对NTM细胞内ROS的产生并没有明显诱导作用。在不同浓度下,ROT对原代POAG患者和正常人小梁网细胞ROS的诱导作用相比,均有显著性差异(P<0.01)。结论:鱼藤酮诱导小梁网氧化损伤增强,提示线粒体复合物活性下降可能会引起青光眼患者小梁网功能障碍,推测其与眼压升高及POAG发病密切相关。     

垂体后叶素致急性心肌缺血小鼠心肌超微结构变化

【目的】研究垂体后叶素对小鼠心肌组织形态及超微结构的影响。【方法】小鼠腹腔注射20U／kg垂体后叶素30min，建立心肌缺血模型，监测心电图变化，通过HE染色法观察心肌病理改变，Nagar-Olsen特殊染色观察心肌缺血损伤程度，透射电镜技术观察心肌细胞超微结构的变化。【结果】光镜下心肌组织HE染色切片未见明显的形态学改变；Nagar-Olsen特殊染色可见大片区域红染；透射电镜下可见肌纤维排列紊乱、线粒体膜和嵴融合、间质水肿等超微结构改变。【结论】小鼠腹腔注射20U／kg垂体后叶素30min，可导致心肌早期缺血损伤。     

当归多糖对造血干细胞SIRT1、p53和p21表达的影响

目的 研究当归多糖（ASP）基于辐射所致小鼠衰老造血干细胞（HSCs） SIRT1、p53和p21蛋白表达的影响,探讨ASP基于调控HSCs衰老的可能机制。方法72只SPF级C57BL/6J小鼠随机纳入对照组、模型组和ASP组。模型组通过X线3.0G y/8F全身照射建立小鼠HSCs衰老模型;ASP组在照射期间给予ASP灌胃;对照组与模型组予生理盐水。经免疫磁珠法分选小鼠HSCs,采用流式细胞术检测细胞周期,通过β-半乳糖苷酶（SA-β-Gal）染色观察衰老细胞;经混合集落培养（CFU-Mix）观察HSCs自我更新及定向分化潜能;Western blot检测SIRT1、p53、p21蛋白表达。结果与对照组比较,X线照射可能显著增加模型组HSCs G1期细胞比例、SA-β-Gal染色阳性细胞率、p53及p21蛋白表达（P<0.05）,降低SIRT1表达和CFU-Mix形成能力（P<0.05）。与模型组比较,ASP会抑制衰老HSCs G1期细胞比例、SA-β-Gal染色阳性细胞率、p53及p21蛋白表达增加（P<0.05）,同时SIRT1表达增加、CFU-Mix能力增强（P<0.05）。结论ASP可能上调SIRT1表达、下调p53及p21表达,从而可能延缓小鼠HSCs衰老。     

成纤维细胞体外培养过程中β-半乳糖苷酶的变化

目的 观察正常人成纤维细胞老化过程中β-半乳糖苷酶的变化规律。方法 取正常人二倍体成纤维细胞进行传代培养，以不同代次的细胞为实验对象，通过细胞生长曲线、群体倍增时间和β-半乳糖苷酶染色等一系列检测方法，对成纤维细胞老化过程进行了观察。结果 随着成纤维细胞的连续传代培养，SA-β-Gal表达呈现从弱(在年轻细胞中占4％)到强(在老化细胞中占60％)的趋势、结论 为建立成纤维细胞衰老模型提供了实验依据。     

蓝-黄视野结合视觉电生理检查在原发性开角型青光眼早期诊断中的意义

目的 探讨蓝—黄视野结合视觉电生理检查对原发性开角型青光眼早期诊断的临床应用价值,为临床青光眼早期诊断提供较为客观敏感的检测方法.方法 选择53例53眼标准自动视野检查正常的可疑开角型青光眼患者及30例60眼正常人进行蓝—黄视野检查结合图形视网膜电图及多焦视网膜电图,并对其结果进行对比研究.结果 在可疑青光眼患者中,B/Y视野检查31眼视野出现异常,与正常人比较差异有显著性.P-ERG检查眼的N95波潜伏期延长有明显差异,mf-ERG检查眼的N1P1N2波潜伏期有明显差异.结论 对于原发性青光眼早期发生,在眼底及普通视野未出现明显异常的患者,B/Y视野检查联合P-ERG,mf-ERG检查无疑是一种敏感性较高的检查手段.     

国人前房角小梁网超微结构观察

对一例意外急死的成年健康男性小梁网及施氏管进行了电镜观察。扫描电镜下可见角膜缘内表面小梁粗细不等并以分支连接成网,有的小梁为薄板状,其上可有孔洞。透射电镜观察,施氏管内侧壁为内皮,内皮细胞胞质内有巨大饮液泡及许多小饮液泡。小梁网的外侧部为内皮网区,由多突起细胞连接成网,网孔中有少量胶原原纤维,其内侧部为小梁区,由小梁及小梁间隙组成,小梁由内皮、基板、基质层、致密中轴组成。有的小梁内皮细胞有纤毛。本文对房水排出途径及小梁区、内皮网区电镜构造及相关功能进行了初步讨论。     

青光眼患者小梁网中一氧化氮合酶的表达

目的 检测正常人和急性闭角型青光眼(acute angle-closure glaucoma,AACG)患者小梁网中诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)和内皮型一氧化氮合酶(endothelia nitric oxide synthase,eNOS)的表达,探讨小梁网中的一氧化氮合酶的变化及与青光眼的关系.方法 取5例正常人及15例AACG患者小梁网组织标本,应用免疫组织化学方法检测小梁细胞eNOS和iNOS的表达,并采用计算机图像分析系统对检测结果进行分析.结果 正常人的小梁网组织标本有eNOS的表达,阳性细胞分布均匀,iNOS呈弱阳性或不表达.AACG患者小梁网组织标本中,eNOS和iNOS均呈阳性表达,iNOS主要分布在邻管组织和Schlemm管.iNOS阳性表达比正常对照组增强(P＜0.05),而eNOS阳性表达比正常对照组减弱(P＜0.01).结论 AACG患者小梁网细胞eNOS表达减少而iNOS表达增多且主要分布在邻管组织、Schlemm管,提示一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)在青光眼发病中起重要作用,是导致或加重青光眼的因素之一.     

SIRT1增强青光眼小梁网细胞DSBs修复能力及抗细胞衰老的研究

目的 研究Ⅲ类组蛋白去乙酰化酶SIRT1与青光眼小梁网细胞（GTM）DNA双链损伤（DSBs）修复能力及细胞衰老之间的关系。方法 首先通过RT-PCR和Western blot检测正常小梁网细胞（HTM）与GTM之间SIRT1表达的差异;然后将HTM、GTM细胞分别分为4组,白藜芦醇组（0.5 μmol/L Res干预24 h）、SIRT1-ShRNA组（构建成功的SIRT1干扰质粒转染细胞）、microRNA34a组（构建成功的microRNA34a表达质粒转染细胞）以及Control组,通过Western blot检测各组细胞中SIRT1表达水平的差异;SA-β-Gal衰老染色检测连续生长10 h、32 h、3 d、6 d后各组细胞的衰老变化;中性彗星电泳检测经1.33 mol/L H2O2液处理0 h、2 h时各组细胞中DNA双链损伤情况;Western blot检测1.33 mol/L H2O2液处理0 h、1 h、2 h后,各组细胞中γ-H2AX表达的变化情况。结果 HTM及GTM细胞中均存在SIRT1的表达,且HTM中的表达要高于GTM;HTM、GTM细胞各组内比较发现,SIRT1蛋白的表达水平呈Res组＞Control组＞microRNA34a组＞SIRT1-ShRNA组趋势;SA-β-Gal衰老染色则发现在相同时间点,GTM细胞的衰老程度均高于HTM细胞,而在同一类细胞中,SIRT1-ShRNA组细胞最先表现出衰老,且随着时间的延长,其衰老程度也最为严重,Res干预细胞24 h后,能明显延缓细胞衰老。中性彗星电泳检测表明经氧化剂处理后,GTM组双链DNA的损伤情况比HTM组严重,并呈现出SIRT1-ShRNA组>microRNA34a组>Control组>Res组的趋势,γ-H2AX表达量的检测结果与中性彗星电泳的结果一致。结论 SIRT1表达活性的下调可能是诱发青光眼的因素之一;Res能显著增强HTM细胞中SIRT1的表达活性,上调的SIRT1能促进HTM细胞DNA双链损伤修复的能力,维持细胞基因组的稳定性,进而减缓细胞的衰老。     

重组人骨形态发生蛋白7对原发性开角型青光眼小梁网细胞增殖的影响

目的 建立原发性开角型青光眼(POAG)小梁网细胞体外原代培养体系; 分析不同终浓度重组人骨形态发生蛋白7(rhBMP7)对POAG小梁网细胞增殖的影响; 探讨rhBMP7与POAG发生、进展的相关性。 方法 取术中切除的带小梁网组织块(未使用丝裂霉素C),进行体外原代及传代培养,取3代小梁网细胞,在CFDA SE标记后,分别加入终浓度为0(对照组),20,50,80,100,200 ng/mL的rhBMP7无血清培养基,采用CCK8、荧光显微镜、流式细胞仪等方法检测POAG小梁网细胞增殖情况。 结果 细胞经传代培养,经鉴定为POAG小梁网细胞; 采用CCK8法检测发现:经终浓度为0(对照组),20,50,80,100,200 ng/mL的rhBMP7处理后,POAG小梁网细胞吸光度(OD值)分别为:(0.561 2±0.026 9),(0.724 2±0.039 3),(1.416 0±0.016 2),(1.740 4±0.039 2),(1.853 8±0.014 5),(1.936 4±0.054 6); 实验组细胞增殖率分别为1.37%,2.96%,3.70%,3.96%,4.15%; 实验组与对照组及各实验组间增殖率比较,差别具有统计学意义(P<0.05); 荧光显微镜示:随着rhBMP7终浓度的增加,经CFDA SE标记的POAG小梁网细胞荧光染色变浅、细胞量及密度增加; 采用流式细胞仪检测经20,50,80,100,200 ng/mL终浓度rhBMP7干预的POAG患者小梁网细胞,分裂、增殖细胞所占的比例分别为17.85%,18.63%,20.10%,27.45%,72.41%。 结论 运用组织块培养法,可体外原代培养出POAG患者的小梁网细胞; rhBMP7在一定程度上可促进POAG小梁网细胞的增殖,且在一定范围内呈剂量依赖性。     

青光眼患者小梁网中ONOO^-的表达及与眼压升高关系的研究

目的检测正常人和原发性急性闭角型青光眼(primary acute angle closure glaucoma,PAACG)及原发性慢性闭角型青光眼(primary chronic angle closure glaucoma,PCACG)患者小梁网组织标本中过氧亚硝基阴离子(peroxynitrite,ONOO-)的表达,探讨小梁网中ONOO-的变化、分布及与青光眼的关系。方法取正常眼6例及PAACG患者14例18只眼及PCACG患者12例15只眼小梁网组织标本,应用形态学观察,免疫组织化学方法检测小梁细胞ONOO-的标志物硝基酪氨酸(nitrotyrosine,NT)的表达,并采用计算机图像分析系统对检测结果进行分析。结果正常人的小梁网组织标本NT的表达呈弱阳性或不表达,PAACG组小梁网组织中NT呈强阳性表达,PCACG组小梁网组织中NT呈阳性表达,3组间的差异均具有统计学意义(F=25.32,P<0.01),眼压与小梁网NT着色强度呈相关关系(P<0.01)。结论正常人的小梁网细胞ONOO-微弱表达而PAACG与PCACG患者小梁网细胞ONOO-大量表达且其表达量随眼压的升高而增多,表明眼压升高可导致ONOO-过量生成,从而损伤小梁网细胞,进一步加重青光眼眼压升高。     

原发性开角型青光眼小梁网内皮细胞凋亡的探讨

目的对比观察原发性开角型青光眼小梁网内皮细胞凋亡数目与正常尸眼小梁网内皮细胞凋亡数目的变化,并探讨其可能的发病机制。方法对16例20眼原发性开角型青光眼（观察组）手术中所切取的小梁组织与17例30眼正常尸眼（对照组）所切除的小梁组织,分别采用流式细胞术进行小梁网内皮细胞凋亡数目的测定,比较原发性开角型青光眼小梁网内皮细胞凋亡情况。结果通过实验发现原发性开角型青光眼小梁网内皮细胞凋亡比例（16％）明显高于正常尸眼小梁网内皮细胞凋亡（5％）。二者相比差异有统计学意义（P〈0．05）。结论原发性开角型青光眼小梁网对房水的滤过率下降,可能与小梁网内皮细胞凋亡数目的增多导致小梁网组织滤过功能的下降有一定的关系．     

青光眼角膜生物力学与视盘生物力学的关系

【目的】探索青光眼患者角膜生物力学与视盘生物力学间的关系。【方法】前瞻性病例观察研究。观察32例原发性开角型青光眼（POAG）患者、20例正常眼压性青光眼（NTG）患者、15例高眼压症（OHT）者和26例正常者的角膜生物力学参数及筛板厚度特征，评估测量筛板厚度（LCT）的可重复性，采用单因素方差分析比较不同类型青光眼者间筛板厚度差异，并应用Spearman相关分析方法分析角膜生物力学参数与筛板厚度相关性。【结果】扫频OCT所测量筛板厚度的Cronbach′sα系数0.911，组内相关系数ICC也大于0.8，重复性较好。POAG、NTG患者LCT较OHT患者和正常者偏薄（P<0.05）。OHT与正常者间LCT未见明显统计学差异（P=0.653）。LCT与角膜生物力学参数最大变形幅度（DA）、最大压陷时间（HCT）、第二次压平速度（A2V）及最大压陷屈膝峰间距（PD）间存在明显相关性。【结论】筛板厚度在青光眼患者中具有特征性，是青光眼疾病的重要参数。且LCT与角膜生物力学代表性参数间存在明显相关，角膜生物力学具备评估视盘生物力学的可能。     

醛化脐带静脉管在非穿透性小梁手术治疗原发性开角型青光眼的临床研究

 摘要：目的 评价醛化脐带静脉管(HUV)在非穿透性小梁手术(NPTS)中治疗原发性开角型青光眼(POAG)的临床疗效。方法 采用前瞻性随机对照临床试验研究,对49例(49眼) POAG患者,HUV组23例行NPTS联合HUV植入,对照组26例行NPTS。术后观察、比较的指标包括：术后眼内压(IOP)、抗青光眼药物使用数量、滤过泡形态特点以及术后并发症。所有研究对象随访12 mo。结果 术后12 mo,手术完全成功(IOP在6~21 mmHg之间,并且不需加用任何抗青光眼药物)：HUV组86.96%,对照组69.23%。术后12 mo,HUV组和对照组IOP分别从术前(39.73 ± 4.91) mmHg、(38.99 ± 4.72) mmHg降至(15.81 ± 1.09) mmHg、(19.88 ± 2.21) mmHg (P = 0.00)。对照组术后早期出现低眼压3例(11.54%),HUV组未发生;对照组出现包裹性滤过泡5例(19.23%),HUV组仅出现1例(4.35%)。结论 NPTS联合HUV植入治疗POAG,具有手术成功率高,术后IOP控制良好,术后并发症发生率低的特点。