壳聚糖-胶原支架与人牙周膜细胞复合培养的实验研究

目的 对不同比例的壳聚糖-胶原（chi—col）进行细胞相容性和细胞毒性的研究,以初步探讨其应用于牙周组织工程的可行性。方法 将体外培养的人牙周膜细胞（PDLCs）接种于不同比例的chi—col上复合培养,采用细胞计数评价PDLCs在clli—col上的附着、生长情况,并通过MTF测试法和碱性磷酸酶（ALP）活性检测法研究chi—col浸提液对PDLCs增殖和功能表达的影响。结果 人PDLCs在chi—col上形成良好贴附并增殖,而PDLCs在不同浓度的材料浸提液中的生长、增殖及ALP活性与对照组相比无统计学意义。结论 clli—col具有良好的三维空间结构和细胞相容性,且无细胞毒性,有望成为牙周组织工程的支架材料。     

骨髓基质细胞和胶原膜BME-10X生物相容性的实验研究

目的 观察胶原膜BME-10X与Beagle犬骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells, BMSCs)的生物相容性,为将其运用于组织工程技术修复牙周缺损提供理论依据.方法 体外培养Beagle犬BMSCs,并与胶原膜BME-10X复合培养.HE染色检测细胞与材料的黏附,MTT法检测细胞的增殖,并行碱性磷酸酶(ALP)活性检测.结果 BMSCs复合胶原膜后生长良好,MTT及ALP结果均显示,在各时间点,对照组和实验组间增殖及ALP活性均无显著性差异(P>0.05).结论 胶原膜BME-10X有良好的生物相容性,有望成为BMSCs的载体材料应用于牙周组织工程研究.     

三维立体培养MIN-6β细胞调节I型糖尿病小鼠血糖水平的实验研究

目的:探讨MIN-6 β细胞经人工合成丝素-Ⅳ型胶原支架三维立体培养后用于移植治疗Ⅰ型糖尿病的新方法?方法: 冷冻干燥法制备丝素-Ⅳ型胶原支架并检测,将MIN-6 β细胞种植于丝素-Ⅳ型胶原支架中三维培养,观察细胞定植及细胞活力?将种植有MIN-6 β细胞复合培养的丝素-Ⅳ型胶原支架移植入Ⅰ型糖尿病小鼠腹腔,监测对比其血糖变化情况和胰岛素的表达? 结果:丝素-Ⅳ型胶原支架为不规则片层样与多孔相结合的结构,各支架三维培养组效果均明显优于传统二维平面培养组,差异存在统计学意义(P < 0.05),各支架复合培养组移植入糖尿病动物体内后的降血糖效果与作用时间均要优于无支架组,差异存在统计学意义(P < 0.05)?移植物中MIN-6 β 细胞胞浆内存在有特异性棕黄色受染区域,证实存在胰岛素表达?结论:丝素-Ⅳ型胶原支架有良好的生物相容性且有利于MIN-6 β细胞的生长定植及功能表达?     

SD大鼠颌下腺腺泡细胞培养及胶原海绵的细胞相容性

【目的】研究SD大鼠颌下腺腺泡细胞体外培养方法以及和胶原海绵的细胞相容性,探讨胶原海绵应用于涎腺组织工程支架材料的可行性。【方法】取新生SD大鼠颌下腺组织,胰酶消化后将细胞于适宜的体外环境培养、纯化、鉴定,并将鉴定好的颌下腺腺泡细胞移植到胶原海绵上,采用DAPI进行特异性的核染色,荧光显微镜下观察腺泡细胞与胶原海绵的相容情况,评价腺泡细胞与胶原海绵的相容性。【结果】体外培养的颌下腺腺泡细胞经纯化后能够分泌特异性的淀粉酶,免疫细胞化学淀粉酶抗体阳性染色,并能在胶原海绵上正常增殖。【结论】体外培养的颌下腺腺泡细胞具备腺泡细胞的生物学特征并与胶原海绵有很好的相容性,有望将胶原海绵作为组织工程化涎腺组织的支架材料之一。     

TGF-β胶原缓释微球复合新型生物活性多孔支架的制备以及其细胞相容性的研究

背景前期研究已经成功制备了硫酸钙/冻干骨复合型生物多孔支架,但是其细胞相容性仍有待提高。目的制备胶原缓释微球复合硫酸钙/冻干骨支架,并且研究该种植体的细胞相容性;方法采用煅烧挂浆法制备复合种植体。将第三代成骨细胞分别与原支架（对照组）和表面修饰后的支架（实验组）复合培养。通过倒置显微镜观察细胞生长情况。扫描电镜观察表面修饰后的材料及细胞与材料复合的形态学特征;分别使用细胞蛋白质及细胞粘附率测定方法对细胞与材料复合培养后增殖与分化能力进行评估。结果实验组细胞的黏附率高于对照组（P〈0.05）;在培养的不同时期细胞的蛋白质含量较对照组多（P〈0.05）。制备的支架能促进成骨细胞的生长,并且发现细胞有向空隙内部长入的趋势。结论经过表面修饰后的支架较原来的细胞相容性有了明显提高。     

负载siRNA胶原/生物活性玻璃复合材料的成骨作用

目的探讨负载siRNA胶原/生物活性玻璃复合材料的成骨作用。方法冷冻干燥法分别制备胶原/生物玻璃、负载阴性对 照siRNA胶原/生物玻璃和负载noggin胶原/生物玻璃3组复合材料。用CCK8试验检测空白组上述3组不同支架材料浸提液对 细胞增殖的影响,ALP活性检测、q-PCR检测、茜素红染色评估3组不同支架对MC3T3细胞矿化的影响。结果材料浸提液共培 养MC3T3细胞3、5 d后,胶原/生物玻璃复合材料、负载阴性对照siRNA胶原/生物玻璃复合材料和负载noggin胶原/生物玻璃支 架组细胞增殖数目均明显高于空白组,差异具有统计学意义（P<0.05）。培养14 d后,负载siRNA胶原/生物玻璃支架组ALP活 性高于单纯支架组,差异具有统计学意义（P<0.05）。培养14 d后,负载siRNA胶原/生物玻璃支架组ALP、Runx2、BSP表达量高 于单纯支架组,差异具有统计学意义（P<0.05）。茜素红染色结果表明负载siRNA胶原/生物玻璃支架组较其余组有更多矿化结 节形成,差异具有统计学意义（P<0.05）。结论负载siRNA胶原/生物玻璃复合材料支架具有良好的生物相容性,胶原/生物玻璃 复合材料和siRNA noggin可协同增效促进成骨。     

含bFGF的壳聚糖-胶原复合支架对牙周膜细胞生长和增殖的影响

【目的】探讨含碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）的壳聚糖-Ⅰ型胶原复合支架对人牙周膜细胞（HPDLC）生长和增殖的影响。【方法】MTT法观察含bFGF因子壳聚糖-Ⅰ型胶原复合支架浸出液、不含bFGF因子壳聚糖-Ⅰ型胶原复合支架浸出液以及正常细胞培养液对HPDLC生长和增殖的影响，利用流式细胞仪（FCM）检测上述3种液体对HPDLC细胞周期的影响，并将HPDLC接种于含bFGF因子壳聚糖-Ⅰ型胶原复合支架和不含bFGF因子壳聚糖-Ⅰ型胶原复合支架内，通过免疫细胞组织化学和激光共聚焦显微镜来检测HPDLC在复合支架内的存活和增殖情况。【结果】含bFGF因子壳聚糖-Ⅰ型胶原复合支架浸出液对HPDLC生长和增殖的促进作用明显强于不含bFGF因子壳聚糖-Ⅰ型胶原复合支架浸出液和正常细胞培养液．而后两组间无统计学意义；含bFGF因子壳聚糖-Ⅰ型胶原复合支架浸出液促进HPDLC从G1期进入S期；HPDLC在含bFGF因子壳聚糖-Ⅰ型胶原复合支架内的生长和增殖也明显优于不含bFGF因子壳聚糖-Ⅰ型胶原复合支架。【结论】含bFGF因子壳聚糖-Ⅰ型胶原复合支架可以促进体外培养的HPDLC生长和增殖。     

曲古抑菌素A对大鼠脂肪干细胞在二维及三维培养下早期骨向分化的影响

目的:研究曲古抑菌素A(trichostatin A,TSA)对大鼠脂肪干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)在二维培养板(TCP)和三维复合纳米羟基磷灰石/胶原(nano-hydroxyapatite/collagen,nHAC)支架上早期骨向分化的影响?方法:处理组分别在含75 nmol/L TSA的二维培养板和三维 nHAC上培养ADSCs(TCPT组和nHACT组),未添加TSA的两组(TCP组和nHAC组)为对照组?使用扫描电子显微镜(field emission scanning electron microscope,FESEM)对接种ADSCs 1?3 d后nHAC和nHACT组细胞的生长情况进行表征,以碱性磷酸酶(ALP)活性为早期骨向分化指标,分别检测3?5?7 d时的ALP活性,用Western blot检测成骨指标Runx2?骨桥蛋白(OPN)?骨形态发生蛋白2(BMP2)的表达?结果:ADSCs在三维培养中均表现出良好的粘附?铺展,其中经TSA诱导的细胞对支架的黏附?铺展更好;ALP值在3?5?7 d持续增高,其中以nHACT组最高,组间差异显著(P < 0.05);Western blot结果显示Runx2?OPN?BMP2在 nHACT组表达最高,与ALP结果一致?结论:TSA对ADSCs早期骨向分化有促进作用,复合三维支架共培养后促进作用显著?     

前列腺癌miRNA表达谱及miR-96在氧化应激信号通路中的作用

【目的】 检测miRNA在前列腺癌与正常前列腺组织的表达差异,并探讨表达异常的miRNA在前列腺癌发病中的作用?【方法】 前列腺癌和正常前列腺组织样品(100 mg),Trizol法提取RNA,应用聚合酶链反应(PCR)芯片检测miRNA的表达;同时以250 μmol/L的过氧化氢(H2O2)刺激前列腺癌PC-3细胞4 h,继续正常培养12 h?检测不同时间点细胞内活性氧(ROS)水平,以实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测miR-96在各组细胞中的表达?【结果】 与正常前列腺组织相比,前列腺癌组织中miR-144?miR-216a上调5.9倍,miR-96上调30.4倍,miR-488?miR-873下调到4.9%,差异有统计学意义(P < 0.05)?PC-3细胞内ROS为RWPE-1细胞的5.2倍(P < 0.05),miR-96在PC-3细胞中的表达为RWPE-1细胞的15.4倍(P < 0.05)?H2O2刺激PC-3细胞1?4 h后,胞内ROS为对照组的4.3?6.4倍(P均 < 0.05),miR-96表达水平为对照组的10.2?18.9倍(P均 < 0.05);10?16 h组胞内ROS为对照组的2.5倍?1.2倍,miR-96表达水平为对照组的2.7?1.9倍(P均 > 0.05)?【结论】 在前列腺癌组织中发现了若干有表达差异的miRNA;miR-96参与前列腺癌细胞的氧化应激信号途径,可能是防治前列腺癌的重要分子靶点?     

含bFGF的壳聚糖-胶原复合支架对牙周膜细胞生长和增殖的影响

 【目的】探讨含碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）的壳聚糖-Ⅰ型胶原复合支架对人牙周膜细胞（HPDLC）生长和增殖的影响。【方法】MTT法观察含bFGF因子壳聚糖-Ⅰ型胶原复合支架浸出液、不含bFGF因子壳聚糖-Ⅰ型胶原复合支架浸出液以及正常细胞培养液对HPDLC生长和增殖的影响，利用流式细胞仪（FCM）检测上述3种液体对HPDLC细胞周期的影响，并将HPDLC接种于含bFGF因子壳聚糖-Ⅰ型胶原复合支架和不含bFGF因子壳聚糖-Ⅰ型胶原复合支架内，通过免疫细胞组织化学和激光共聚焦显微镜来检测HPDLC在复合支架内的存活和增殖情况。【结果】含bFGF因子壳聚糖-Ⅰ型胶原复合支架浸出液对HPDLC生长和增殖的促进作用明显强于不含bFGF因子壳聚糖-Ⅰ型胶原复合支架浸出液和正常细胞培养液．而后两组间无统计学意义；含bFGF因子壳聚糖-Ⅰ型胶原复合支架浸出液促进HPDLC从G1期进入S期；HPDLC在含bFGF因子壳聚糖-Ⅰ型胶原复合支架内的生长和增殖也明显优于不含bFGF因子壳聚糖-Ⅰ型胶原复合支架。【结论】含bFGF因子壳聚糖-Ⅰ型胶原复合支架可以促进体外培养的HPDLC生长和增殖。     

Synthesis and characterization of UPPE-PLGA-rhBMP2 scaffolds for bone regeneration

A novel unsaturated polyphosphoester(UPPE) was devised in our previous research,which is a kind of promising scaffold for improving bone regeneration.However,the polymerization process of UPPE scaffolds was unfavorable,which may adversely affect the bioactivity of osteoinductive molecules added if necessary,such as recombinant human bone morphogenetic protein-2(rhBMP2).The purpose of this study was to build a kind of optimal scaffold named UPPE-PLGA-rhBMP2(UPB) and to investigate the bioactivity of rhBMP2 in this scaffold.Furthermore,the cytotoxicity and biocompatibility of UPB scaffold was assessed in vitro.A W1/O/W2 method was used to fabricate PLGA-rhBMP2 microspheres,and then the microspheres were added to UPPE for synthesizing UPB scaffold.The morphological characters of PLGA-rhBMP2 microspheres and UPB scaffolds were observed under the scanning electron microscopy and laser scanning confocal microscopy.The cumulative release of UPB scaffolds was detected by using ELISA.The cytotoxicity and biocompatibility of UPB scaffolds were evaluated through examining the adsorption and apoptosis of bone marrow stromal cells(bMSCs) seeded on the surface of UPB scaffolds.The bioactivity of rhBMP2 in UPB scaffolds was assessed through measuring the alkaline phosphates(ALP) activity in bMSCs seeded.The results showed that UPB scaffolds sequentially exhibited burst and sustained release of rhBMP2.The cytotoxicity was greatly reduced when the scaffolds were immersed in buffer solution for 2 h.bMSCs attached and grew on the surface of soaked UPB scaffolds,exerting well biocompatibility.The ALP activity of bMSCs seeded was significantly enhanced,indicating that the bioactivity of rhBMP2 remained and still took effect after the unfavorable polymerization process of scaffolds.It was concluded that UPB scaffolds have low cytotoxicity,good biocompatibility and preserve bioactivity of rhBMP2.UPB scaffolds are promising in improving bone regeneration.     

3D打印明胶海藻酸钠凝胶支架对人牙髓细胞的黏附增殖作用

目的 探讨3D打印的明胶海藻酸钠凝胶支架对人牙髓细胞(HDPCs)的细胞毒性,及不同接种方法对细胞黏附生长的差异.方法 组织块酶消化法分离培养HDPCs,利用Bioplotter三维生物打印机进行明胶海藻酸钠凝胶支架的3D打印,选取第3代HDPCs,Cell Counting Kit-8试剂检测不同浓度材料浸提液对细胞增殖的影响,扫描电镜观察、台盼蓝染色计数比较直接滴加低浓度细胞悬液与高浓度细胞浓缩液接种法,对细胞在材料表面黏附与增殖作用的差异.结果 不同浓度的材料浸提液均对HDPCs细胞毒性为0,具有促进细胞增殖的作用.HDPCs在3D打印的明胶海藻酸钠凝胶支架上生长良好,先滴加高浓度的细胞浓缩液可以更有效的促进细胞对材料的黏附,5d后材料表面的细胞计数结果较滴加低浓度细胞悬液显著增加,差异具有统计学意义(P＜0.05).结论 3D打印的明胶海藻酸钠凝胶支架具有良好的生物相容性,具有促进HDPCs增殖的作用,可作为牙再生的支架材料,选择高浓度细胞浓缩液接种细胞更有利于细胞黏附.     

生物珊瑚人工骨支架材料生物相容性检测

目的评价生物珊瑚人工骨(BCAB)材料作为骨组织工程支架材料与小鼠胚胎干细胞(MESCs)构建组织工程骨的有效性及材料生物相容性。方法设MESCs与BCAB支架材料混合黏附培养为实验组,单纯MESCs培养为对照组,分别于第2、4、6、8天进行MTT法检测细胞增殖活性,特异性胚胎抗原-1检测细胞对材料的黏附性。于第8日对接种细胞材料片行成骨诱导,诱导培养10 d后行茜素红染色及电镜扫描检测成骨诱导及体外组织工程骨构建情况。取12只大鼠,脊柱左侧皮下植入空白BCAB支架片状材料,右侧植入黏附细胞BCAB片状材料,随机分4、8、12周3组行影像学检查,并取双侧标本行病理切片观察局部炎症反应,四环素标记下荧光显微镜观察成骨情况。第12周组取心、肝、肾病理切片及评估心、肝、肾毒性反应。结果 MTT法检测细胞增殖活性结果显示,在培养2 d和4 d时实验组与对照组间MTT值差异无统计学意义(P>0.05),在6 d及8 d时实验组MTT值明显高于对照组,差异具有统计学意义(P<0.05)。特异性胚胎抗原-1检测证实MESCs对BCAB支架材料具有良好的黏附性,在其三维微孔隙内能较快增殖。茜素红染色及电镜扫描检测证实黏附细胞材料成骨诱导有效,体外组织工程骨构建成功。材料植入局部组织炎症反应轻,空白支架材料于第8周开始降解,12周达初步降解,无异位成骨;黏附细胞支架材料则有明显异位成骨现象,且较对侧空白支架材料降解时效延长。第12周组实验动物心、肝、肾标本病理切片未见异常损害。结论 BCAB支架材料具有良好的生物相容性,其降解周期与新骨重建周期大致相当,是一种良好的骨组织工程支架材料。     

骨碎补柚皮苷对人牙周韧带细胞增殖和成骨分化潜能的影响

目的:探讨骨碎补柚皮苷对人牙周韧带细胞的增殖能力以及成骨分化潜能的影响.方法:MTT法检测在含有不同浓度骨碎补柚皮苷的细胞培养液中人牙周韧带细胞的增殖特性;检测不同浓度骨碎补柚皮苷作用后人牙周韧带细胞中碱性磷酸酶(ALP)活性的改变.结果:骨碎补柚皮苷≥0.01 μmol/L时能增进人牙周韧带细胞增殖(P<0.05),并能增加其ALP活性(P<0.05).结论:骨碎补柚皮苷可提高人牙周韧带细胞的增殖能力及成骨分化的潜能.     

负载成骨生长肽的静电纺丝PLGA支架可加速大鼠颅骨缺损再生

目的 从体内外水平评价一种负载了成骨生长肽（OGP）的聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）纤维支架作为新型骨组织工程支架的可行性。方法 采用静电纺丝法制备支架,一共有4组。对照组：纯PLGA支架（不含OGP的 PLGA支架）;实验组：0.1%OGP@PLGA（电纺含有0.1%OGP的PLGA溶液制得的支架）、0.2%OGP@PLGA（电纺含有0.2%OGP的PLGA溶液制得的支架）、0.4%OGP@PLGA（电纺含有0.4%OGP的PLGA溶液制得的支架）。通过扫描电子显微镜（SEM）观察支架的微观结构,将材料浸泡在PBS中观察支架中OGP的释放规律,CCK-8和活死细胞染色实验评估支架的体外生物相容性,ALP活性检测和ARS染色评估支架上大鼠骨髓间充质干细胞（rBMSCs）的体外成骨分化水平,在雄性SD大鼠上制备直径为5 mm大小的颅骨缺损模型,将支架植入8周后利用Micro-CT检测、HE染色和Masson染色分析缺损处的骨修复情况。结果 SEM结果显示,支架具有类细胞外基质（ECM）的纤维结构,负载的OGP能持续从支架内缓释长达1月以上,将细胞与支架共培养4、7 d后,负载高浓度OGP（OGP浓度大于2%）的PLGA支架细胞增殖率显著高于纯PLGA支架（P<0.01）,ALP活性检测结果显示第14天时,在负载0.4%含量OGP的PLGA支架上rBMSCs的ALP活性最高（P<0.01）。ARS染色结果显示,细胞14 后在负载0.4% OGP的PLGA支架上分泌的钙化结节最多。Micro-CT扫描结果发现,负载0.4% OGP的PLGA组材料周围较其他两组有更多的新骨生成（P<0.01）。此外组织学HE和Masson染色结果和以上结果类似。结论 负载OGP的静电纺丝PLGA支架有效模拟了体内细胞外基质,具有良好的生物相容性及促成骨分化能力,是一种具有潜在应用价值的新型骨组织工程支架。     

多孔β-磷酸三钙/胶原支架与犬牙周膜细胞三维复合体的构建

目的:探索用多孔β-磷酸三钙/胶原(β-TCP/col)支架与犬牙周膜细胞(PDLCs)在体外构建三维复合体.方法:分离培养犬PDLCs,并对其来源进行鉴定;利用甲基噻唑基四唑法检测β-TCP/col浸提液对PDLCs增殖的影响;并将第3代PDLCs以2×10⁵/mL的浓度接种于β-TCP/col支架上进行三维复合体的体外构建,用扫描电镜观察.结果:β-TCP/col浸提液对犬PDLCs增殖无不良影响;PDLCs可在材料的三维结构上贴附生长,细胞充分伸展,且表面可见明显分泌物. 结论:多孔β-磷酸三钙/胶原支架与犬牙周膜细胞具有良好的生物相容性,二者可在体外构建成三维复合体,提示该材料具有成为牙周组织工程理想支架材料的潜力.     

富血小板纤维蛋白(PRF)诱导骨髓间质干细胞分化成骨细胞的实验研究

目的研究富血小板纤维蛋白在诱导骨髓间质干细胞向成骨细胞转化的作用。方法取7天新西兰大白兔股骨,分离骨髓间质干细胞进行体外培养,在各自的培养条件下分为三组：实验组（不同剂量的PRF组）、空白对照组（MSCS组）和阳性对照组（BMP-2组）。三组细胞的比较采用MTT测定细胞增值率、PNPP法测定碱性磷酸酶的表达、免疫组化标记Ⅰ型胶原蛋白的表达、检测细胞为成骨细胞。结果细胞形态学观察,MSCS分化后,细胞形态从长梭形变成三角形,多角形,立方形;MTT测定细胞增殖显示,随着PRF膜剂量的增加,细胞增殖数量增加,PRF剂量为4,5mL时,与BMP-2组差别不大;ALP活性结果显示,MSCS分化后,ALP活性远高于MSCS细胞。两者差异具有显著统计学意义（t=24.608,p=0.000）;免疫组化标记Ⅰ型胶原结果显示,PRF组分化后的MSCSⅠ型胶原表达显著。结论富血小板纤维蛋白可以诱导骨髓间质干细胞分化为成骨细胞,分化的类成骨细胞具有成骨细胞的特性,可以作为自体材料应用于口腔种植学领域里骨缺的修复。     

Caspase-3表达强度评价齿科合金生物相容性的实验研究

目的利用凋亡相关因子caspase-3的表达强度分析其与齿科合金生物相容性的相关性。方法以银钯合金、镍铬合金、钴铬合金、自制2号合金的浸提液（每组样本量均为8个）体外培养小鼠成纤维细胞（L929）,以含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基作为阴性对照组。用5种液体分别培养L929细胞48h后,收集细胞,提取蛋白,染色后测定OD值,计算caspase-3活化度。结果各实验组Caspase-3活性比较有显著性差异（P〈0.01）。Caspase-3活化度大小,由高到低：钴铬合金组〉2号合金组〉银钯合金组〉镍铬合金组。结论各实验组细胞凋亡程度由高至低依次为：钴铬合金与2号合金〉银钯合金〉镍铬合金。凋亡相关因子Caspase-3在时间梯度的辅助下与微核试验、鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验、MTT法评价2号合金生物相容性结果一致。