以牛胶原凝胶为支架构建人工真皮的研究

目的：制备成纤维细胞胶原凝胶(即真皮替代物)，以研究细胞的生长、分化、增生及与真表皮问的相互作用，为研制大面积创面覆盖物——复合皮奠定基础。方法：①酶消化法培养胎儿成纤维细胞；②制备细胞胶原凝胶，分为Ca—gel和Cf-gel组，接种后于不同时间观察两组细胞的形态变化和胶原凝胶的收缩情况；③细胞计数；④SEM观测胶原凝胶的表面是否有成纤维细胞附着；⑤HE染色。结果：①成纤维细胞形态及增殖情况：成纤维细胞胶原凝胶形成后呈半透明状，可出现较明显的细胞增殖，并可见凝胶收缩现象，但Ca-gel组较小；人工真皮质地与颜色近似真皮组织，有一定的弹性和抗拉性，不易脆。②细胞计数法所得两组生长曲线基本相似。Ca-gel和Cf-gel组细胞均具有典型的细胞增殖现象，Cf-gel组细胞在后期的增殖略快于Ca-gel组。③扫描显微镜下可见到凝胶表面有梭形的成纤维细胞出现，且成纤维细胞紧密贴附于凝胶上。④HE染色可见胶原呈较均一的淡红色网状分布，成纤维细胞分布于胶原凝胶内部和表面。结论：①培养好的细胞凝胶称之为真皮替代物，是进行皮肤器官型培养和制作复合皮的关键与基础，并可与培养的人工表皮膜片混合移植，起到促进表皮细胞的生长黏附和加速创面愈合的作用。②成纤维细胞在胶原凝胶中有着活跃的生物学特性，因此在研究成纤维细胞在创面愈合中的生物学行为以及在皮肤组织工程学的研究中，以胶原凝胶为支架的三维培养系统较脱细胞基质系统更为科学。     

TGFβ通路介导的低剂量5-氨基酮戊酸光动力疗法重塑光老化皮肤真皮胶原

目的:探索低剂量ALA-PDT重塑光老化皮肤真皮胶原的作用机制。方法:采用transwell共培养体系,通过Western Blotting、ELISA实验检测角质形成细胞中的TGFβ1的表达和真皮成纤维细胞中TGFβ通路的活化,光镜下细胞数量观察和增殖细胞核抗原(PCNA)免疫荧光实验检测成纤维细胞增殖活力,小鼠活检取材检测Pp IX的分布和真皮胶原的组织学改变。结果:低剂量ALA-PDT可诱导角质形成细胞表达TGFβ1;与低剂量ALA-PDT处理后的角质形成细胞共培养可激活真皮成纤维细胞的TGFβ通路,促进其胶原合成和增殖;低剂量ALA-PDT可重塑光老化小鼠真皮胶原,且Pp IX主要分布在表皮。结论:低剂量ALA-PDT诱导表皮角质形成细胞释放TGFβ1,活化真皮成纤维细胞的TGFβ通路,重塑真皮胶原。     

混合表皮细胞与脱细胞真皮基质构建复合皮的移植和转归研究

探讨混合表皮细胞与脱细胞真皮体外构建的复合皮作创面移植后的转归。将BALB／c小鼠的表皮细胞和人表皮细胞按一定比例混合，种植于脱细胞真皮基质表面，经体外培养后形成复合皮，然后移植于BALB／c小鼠全层皮肤缺损创面，观察人表皮细胞的转归。结果显示，复合皮移植后可封闭创面，人表皮细胞多位于新生表皮上层，随时间延长，数量逐渐减少并最终被小鼠自体表皮细胞替代。提示两种不同的表皮细胞按一定比例混合培养构建复合皮可封闭全层皮肤缺损创面，可望节省自体皮源，缩短体外培养时间。     

应用人脐带血间充质干细胞修复小鼠皮肤缺损创面

目的 探讨人脐带血间充质干细胞(hUCB MSCs)在体分化为皮肤细胞、修复皮肤缺损创面的可能性. 方法 分离hUCB MSCs,体外培养、扩增并用BrdU标记后,种植于重症联合免疫缺陷(SCID)小鼠背部全层皮肤缺损创面(治疗组),并设同体PBS对照组.于术后7,14 d观察并比较愈合率;于术后7,14,28 d创面活检,行常规病理组织切片HE染色、免疫组织化学染色检测BrdU及人角蛋白19的表达. 结果 术后7,14 d治疗组创面愈合率为(56.06±3.04)%和(94.75±1.89)%,对照组为(36.99 ±2.17)%和(84.63 ±2.28)%,治疗组高于对照组(P＜0.01).HE染色显示治疗组活检组织表皮层明显增厚,细胞及表皮嵴数目显著增多;在再生表皮的毛囊内层以及表皮基底层、棘层可见BrdU阳性标记细胞连续分布,且有部分细胞表达人角蛋白19;并在治疗组活检组织中发现有皮肤附属器形成. 结论 hUCB MSCs可在体分化为皮肤细胞与组织,可应用于皮肤创面的修复.     

MEBT/ MEBO 对大鼠慢性难愈性皮肤溃疡创面肉芽组织EGF、EGFR 表达的影响

目的　探讨烧伤湿性医疗技术(MEBT/ MEBO) 及配套产品湿润烧伤膏(MEBO) 对大鼠慢性难愈性皮肤溃疡创面肉芽组织表皮生长因子(EGF)、表皮细胞生长因子受体(EGFR) 表达的影响。方法　SPF 级SD 雄性大鼠45 只, 参照付小兵大鼠慢性性皮肤溃疡创面模型制作方法制作模型, 成模后再采用随机数字法随机分为模型组(15 只)、MEBO 组(15 只)、贝复剂组(15 只), 造模后第2 天开始用药, 观察用药后各组创面愈合情况、肉芽组织生长情况, 记录创面愈合时间; 常规病理切片观察创面炎症、成纤维细胞数量、血管改变情况; 透射电镜观察成纤维细胞及其线粒体形态结构; 换药后第7、14 天取创面组织, 采用免疫组织化学法(SP法) 观察MEBO 对创面肉芽组织EGF、EGFR 表达的影响。结果　MEBO 组大鼠的创面愈合情况明显好于模型组与贝复济组; 创面愈合时间明显短于模型组及贝复济组(P <0． 05; P <0． 01); 病理学观察: MEBO 组与贝复剂组及模型组比较, 炎症反应轻、肉芽组织生长良好, 纤维增生程度低; 换药后第7、14 天, MEBO 组大鼠创面肉芽组织中EGF 和EGFR 蛋白表达阳性染色指数分别较模型组和贝复济组大鼠创面肉芽组织中EGF 和EGFR 蛋白表达阳性染色指数提高, 差异有统计学意义(P < 0． 05)。结论　MEBO 能增加慢性皮肤溃疡创面肉芽组织中EGF、EGFR 的表达量, 从而促进慢性皮肤溃疡愈合。     

合并全身放射损伤对皮肤伤口组织细胞的抑制效应及W11-a12的促愈作用

目的：研究全身放射损伤对皮肤伤口组织细胞的影响及W11－a12促愈作用。方法：小鼠6Gy照射后，于背部造成两个皮肤切口伤，观察伤后伤口截面愈合速度，伤口炎细胞，成纤维细胞和毛细血管数量及表皮细胞中碱性成纤维细胞生长因子含量的变化。结果：与单纯创伤组相比，照射后伤口截面愈合速度降低，伤口不同细胞数量均有抑制效应，但效应程度不同，由重到轻依次为炎细胞，血管内皮细胞，成纤维细胞和表皮细胞；表皮细胞中碱性成纤维细胞生长因子含量显著减少，W11－a12使伤口截中速度加快，细胞数量增加，并使表皮细胞中碱性成纤维细胞生长因子含量增加。结论：伤后伤口局部细胞数量减少和表皮细胞中碱性成纤维细胞生长因子含量下降是合并放射损伤后创面难愈的重要原因之一，W11－a12对伤口的细胞游走，增殖及表皮细胞分泌碱性成纤维细胞生长因子的功能具有促进作用。     

非培养皮肤细胞喷雾移植技术用于小型猪创伤修复的研究

目的 探讨非培养皮肤细胞结合喷雾移植技术用于小型猪全层皮肤损伤的修复治疗效果。方法 巴马小型猪背部两侧创建6个直径3 cm的全层皮肤切除创面,分生理盐水组、脱细胞猪真皮基质粉组（ADM组）、多点注射细胞治疗组（细胞注射组）和喷洒细胞治疗组（细胞喷洒组）进行治疗。术后连续监测实验动物的生理状况及创面愈合情况,切取创面组织进行HE染色和细胞角蛋白-10(CK10)、CK14及血管性血友病因子（VWF）免疫组织化学染色,评估创面皮肤损伤修复效果。结果 术后14 d开始,细胞喷洒组的愈合速度更快;21 d时,细胞喷洒组创面的新生皮肤和毛发等皮肤附属器产生。HE染色结果证明,细胞治疗促进皮肤再生,且细胞喷洒组修复效率更高、新生皮肤更薄、更均一。免疫组化结果证明,术后7 d开始,细胞喷洒组中CK10阳性新生皮肤组织更长,修复速度更快;修复后期,细胞喷洒组CK10/CK14阳性新生皮肤更平整光滑,实现了美学修复。另外,细胞喷洒组VWF阳性细胞出现的时间更早,数量更多,排列更规律整齐,证明其新生皮肤富含更多的血管和毛囊,实现了功能修复。结论 非培养皮肤细胞结合喷雾移植技术的应用显著提高了小型猪全层皮肤...     

毛囊真皮鞘细胞在皮肤创伤愈合中作用的实验研究

目的：通过体外培养毛囊真皮鞘细胞移植于大鼠皮肤创面的实验研究,探讨真皮鞘细胞在皮肤创伤愈合中的作用。方法：组织块法原代培养Wistar大鼠触须毛囊真皮鞘细胞,5-溴脱氧尿苷（BrdU）标记。Wistar大鼠22只,采用背部皮肤缺损模型,分细胞移植组和生理盐水对照组。术后3d、7d、14d、1个月和2个月取材,图像分析计算创面收缩率,免疫组化观察植入细胞在体内的转归,光镜和扫描电镜观察创面愈合病理过程。结果：术后各时间点细胞移植组创面收缩率均大于对照组（P〈0．01）;术后7d移植组新生肉芽组织中见不均匀分布的标记细胞,14d标记细胞减少并出现凋亡;移植组愈合过程中肉芽组织形成、表皮再生、胶原增生和组织改建均较对照组有所提前。结论：毛囊真皮鞘细胞在皮肤创伤修复过程中参与肉芽组织形成,具有加速创面收缩和促进愈合进程的作用。     

莪术油对紫外线辐射皮肤损伤的防护作用

目的 研究莪术油对中波紫外线所致皮肤损伤的防护作用及其机制.方法 建立UVB氧化损伤模型（照射30 d,累计28.38 J/cm^2）.观察皮肤外观及HE染色后表皮厚度和真皮成纤维细胞数量的变化.酶法检测皮肤匀浆上清液中抗氧化酶（过氧化氢酶CAT、谷胱甘肽GSH-Px和超氧化物歧化酶SOD）活性和丙二醛（MDA）含量及总抗氧化能力（T-AOC）.结果 ①光镜下,UVB照射组和基质空白组照射侧可见表皮增厚,真皮中成纤维细胞减少,而对照侧未见此病理变化;莪术油防护组照射侧表皮未见增厚,成纤维细胞数增多,但对照侧成纤维细胞数增多不明显.②UVB照射组和基质空白组照射侧皮肤中MDA含量明显升高,CAT、GSH-Px和SOD活性及T-AOC降低,而对照侧未见明显差异;莪术油防护组照射侧CAT、GSH-Px、SOD活性及T-AOC增强,MDA含量降低,而对照侧未见明显改变.结论 莪术油具有对UVB皮肤氧化损伤的防护作用,其作用机制可能与提高抗氧化酶含量及清除体内自由基有关.     

猪全层皮肤缺损创面新生上皮下肉芽组织的改建

目的　观察猪急性创面愈合过程中新生上皮下肉芽组织的改建过程及这种改建与以后可能形成的溃疡及瘢痕的关系。　方法　在 6只小型猪的背部各造成 8个直径为 4cm的圆形全层皮肤缺损创面。在创面形成后当日及 3,6 ,9,12 ,15 ,2 0 ,2 5 ,30 ,4 5d取创面及创面边缘的组织 ,进行HE染色、免疫组化染色和VanGieson苦味酸 -酸性品红染色 ,光镜下观察创面边缘新生上皮下和创面中心的总细胞数、成纤维细胞数、血管内皮细胞数和胶原纤维的含量及排列。　结果　创面愈合时间为 (2 9.3± 1.8)d ;伤后 9～ 2 5d ,创面边缘新生上皮下的总细胞数、成纤维细胞数和血管内皮细胞数较创面中心肉芽组织少 (P <0 .0 1) ;伤后 12～ 30d创面边缘新生上皮下的总细胞数和成纤维细胞数与创面愈合后 15d(伤后 4 5d)上皮下的细胞数比较 ,差异无显著性意义 (P>0 .0 1) ,创面边缘新生上皮下的胶原纤维的量和排列与创面愈合后 15d的上皮下相似。　结论在猪全层皮肤缺损创面愈合过程中 ,新生上皮下存在组织重建。     

真皮"生物模板"对创面愈合中肌成纤维细胞形成和凋亡的影响

目的　探讨真皮“生物模板”对创面愈合中成纤维细胞分化为肌成纤维细胞的干预作用和对细胞凋亡的影响。　方法　深度烧伤患者切痂后 ,创面分为两部分 ,即模板干预组和对照组。模板干预组创面应用真皮“生物模板”(异体J- 1型无细胞真皮基质 )并同时移植自体刃厚皮片 ,对照组创面则单纯移植自体刃厚皮片。分别于术后 2 ,4 ,6周取组织标本 ,每组每时相点分别取 6例次 ,共 36例次。应用脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记 (TUNEL)法和透射电镜观察的方法检测创面组织细胞凋亡 ;同时 ,以α -辅肌动蛋白 (SMA)免疫组化染色并结合透射电镜观察的方法检测肌成纤维细胞。　结果　真皮“生物模板”移植术后 2～ 6周 ,组织标本中表达α-SMA的成纤维细胞逐渐增多 ,但对照组表达量显著高于模板干预组 (P <0 .0 5 ) ;细胞凋亡计数随着创面愈合逐渐增加 ,模板干预组明显多于对照组 (P <0 .0 5 )。　结论　真皮“生物模板”与自体刃厚皮片复合移植后 ,可减少成纤维细胞向肌成纤维细胞分化 ,诱导创面局部细胞凋亡 ,从而减少创面收缩和减轻瘢痕增生。     

转EGF基因表皮细胞的生物学活性及移植实验

为探讨转表皮细胞生长因子(EGF）基因的人表皮细胞在体外培养条件下及移植后EGF的表达，于体外培养转EGF基因的人表皮细胞，采用ELISA法测定不同培养时间及不同传代数时培养上清中EGF的含量。然后将转基因的人表皮细胞种植于无细胞真皮替代物表面，于体外培养后形成复合皮，移植于裸鼠全层皮肤缺损创面，移植后3周以抗EGF抗体免疫组化染色观察移植后EGF的表达。结果显示，转EGF基因表皮细胞传至第5代仍可分泌EGF，达pg级水平；含转基因表皮细胞的复合皮移植后1—3周、抗EGF染色阳性。提示转EGF基因表皮细胞在体内与体外均可稳定地表达外源基因产物，可望应用于组织工程皮肤的构建。     

小鼠烧伤应激影响鼠尾皮肤增殖和角化的形态学观察

目的观察烧伤应激对小鼠鼠尾皮肤的影响,探索应激在银屑病发病中作用。方法在鼠背制作2cm×1cm的烧伤创面,于烧伤后1h、24h、1w、2w、4w分别取鼠尾皮肤观察表皮的增殖和角化情况。结果与正常小鼠鼠尾皮肤对照,烧伤应激后1w、2w、4w,鼠尾皮肤角质形成细胞(KC)明显增殖,角化过度和角化不良,4w时最明显。结论烧伤应激可促进小鼠鼠尾皮肤KC增殖、角化过度和角化不全。     

皮肤类器官构建策略的研究进展

严重创伤致大面积皮肤缺损发生率高、危害大、治疗困难、预后较差, 不仅严重影响患者生活质量, 甚至威胁其生命, 是临床常见难题。大面积皮肤缺损难以自愈, 主要采用皮肤移植等方法进行治疗。自体皮瓣移植来源有限, 会对患者造成二次损伤;人工皮肤机械完整性差、无法整合, 会形成瘢痕, 同时也有免疫排斥的风险。皮肤类器官技术能够高度模拟人体皮肤组织及功能, 在一定程度上可以弥补目前创面治疗上的不足, 为大面积皮肤缺损患者的治疗提供新方法。目前, 皮肤类器官的构建方法相对较为成熟, 但现有皮肤类器官的结构和功能相对较为单一, 与真实的人体皮肤相比还有较大差距, 每种构建方法各有利弊, 具体哪种构建方法最佳尚无定论。因此, 笔者从类器官与皮肤类器官技术及皮肤类器官的构建方法两方面对皮肤类器官构建策略的研究进展进行综述, 为构建结构及功能更为复杂的皮肤类器官提供参考。     

银屑病患者血清促进皮肤成纤维细胞增生的实验研究

进行期寻常型银屑病患者混合血清以5%的比例加入培养基中,作用于体外培养的正常人皮肤成纤维细胞.结果发现,对该细胞的增生具有明显的促进作用.提示银屑病不仅是表皮细胞的异常增生,真皮成纤维细胞的异常和系统性因素在其病理生理方面也占有重要地位.     

复方壳多糖皮肤替代物的制备

组织工程人工皮肤为各种原因所致的皮肤缺损提供了新选择 ,在国外已有多种商品化产品出售并用于临床[1 ] ,国内也有数家单位正致力于该领域的研究开发。现将笔者制作的复方壳多糖人工皮肤报告如下。一、材料与方法1 .细胞分离和培养 :所需细胞源于重庆市儿童医院提供的 10岁以下健康儿童包皮。制备角质形成细胞单细胞悬液 :4℃ 2 .5ｇ Ｌ胰蛋白酶消化去除皮下组织的包皮 18ｈ。分离真表皮后 ,收集吹散的表皮角质形成细胞并用刀背轻刮真皮面所释放的基底细胞 ,过筛 ,离心 ,加含表皮生长因子 (ＥＧＦ) 10 μｇ Ｌ、中性可溶性生物合成胰岛素 1…     

人工胶原膜对大鼠皮肤创伤促愈作用的研究

目的：观察人工胶原膜（代号rackderm)对皮肤创伤创面的作用及其机制,为进一步将其作为人工皮肤支架提供试验依据。方法：扫描电镜观察rackderm的表面结构,应用图像分析技术测量孔径大小;制备动物背部创伤模型,分别应用人工胶原膜和油纱布包扎创面,分阶段取材后,宏观观察伤口愈合情况,并应用病理学手段,结合图像分析观察rackderm的生物学作用。结果：扫描电镜显示rackderm为多孔结构,孔径介于20－40μm,允许成纤维细胞和毛细血管的长入;宏观观察rackderm组伤口愈合时间明显早于油纱布组,组织学观察显示该组肉芽组织含量明显多于油纱布组,免疫组织化学染色显示促进伤口愈合的生长因子在该组表达明显增强。结论：rackderm初步满足作为人工皮肤支架的物理条件,作为人工敷料,对创伤后造成的皮肤缺损,具有促进伤口愈合的作用。     

人类能自我复制皮肤

表皮和真皮全部损伤和浅Ⅲ度全厚度烧伤可以白皮下组织细胞转化为皮肤干细胞进行原位培植,生成各种组织进而组合,实现皮肤器官的修复和再生。 长期以来,面对烧伤这个人类健康的大敌,治疗上始终没有脱离外科手术的模式,如干燥创面以防感染、尽快切除烧伤皮肤植皮以封闭创面等,从而导致烧伤创面病理性修复。这样虽然挽救了许多大面积烧伤患者的生命,但同时遗留下许多瘢痕、畸形、毁容、残废,患者虽然存活下来,但生活质量低下,造成终身痛苦。 迄今,烧伤外科治疗技术对于诸如疼痛、进行性坏死、感染、非全厚皮肤烧伤瘢痕愈合等许多问…     

39例芥子气皮肤损伤3年随访报告

目的 观察早期使用表皮细胞生长因子治疗、创面早期切痂植皮对芥子气皮肤损伤的疗效.方法 39例芥子气皮肤损伤患者随访3年,对皮肤愈合情况进行评估.结果 随访患者皮肤愈合良好,但遗留色素沉着,局部复发少.主诉皮肤损伤部位出现瘙痒、感觉异常较多,皮肤损伤后遗症目前尚难以预测.结论 早期使用表皮细胞生长因子、创面早期切痂植皮治疗芥子气皮肤损伤对创面愈合、改善预后有明显的效果.     

组织张力对组织胶原排列结构的影响

目的 研究组织张力的变化对胶原排列结构的影响,探讨组织结构和力学性质的关系. 方法 通过倒置相差显微镜、HE染色及透射电镜观察三种不同张力的胶原凝胶中成纤维细胞(fibroblast,Fb)的细胞形态、走行方向及胶原的排列结构;免疫荧光检测Fb中α平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)的表达及排布. 结果 倒置相差显微镜、HE染色及透射电镜观察发现,单层培养基质(monolayer gels,MG)及锚着基质(anchored gels,AG)张力高,张力分布各向异性,Fb呈长梭形,极性明显,胶原纤维沿细胞长轴平行排列,尤以MG更为明显;游离基质(floating gels,FG)张力低,张力分布各向同性,Fb为多角形或星形,胶原纤维呈网状排列;免疫荧光检测显示,MG及锚着基质中Fb表达大量沿细胞长轴排列的α-SMA,尤以MG明显,游离基质中Fb少有α-SMA表达.MG及锚着基质中Fb细胞形态、走行方向、α-SMA的表达及胶原的排列结构近似于肉芽组织,游离基质则近似于正常皮肤组织或重塑完成后的创面组织. 结论 皮组织的组织结构与组织的力学性质是相对应的,组织的排列结构是组织力学性质的体现,两者是不可截然分开的.