三维培养的人皮肤成纤维细胞的实验研究

目的探讨三维培养的人皮肤成纤维细胞的生物学特性,为其在皮肤组织工程中的应用提供进一步的实验依据。方法培养人皮肤成纤维细胞,制备鼠尾胶原;对人皮肤成纤维细胞进行三维培养,流式细胞仪检测细胞的增殖和凋亡,RTPCR检测TGFβ1、层粘连蛋白(fibronectin,Fn)mRNA的表达,电镜观察细胞的形态学特征。结果三维培养的人皮肤成纤维细胞增殖缓慢,未见明显细胞凋亡。RTPCR检测二维、三维培养的人皮肤成纤维细胞TGFβ1、FnmRNA的表达无明显差异。电镜观察细胞染色质多,细胞器丰富。结论三维培养的人皮肤成纤维细胞增殖缓慢,但生物学活性良好。     

人体不同部位正常皮肤成纤维细胞对机械张力反应的研究

目的探讨人体不同部位正常皮肤成纤维细胞对机械张力反应的差异。方法取色素痣切除患者自愿捐赠的背部和上臂内侧正常皮肤,应用组织块法体外培养成纤维细胞,取第5~8代细胞进行实验。将背部和上臂内侧正常成纤维细胞分别设实验组和对照组,实验组细胞采用多通道细胞应力加载仪加载周期性机械张力24、36、48 h;对照组细胞正常培养。各时间点加载结束后,倒置显微镜下观察细胞形态变化;CCK-8法检测细胞增殖活性;RT-PCR法检测细胞内整合素β1、P130Ca s(p130Crk-associated substance)、TGF-β1、Ⅰ型胶原a1链(collagen type Iα1 chain,COL1A1)m RNA水平;ELISA法检测Ⅰ型胶原和TGF-β1含量。对照组于培养对应时间取细胞进行以上观察。结果实验组加载后细胞均增殖旺盛,分布密集,排列呈一定方向性。加载24 h后,实验组背部及上臂内侧细胞增殖,整合素β1、P130Cas、TGF-β1 m RNA表达水平和TGF-β1含量比较,差异均无统计学意义(P0.05);加载36、48 h时,背部细胞以上检测指标均显著高于上臂内侧细胞,差异有统计学意义(P0.05)。实验组各时间点背部及上臂内侧细胞的COL1A1 m RNA表达水平和Ⅰ型胶原含量比较,差异均无统计学意义(P0.05)。对照组各时间点背部及上臂内侧细胞以上指标比较,差异均无统计学意义(P0.05)。结论背部和上臂内侧皮肤成纤维细胞对机械张力的反应不同,提示人体皮肤成纤维细胞的力学特征存在部位差异,可能导致不同部位增生性瘢痕的发生率不同。     

瘢痕成纤维细胞三维培养的实验研究

在细胞单层培养系统的基础上，将瘢痕组织来源的成纤维细胞３培养在胶原凝胶中，形成了瘢痕成纤维细胞的三维培养系统。这一系统使细胞、细胞外基质以及各种调控因素共同构成了一个有机整体，成纤维细胞在这一整体中所表达的生物学行为更国接近于它们在活体瘢痕组织中的行为。运用成纤维细胞三维培养系统不仅可以观察和研究细胞的形态、生长增殖和物质代谢，还可以研究细胞在组织收缩方面的细胞生理学功能，是创伤愈合和瘢痕形成研究     

成纤维细胞生物学特性与扩张皮肤回缩的实验研究

目的　通过对皮肤肌成纤维细胞 (MFB)特征性标志α平滑肌肌动蛋白 (αSMA)的检测 ,研究扩张皮肤回缩的机理。方法　通过犬皮肤扩张实验 ,采用电镜观察和免疫组化等方法检测。结果　免疫组化研究发现 ,扩张后皮肤真皮组织内αSMA阳性成纤维细胞仅个别散在 ,但超微结构显示成纤维细胞内微丝粗大明显 ,出现密纤、密斑。结论　扩张刺激未使纤维细胞转变为肌成纤维细胞 ,但成纤维细胞功能活跃。具备了收缩功能的细胞结构 ,在细胞水平产生收缩动力 ,导致扩张皮肤回缩。     

瘢痕成纤维细胞三维培养的实验研究

在细胞单层培养系统的基础上,将瘢痕组织来源的成纤维细胞培养在胶原凝胶中,形成了瘢痕成纤维细胞的三维培养系统。这一系统使细胞、细胞外基质以及各种调控因素共同构成了一个有机整体,成纤维细胞在这一整体中所表达的生物学行为更加接近于它们在活体瘢痕组织中的行为。运用成纤维细胞三维培养系统不仅可以观察和研究细胞的形态、生长增殖和物质代谢,还可以研究细胞在组织收缩方面的细胞生理学功能,是创伤愈合和瘢痕形成研究领域里一个新的和更为科学的方法。     

瘢痕成纤维细胞三维培养的实验研究

在细胞单层培养系统的基础上，将瘢痕组织来源的成纤维细胞培养在胶原凝胶中，形成了瘢痕成纤维细胞的三维培养系统。这一系统使细胞、细胞外基质以及各种调控因素共同构成了一个有机整体，成纤维细胞在这一整体中所表达的生物学行为更加接近于它们在活体瘢痕组织中的行为。运用成纤维细胞三维培养系统不仅可以观察和研究细胞的形态、生长增殖和物质代谢，还可以研究细胞在组织收缩方面的细胞生理学功能，是创伤愈合和瘢痕形成研究领域里一个新的和更为科学的方法。     

机械创伤诱导皮肤成纤维细胞去分化的实验研究

目的:研究机械创伤是否能诱导皮肤成纤维细胞发生去分化.方法:建立体外培养细胞划痕损伤模型和体内全层皮肤损伤模型,应用免疫荧光染色、免疫组织化学、蛋白质印迹、转录组测序、siRNA等方法,检测机械创伤后成纤维细胞的形态、增殖情况、干细胞相关标志物的表达、集落形成能力、表达谱等的变化.结果:机械创伤后成纤维细胞逐渐变小变圆,发生类干细胞形态转变,并于创伤后36 h被激活而发生明显增殖,且创伤后成纤维细胞的激活不受创伤严重程度的影响.机械创伤后成纤维细胞中的干细胞标志物Sox2、波形蛋白的表达明显增强,集落形成能力也明显提高.体内实验也发现创面肉芽组织中出现大量Sox2阳性细胞.表达谱分析发现成纤维细胞的多能干细胞通路及相关调控分子表达明显增强.机械划痕后2h创缘成纤维细胞中的总β-catenin和ser 675磷酸化的β-catenin的表达较对照组明显增强;应用β-catenin siRNA抑制成纤维细胞内的β-catenin表达后,机械创伤后创缘成纤维细胞中的Sox2阳性细胞几乎消失.结论:机械创伤可诱导皮肤成纤维细胞的去分化:β-catenin介导了机械创伤后成纤维细胞的去分化过程.     

感觉神经对鼠皮肤伤口愈合中肌成纤维细胞分化的影响

在伤口愈合过程中，肌成纤维细胞通过其胞浆内的α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的收缩，使伤口皮缘相互靠拢，从而闭合伤口。通常认为肌成纤维细胞主要由成纤维细胞、平滑肌细胞以及血管周围细胞分化而来。细胞间质以及巨噬细胞释放的转化生长因子β(TGF-β)和α-SMA表达诱导因子参与肌成纤维细胞分化的调控，肥大细胞脱颗粒释放的类     

雌激素诱导皮肤成纤维细胞向肌成纤维细胞表型转分化的机制

目的探讨雌激素诱导皮肤成纤维细胞向肌成纤维细胞转分化的可能途径和调控机制。方法将人皮肤成纤维细胞分为6组：对照组（A组）、雌激素组（B组）、雌激素＋ICI-182780组（C组）、雌激素＋SB203580组（D组）、雌激素＋PD98059组（E组）和雌激素＋SP600125组（F组）。各组细胞经同步化处理后,直接以雌激素刺激或经上述各激酶抑制剂预处理后再以雌激素刺激。收集细胞,一部分以单细胞逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测α平滑肌肌动蛋白（alpha smooth muscleactin,（2-SMA）阳性表达百分比,另一部分细胞抽提总RNA后采用实时荧光定量RT—PCR检测α—SMA的表达水平变化。结果B组的α—SMA表达水平和阳性百分比与A组比较显著升高（P〈0．01）,而C组和F组与B组比较α—SMA表达水平和阳性百分比升高的作用则被显著抑制（P〈0．05）。结论在雌激素诱导成纤维细胞向肌成纤维细胞的转分化过程中,雌激素G受体及JNK—MAPK信号转导途径起到重要作用。     

TGF-β/Smads通路与增生性瘢痕肌成纤维细胞分化

临床上常见皮肤增生性瘢痕的挛缩影响皮肤的正常外观和功能，是皮肤整形外科后期治疗的一大难题。这种挛缩是由肌动蛋白为主要成分的微丝和细胞内游离钙离子等构成的非肌性细胞收缩系统作用的结果。在挛缩过程中，瘢痕成纤维细胞向肌成纤维细胞（myofibroblast，MFB）分化，     

Human Primary Osteocyte Differentiation in a 3D Culture System

Studies on primary osteocytes, which compose >90–95% of bone cells, embedded throughout the mineralized matrix, are a major challenge because of their difficult accessibility and the very rare models available in vitro. We engineered a 3D culture method of primary human osteoblast differentiation into osteocytes. These 3D‐differentiated osteocytes were compared with 2D‐cultured cells and with human microdissected cortical osteocytes obtained from bone cryosections. Human primary osteoblasts were seeded either within the interspace of calibrated biphasic calcium phosphate particles or on plastic culture dishes and cultured for 4 wk in the absence of differentiation factors. Osteocyte differentiation was assessed by histological and immunohistological analysis after paraffin embedding of culture after various times, as well as by quantitative RT‐PCR analysis of a panel of osteoblast and osteocyte markers after nucleic acid extraction. Histological analysis showed, after only 1 wk, the presence of an osteoid matrix including many lacunae in which the cells were individually embedded, exhibiting characteristics of osteocyte‐like cells. Real‐time PCR expression of a set of bone‐related genes confirmed their osteocyte phenotype. Comparison with plastic‐cultured cells and mature osteocytes microdissected from human cortical bone allowed to assess their maturation stage as osteoid‐osteocytes. This model of primary osteocyte differentiation is a new tool to gain insights into the biology of osteocytes. It should be a suitable method to study the osteoblast‐osteocyte differentiation pathway, the osteocyte interaction with the other bone cells, and orchestration of bone remodeling transmitted by mechanical loading and shear stress. It should be used in important cancer research areas such as the cross‐talk of osteocytes with tumor cells in bone metastasis, because it has been recently shown that gene expression in osteocytes is strongly affected by cancer cells of different origin. It could also be a very efficient tool for drug testing and bone tissue engineering applications.     

植物雌激素对体外培养的正常人皮肤成纤维细胞的作用

目的：观察植物雌激素（金雀异黄素）对正常人皮肤成纤维细胞的影响,探讨其延缓皮肤衰老的机制。方法：利用体外培养的健康人真皮成纤维细胞,采用四甲基偶氮唑盐（MTT）比色法检测金雀异黄素对成纤维细胞存活力的影响;流式细胞仪检测金雀异黄素作用成纤维细胞后,细胞内活性氧（ROS）水平的改变;用分光光度法检测金雀异黄素作用成纤维细胞后,细胞内超氧化物歧化酶（SOD）活性以及丙二醛（MDA）含量的变化。结果：0．0625、0．125和0．25mg／L的金雀异黄素可以促进人皮肤成纤维细胞的增殖（P〈0．05）,并降低细胞内活性氧（ROS）的产生（19〈0．05）;0．0625～0．25mg／L的金雀异黄素可以减少人正常皮肤成纤维细胞内MDA的生成（P〈0．05）,提高超氧化物歧化酶（SOD）活性（P〈0．05）。结论：金雀异黄素可以促进人正常皮肤成纤维细胞增殖,这可能与金雀异黄素可以降低细胞氧自由基的含量和提高细胞抗氧化的能力有关。     

大鼠肾皮质成肌纤维细胞的体外培养

目的建立肾脏成肌纤维细胞的培养方法，为肾脏纤维化的发病机制和防治措施体外研究提供细胞技术平台。方法采用肾皮质组织块接种培养法，培养的细胞通过相差显微镜观察形态、电镜下观察细胞器，细胞免疫化学染色检测细胞表型标记蛋白等进行鉴定。同时检测细胞对不同细胞因子的生长反应。结果培养的细胞呈梭形，单个核，多突起，表达波形蛋白（vimentin）和平滑肌肌动蛋白（α，SMA），不表达主要存在于血管内皮细胞的抗原上皮氨基肽酶P（EAP），不表达角蛋白（cytokerafin）和结蛋白（desmin）。细胞可以传代至5代，并且保持成肌纤维细胞表型。转化生长因子β1、结缔组织生长因子刺激细胞增殖，而γ-干扰素对细胞无增殖效应。结论原代培养细胞为成肌纤维细胞并且可以传代，具备对细胞因子的生长调节反应，为后续实验提供了基础。     

计算机辅助下颌骨截骨的三维显微结构模型建立

目的 探索计算机重建下颌骨三维显微结构模型及下颌角截骨手术的三维仿真操作方法 ,以减少手术操作中的组织损伤. 方法 利用螺旋CTA数据重建包含血管神经束的下颌骨三维模型并进行测量分析,使用Freeform雕刻刀及其布尔运算的切割方法 对模型进行保护血管的手术模拟.结果 利用计算机辅助技术可以精确的重建包含下牙槽动脉的下颌骨三维模型:血管从下颌孔进入下颌支.依照下颌支外缘弧度走行,下颌孔距下颌支前缘距离为(19.13±0.66)mm,孔距下颌支后缘距离为(18.96±0.64)mm,下颌角的角度为(109.70±4.67)°,下颌支的安全截骨范围和角度是平行下颌支外缘(12.62±0.28)mm宽、与下颌底成角(22.30±4.67)°;根据模型与数据,Fredorm可以模拟安全的下颌角截骨的手术操作. 结论 下颌骨显微结构的三维模型重建和测量分析技术,是增加手术安全性的一条新途径.     

人皮肤成纤维细胞体外转染Brgl基因的实验研究

目的探讨重组Brgl基因转染人皮肤成纤维细胞的可行性,以及转染对细胞增殖和活性的影响。方法体外重组Brgl基因,借助真核表达载体系统,转入体外培养的人皮肤成纤维细胞;通过流式细胞仪检测报告基因表达,并确定细胞转染效率：应用ReahimePCR比较转染前后BrglmRNA的表达;MTT法检测Brgl基因对细胞增殖能力的影响。结果Brgl基因转染后,（73．0±6．7）％的被转染细胞表达报告基因;BrglmRNA在转染组、转染空载体组、未转染组细胞中的表达分别为（6．23±1．18）、（1．11±0．22）和（1．52±0．12）,转染组BrglmRNA相对表达量较未转染组及转染空载体组明显增高（P〈0．01）;细胞的增殖能力在Brgl基因转染前后无显著差异。结论人皮肤成纤维细胞可作为Brgl转染的靶细胞．转染Brgl基因对人成纤维细胞的增殖能力无显著影响。     

瘢痕疙瘩成纤维细胞低密度培养的克隆能力分析

目的：比较瘢痕疙瘩成纤维细胞（KFs）和正常真皮成纤维细胞（NFs）间克隆形成能力的差异,探讨瘢痕疙瘩中病理性干细胞是否存在,及其对瘢痕疙瘩发生发展的影响。方法利用酶消化法获得瘢痕疙瘩和正常皮肤组织的原代细胞,以4000个/皿的密度接种,进行低密度培养,2周后观察细胞克隆的形成及形态变化。结果低密度培养条件下的瘢痕疙瘩成纤维细胞和正常皮肤成纤维细胞都可形成克隆,但KFs可形成明显的克隆集落,NFs形成的克隆不明显且松散。KFs克隆形成率高于NFs,为（0.80±0.21）%,而NFs为（0.18±0.06）%,两者间差异显著（P〈0.05）。结论低密度培养条件下,瘢痕疙瘩成纤维细胞的克隆形成能力高于正常皮肤成纤维细胞,可能与瘢痕疙瘩组织中存在病理性瘢痕疙瘩干细胞有关。     

软骨形态发生蛋白1诱导瘢痕成纤维细胞表达软骨表型的实验研究

目的应用软骨形态发生蛋白1(CDPM1)诱导瘢痕成纤维细胞向软骨细胞分化,探讨其作为烧伤后耳软骨缺损修复的种子细胞的可行性。方法取瘢痕切除术患者的增生性瘢痕组织,提取瘢痕成纤维细胞,CDPM1诱导培养(2%胎牛血清F-12培养液,CDMP1终浓度为100 ng/mL),设阴性、阳性对照组。Image Plus图像软件观察细胞形态变化;免疫荧光、RT-PCR及Western Blot分析诱导前后的软骨相关Ⅰ、Ⅱ型胶原、Sox9、Aggrecan的表达;对第4代细胞行Micromass法培养诱导,HE染色、免疫组织化学染色及Safranine-O染色对诱导结果进行检测。结果诱导后瘢痕成纤维细胞由长梭形向多角形转变,Image Plus软件分析示诱导后细胞长宽比例为(1.48±0.21):1,与诱导前的(7.21±1.54):1相比,差异有统计学意义(P<0.05);与软骨细胞的(1.31±0.13):1相比,差异无统计学意义(P>0.05)。免疫荧光、RT-PCR、Western Blot结果显示,诱导后瘢痕成纤维表达软骨相关指标Ⅱ型胶原、Sox9、Aggrecan。Micromass诱导后行HE染色显示,诱导后部分细胞出现软骨特征性陷窝结构,免疫组织化学染色显示Ⅱ型胶原阳性染色,Safranine-O染色显示微团块诱导后细胞基质红染。结论瘢痕成纤维细胞在软骨形态发生蛋白1诱导下可以向软骨细胞分化,有望成为烧伤后耳软骨缺损修复的种子细胞。     

Bone Response to In Vivo Mechanical Loading in C3H/HeJ Mice

Bone, being sensitive to mechanical stimulus, adapts to mechanical loads in response to bending or deformation. Although the signal/receptor mechanism for bone adaptation to deformation is still under investigation, the mechanical signal is related to the amount of bone deformation or strain. Adaptation to changes in physical activity depends on both the magnitude of increase in strain above average daily levels for maintaining current bone density and the Minimum Effective Strain (MES) for initiating adaptive bone formation. Given the variation of peak bone density that exists in any human population, it is likely that variation in levels for MES is, to a considerable degree, inherited and varies among animal species and breeds. This study showed a dose-related periosteal response to loading in C3H/HeJ mice. The extent of active formation surface, the rate of periosteal bone formation, and area of bone formation increased with increasing peak periosteal strain. In these mice, the loaded tibia consistently showed lower endocortical formation surface and mineral apposition rate than the nonloaded bones at every load level. Although periosteal expansion is the most efficient means of increasing moment of inertia in adaptation to bending, a dose response increase in endocortical formation would have been predicted. Our characterization of the mouse bone formation response to increasing bending loads will be useful in the design of experiments to study the tibial adaptive response to known loads in different mouse breeds. Received: 17 February 1998 / Accepted: 9 December 1998