大肠杆菌脂多糖影响Toll样受体4在人牙髓细胞的表达

目的:探讨大肠杆菌脂多糖(lippolysacchaide,LPS)对体外培养的人牙髓细胞(human dental pulp cells,HDPCs)Toll样受体4(Toll-likereceptor4,TLR4)表达的影响及TLR4在LPS对牙髓细胞激活中的作用。方法:以大肠杆菌LPS刺激体外培养的人牙髓细胞,运用实时荧光定量RT-PCR和免疫荧光技术分别检测牙髓细胞TLR4mRNA和蛋白的表达。利用抗体阻断和ELISA方法观察TLR4在LPS激活牙髓细胞释放IL-1β中的作用。结果:正常牙髓细胞不表达TLR4,1×10-4g/L大肠杆菌LPS作用HDPCs6、12、24h后均可见TLR4在胞膜/胞质的表达,胞核并不表达TLR4。FQRT-PCR结果表明LPS能明显上调牙髓细胞TLR4mRNA的表达(P<0.001),并具有LPS浓度依赖性。抗体阻断和ELISA结果证实LPS能激活牙髓细胞释放IL-1β(P<0.01),抗TLR4单抗能明显抑制LPS对HDPCs的激活(P<0.05)。结论:正常人牙髓细胞不表达TLR4,大肠杆菌LPS能诱导牙髓细胞表达TLR4mRNA和蛋白。TLR4介导了LPS对牙髓细胞的活化,在LPS对牙髓细胞激活效应中具有重要作用。     

IGF-1通过PI3K/AKT信号通路促进牙髓细胞增殖及碱性磷酸酶活性的研究

目的:研究IGF-1对牙髓细胞增殖和碱性磷酸酶(ALP)活性及PI3K/AKT信号通路的影响。方法:采用酶消化法分离培养原代人牙髓细胞。Western blot检测牙髓组织中IGF-1蛋白表达,不同浓度的IGF-1处理牙髓细胞7d,CCK8法检测细胞增殖。用IGF-1(100 μg/L)及LY294002(10 μmol/L)分别单独或同时处理牙髓细胞,培养7 d后MTT实验检测细胞增殖;在培养第3、5、7、14天时检测细胞ALP 活性;在培养第7天时用Western blot检测AKT和p-AKT蛋白表达情况。结果:IGF-1在牙髓炎组织中低表达, IGF-1在20~100 μg/L浓度范围内从作用第3天开始能够显著促进牙髓细胞增殖(P<0.05或P<0.01),且具有剂量和时间依赖效应。LY294002能够抑制牙髓细胞的增殖和碱性磷酸酶活性,具有时间依赖性。IGF-1能促进p-AKT蛋白表达,而 LY294002能减低IGF-1对p-AKT蛋白表达的促进作用。结论:IGF-1可以促进牙髓细胞增殖和碱性磷酸酶活性,且具有浓度和时间依赖性,作用机制可能与PI3K/AKT信号通路相关。[关键词] 牙髓细胞 细胞增殖 碱性磷酸酶     

牙髓卟啉单胞菌脂多糖诱导小鼠成骨细胞表达白细胞介素-23

目的：探讨牙髓卟啉单胞菌（P．e）脂多糖（LPS）对小鼠成骨细胞 IL-23mRNA 和蛋白表达的影响,以及磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）信号通路是否参与了该过程。方法：采用 real-time PCR 和 Western blot 法检测 P．e LPS 诱导 MC3T3-E1细胞表达IL-23mRNA 和蛋白的情况,以及用 PI3K 信号通路抑制剂 LY294002预处理细胞后,IL-23mRNA 和蛋白表达的变化。结果：P．e LPS 刺激 MC3T3-E1细胞后,IL-23mRNA 的表达增加具有浓度依赖性和时间依赖性（P ＜0．05）,IL-23蛋白的表达增加具有时间依赖性（P ＜0．05）;LY294002预处理细胞后,P．e LPS 诱导的 IL-23mRNA 和蛋白的表达均显著降低（P ＜0．05）。结论：P．e LPS 能诱导小鼠成骨细胞表达 IL-23mRNA 和蛋白,PI3K 信号通路可能参与了此过程。     

脂磷壁酸诱导根尖骨吸收调控蛋白的表达

目的研究难治性根尖周炎重要病原菌粪肠球菌脂磷壁酸对骨吸收核心调控系统,核因子κB受体活化因子配体(RANKL)和骨保护素(OPG)蛋白表达的影响。方法采用甲基噻唑基四唑(MTT)法检测0.1、1.0、10.0、20.0mg/L脂磷壁酸作用24、48、72h后对人牙周膜成纤维细胞(HPDLFs)增殖的影响。细胞免疫荧光和蛋白免疫印迹法检测脂磷壁酸刺激HPDLFs 24h后RANKL、OPG表达水平及RANKL/OPG值的变化。结果脂磷壁酸抑制HPDLFs增殖具有浓度和时间依赖性。10.0mg/L脂磷壁酸刺激24h后,HPDLFs中RANKL、OPG蛋白表达均增加,RANKL的增长速度较OPG快,脂磷壁酸上调RANKL/OPG值具有浓度依赖性,高浓度组明显大于对照组(P<0.05)。结论脂磷壁酸对牙周膜成纤维细胞增殖具有抑制作用,可上调细胞RANKL、OPG表达及RANKL/OPG值,推测其在难治性根尖周炎骨吸收中扮演重要作用。     

谷氧还蛋白在牙龈卟啉单胞菌脂多糖诱导脐静脉内皮细胞氧化应激中的作用

目的 从基因和蛋白水平研究谷氧还蛋白（Grx）在牙龈卟啉单胞菌脂多糖（LPS）诱导脐静脉内皮细胞（EA-hy926细胞）时的表达变化及其对Akt通路的调控作用。方法 采用牙龈卟啉单胞菌的LPS（1 000 ng·mL^-1）对EA-hy926细胞进行不同时间段（4、12、18、24 h）的刺激诱导,采用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应检测细胞grx1基因的表达变化;然后加入Grx特异性抑制剂氯化亚硝脲（BCNU）,使用Western blot法检测对照组、LPS组（1 000 ng·mL^-1LPS刺激12 h）和BCNU组（25 μmol·mL^-1BCNU预处理30 min+1 000 ng·mL^-1LPS刺激12 h）的Grx、Akt、磷酸化Akt蛋白的表达情况。结果 LPS诱导下,EA-hy926细胞的grx1基因表达量在各个时间段均上调,12 h时grx1表达量最高。LPS诱导12 h时,LPS组的Grx蛋白表达量较对照组明显升高（P<0.05）,而BCNU可有效抑制Grx蛋白的表达（P<0.05）;Akt蛋白表达量在各组间无明显差异（P>0.05）,而LPS组的磷酸化Akt活性升高,显著高于对照组和BCNU组（P<0.05）,与Grx蛋白的表达趋势一致。结论 LPS可以从基因和蛋白水平诱导Grx的表达;Grx是Akt的潜在调节因子,可能对LPS刺激下Akt的调控具有重要意义。     

脂多糖上调人牙髓细胞B细胞淋巴瘤-2蛋白及其相关X蛋白的表达

目的：探讨脂多糖（LPS）作用于人牙髓细胞后,B细胞淋巴瘤-2（Bc1-2）蛋白、Bcl-2相关X蛋白（Bax）在正常人牙髓和炎症牙髓中的表达,探讨其在牙髓炎症过程中的作用机制。方法在体外用不同质量浓度LPS刺激人牙髓细胞后,采用免疫细胞化学染色方法在不同的时间点检测Bcl-2、Bax的表达,用图像分析系统Simple?PCI?version?5.1分析。结果正常人牙髓细胞中Bcl-2、Bax表达量不高,而在牙髓炎症过程中两者均增强,但是随着LPS质量浓度的增加,Bcl-2的表达量开始下降,而Bax的表达则持续增强。结论内毒素能使人牙髓细胞膜上的Bcl-2、Bax表达增强,但Bax的表达强于Bcl-2,内毒素可能通过两者介导的信号传导途径引起细胞凋亡。     

神经调节蛋白1对2型糖尿病小鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的影响

目的 探讨神经调节蛋白1(Nrg1)对糖尿病小鼠骨髓干细胞（BMSCs）成骨分化的影响及其信号机制。方法 将C57小鼠BMSCs分为4组,对照组（普通小鼠BMSCs;Vehicle）,Nrg1干预普通小鼠BMSCs组（Vehicle+Nrg1）,糖尿病小鼠BMSCs组（DM）和Nrg1干预糖尿病小鼠BMSCs组（DM+Nrg1）。MTT法检测BMSCs的增殖活性。成骨诱导培养后,碱性磷酸酶（ALP）半定量试剂盒检测BMSCs的成骨活性,Western blot检测成骨相关蛋白ALP、OCN的表达及PI3K、Akt的磷酸化水平。结果 与Vehicle组相比,DM组成骨分化显著降低（P<0.05）。而Nrg1干预能提高糖尿病小鼠BMSCs的增殖活性,增强ALP活性,促进ALP和OCN的蛋白表达,显著提高PI3K和Akt的磷酸化水平（P<0.05）。结论 Nrg1能促进糖尿病小鼠BMSCs成骨分化,PI3K/Akt信号通路可能是其作用机制。     

低分子釉原蛋白的纯化及其对人牙髓细胞和牙周膜细胞作用的研究

目的：纯化低分子猪釉原蛋白（LMWPA）,并观察其对人牙髓细胞（HDPCs）和牙周膜细胞（HPLCs）增殖及碱性磷酸酶（ALP）活性的影响。方法：取六月龄猪第二磨牙牙胚牙釉质,用液相色谱法分离纯化LMWPA,分别采用MTT法和酶动力学方法测定LMWPA对HDPCs和HPLCs的体外作用。结果：得到的LMWPA是分子量约为5.0KDa的单一组分;在50和100μg/mL时,能的显著促进HDPCs和HPLCs的增殖,ALP活性上调（P〈0.01）;而在≥150μg/mL时,能显著抑制细胞的增殖,ALP活性下调（P〈0.01）。结论：LMWPA影响HDPCs和HPLCs的增殖和碱性磷酸酶活性,并存在剂量和时间依赖性。     

脂多糖和转化生长因子-β1对牙髓细胞Toll样受体4的表达及信号通路的影响

目的研究牙髓炎症过程中,在促炎因子脂多糖（LPS）和抑炎因子转化生长因子-β1（TGF-β1）同时存在的情况下,牙髓细胞表面Toll样受体4（TLR4）的表达水平及相关信号分子的变化情况。方法LPS、TGF-β1作用于体外培养的牙髓细胞,用流式细胞术检测牙髓细胞表面TLR4的表达;实时荧光定量聚合酶链反应（real-time PCR）、Westernblot方法检测相关信号分子的表达水平,包括进化保守的Toll信号中介分子（ECSIT）和核转录因子-κB（NF-κB）;酶联免疫吸附试验（ELISA）检测前炎症因子白细胞介素-6（IL-6）的分泌水平;然后进一步通过real-time PCR法检测临床炎症牙髓组织中相应指标的变化。结果体外培养的牙髓细胞在LPS、TGF-β1共同作用下,细胞表面TLR4的表达水平没有明显变化,但是IL-6分泌增加,ECSIT表达增加,NF-κB入核增加。临床标本的real-time PCR结果表明：炎症状态下的牙髓组织中TGF-β1 mRNA表达增加,TLR4 mRNA表达没有明显变化,ECSIT及IL-6 mRNA表达增加。结论牙髓炎症发展过程中,虽然牙髓组织中TGF-β1表达增加,抑制细胞表面TLR4的表达,但TLR4的信号通路仍然被活化,主要机制可能是LPS引起信号分子ECSIT的活化,从而抑制TGF-β1信号通路的活化。     

粪肠球菌脂磷壁酸对人牙周膜成纤维细胞表达Toll样受体2及白细胞介素-1β的影响

目的探讨体外培养的人牙周膜成纤维细胞（HPDLCs）在粪肠球菌脂磷壁酸（LTA）刺激下表达Toll样受体2（TLR2）及白细胞介素-1β（IL-1β）的情况。方法体外分离培养HPDLCs,采用流式细胞术检测0.1、1、10 μg·mL-1粪肠球菌LTA刺激24 h后HPDLCs表面TLR2表达的改变,酶联免疫吸附法检测12、24、48 h后IL-1β的分泌情况,并用相同质量浓度的大肠杆菌内毒素作为对照;用TLR2中和抗体预处理HPDLCs 1 h,观察1 μg·mL-1 LTA刺激24 h后其IL-1β的分泌量。结果LTA可致HPDLCs表面TLR2表达增加（P<0.05）;与对照组相比,粪肠球菌LTA可致HPDLCs分 泌IL-1β增加（P<0.05）,刺激12 h后可检测到IL-1β,48 h内呈上升趋势。TLR2中和抗体对粪肠球菌LTA诱导HPDLCs 分泌IL-1β无明显封闭作用。结论粪肠球菌LTA可引起HPDLCs表面TLR2表达及IL-1β分泌增加。     

Different roles of odontoblasts and fibroblasts in immunity

Odontoblasts and fibroblasts are suspected to influence the innate immune response triggered in the dental pulp by micro-organisms that progressively invade the human tooth during the caries process. To determine whether they differ in their responses to oral pathogens, we performed a systematic comparative analysis of odontoblast-like cell and pulp fibroblast responses to TLR2-, TLR3-, and TLR4-specific agonists (lipoteichoic acid [LTA], double-stranded RNA, and lipopolysaccharide [LPS], respectively). Cells responded to these agonists by differential up-regulation of chemokine gene expression. CXCL2 and CXCL10 were thus increased by LTA only in odontoblast-like cells, while LPS increased CCL7, CCL26, and CXCL11 only in fibroblasts. Supernatants of stimulated cultures increased migration of immature dendritic cells compared with controls, odontoblast-like cells being more potent attractants than fibroblasts. Analysis of these data suggests that odontoblasts and pulp fibroblasts differ in their innate immune responses to oral micro-organisms that invade the pulp tissue.     

内毒素刺激单核细胞培养上清对人牙髓细胞碱性磷酸酶活性的影响

目的:观察经内毒素脂多糖(LPS)刺激的单核细胞培养上清对人牙髓细胞碱性磷酸酶(ALP)活性的影响,探讨单核细胞介导下LPS和CD14在人牙髓细胞分化中的作用.方法:采用经具核梭杆菌LPS刺激的单核细胞培养上清作用于体外培养的人牙髓细胞,通过OD值测定,观察单核细胞培养上清对人牙髓成纤维细胞碱性磷酸酶(ALP)活性的影响.结果:LPS直接刺激人牙髓细胞,牙髓细胞ALP活性明显上升,但LPS刺激的单核细胞培养上清对人牙髓细胞ALP活性有明显的抑制作用.抗CD14抗体在有血清的条件下作用于单核细胞,可以阻断单核细胞介导下LPS对牙髓细胞ALP活性的抑制.结论:单核细胞介导的LPS对牙髓细胞ALP活性有抑制作用,其机制可能依赖CD14.     

IL-1ra对Fn LPS诱导人牙髓细胞合成IL-1β的拮抗作用

目的观察人重组白细胞介素1受体拮抗剂(IL-1ra)对内毒素脂多糖（LPS）刺激的人牙髓细胞分泌IL-1β的拮抗作用。方法用ELISA夹心法检测IL-1β含量。结果人牙髓细胞经LPS刺激后,IL-1β含量明显增加。当加入高浓度的IL-1ra后,IL-1β含量与对照组相比有显著性降低,在LPS刺激牙髓细胞60分钟以前加入一定浓度的IL-1ra,牙髓细胞培养上清液中IL-1β的含量显著降低,但在90分钟以后再加入IL-1ra,则IL-1β的含量无明显变化。结论高剂量的IL-1ra能够抑制LPS刺激的牙髓细胞分泌IL-1β,从而拮抗IL-1的生物学活性。     

Influence of HEMA on LPS- and LTA-stimulated IL-6 release from human dental pulp cells

ObjectiveDental pulp cells interact with immunogenic components such as LPS (lipopolysaccharide) or LTA (lipoteichoic acid) released from microorganisms in carious lesions. In the present investigation, the formation of the pro-inflammatory cytokines TNFα and IL-6 in LPS- or LTA-stimulated cells from the dental pulp interface and pulp fibroblasts was analyzed in the presence of the resin monomer 2-hydroxyethyl methacrylate (HEMA) under varying cellular redox conditions.MethodHuman pulp fibroblasts (HPC) or cells from the dental pulp interface expressing an odontoblast phenotype (hOD-1) were exposed to LTA, LPS or HEMA for 1 h or 24 h. Redox homeostasis was modified by the prooxidant BSO (L-buthionine sulfoximine) or the antioxidant NAC (N-acetyl cysteine). Formation of TNFα or IL-6 was analyzed by ELISA, and cell survival was determined by a crystal violet assay. Statistical analyses were performed using the Mann-Whitney-U-test.ResultsSecretion of TNFα was not detected in LPS- or LTA-stimulated HPC or hOD-1, and IL-6 was not found after a short exposure (1 h). After a 24 h exposure, LPS induced a 3-fold increase in IL-6 formation in HPC, while LTA stimulated IL-6 release about 20-fold. Likewise, LTA was more effective than LPS in hOD-1 stimulating IL-6 levels about 50-fold. HEMA inhibited the LPS- and LTA-induced IL-6 release, and this effect was enhanced by BSO but counteracted by NAC in both cell types. IL-6 release was independent of cell survival rates.ConclusionsThe protective immune response in odontoblasts and pulp fibroblasts is impaired by monomers such as HEMA through the disturbance of the redox homeostasis.     

脂多糖信号受体CD14、TLR4在人牙髓组织和牙髓成纤维细胞中的表达

目的研究人牙髓组织和牙髓成纤维细胞中脂多糖（LPS）信号受体CD14、TLR4的表达特点,探讨牙髓炎症组织中LPS的信号转导途径.方法采用免疫组化染色法观察健康和炎症牙髓组织中CD14、TLR4的表达情况;应用直接免疫荧光标记法,采用流式细胞术检测体外培养人牙髓成纤维细胞在LPS刺激前后的CD14、TLR4阳性细胞率和细胞表面平均荧光强度.结果正常牙髓组织中未见CD14、TLR4阳性细胞;炎症牙髓组织中可见大量CD14、TLR4阳性细胞,CD14、TLR4阳性细胞率差异无统计学意义（P＞0.05）.牙髓成纤维细胞经LPS刺激后,TLR4平均荧光表达强度和TLR4阳性细胞率均显著增高（P＜0.05）,而CD14在LPS刺激前、后均无表达.结论炎症牙髓组织中CD14、TLR4的阳性表达,提示LPS可能通过CD14、TLR4信号受体在牙髓炎症组织中发挥作用,而牙髓成纤维细胞在LPS刺激后仅表达TLR4,表明LPS可能通过TLR4对牙髓成纤维细胞发挥作用.     

碱性成纤维细胞因子在人牙髓损伤修复过程中的表达

目的研究不同状态人牙髓组织中碱性成纤维细胞因子（b FGF）的表达特点,以及大肠杆菌脂多糖（LPS）刺激后人牙髓细胞（h DPC）中b FGF的表达水平,探讨b FGF在牙髓损伤修复过程中的可能作用。方法采用实时荧光定量聚合酶链反应（PCR）和免疫蛋白印迹方法（Western blot）分别检测正常、深龋及牙髓炎牙髓组织中b FGF m RNA和蛋白表达情况。实时荧光定量PCR测定1 mg/L LPS刺激h DPC 6、12、24、48 h后b FGF和热休克蛋白70（HSP70）表达水平的变化;Western blot和细胞免疫荧光染色检测LPS刺激h DPC后b FGF蛋白表达变化。结果实时荧光定量PCR和Western blot结果表明,深龋牙髓组织中b FGF水平显著上调,而正常和牙髓炎牙髓组织中b FGF表达无差异。实时荧光定量PCR检测到LPS刺激h DPC后,b FGF和HSP70 m RNA水平同步上调,在12 h达峰值;Western blot显示,LPS刺激h DPCs 12、24、48 h后b FGF蛋白表达水平均高于正常h DPC;细胞免疫荧光染色证实,LPS刺激12 h后h DPC中b FGF呈强阳性表达,而正常h DPC中b FGF呈弱阳性表达。结论 b FGF在深龋牙髓组织中高表达,且LPS刺激早期可上调h DPC内b FGF表达,推测b FGF可能参与牙髓组织防御修复反应,可能是细胞抗损伤的重要调节机制之一。     

DKK1对脂多糖感染人牙髓细胞生物学行为的影响

目的:研究DKK1对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)感染人牙髓细胞生物学行为的影响.方法:使用改良酶组织块法分离培养人牙髓细胞并通过免疫荧光染色鉴定细胞来源;通过细胞计数试剂盒(CCK-8)、Transwell实验、茜素红染色、荧光定量PCR等实验检测DKK1对LPS感染人牙髓细胞的生物学行为的变...     

Integrin expression in human dental pulp cells and their role in cell attachment on extracellular matrix proteins

Integrins are a family of heterodimeric glycoproteins consisting of alpha and beta subunits that noncovalently interact to form cell surface adhesion receptors. The objective of this study was to identify integrins in human dental pulp cells and determine their role in human dental pulp cell attachment to the biological active molecules, laminin and fibronectin. Integrin expression was studied by immunoblot and immunoprecipitation using monoclonal integrin antibodies. The role of integrin in human dental pulp cell adhesion on laminin and fibronectin was determined by inhibition of cell adhesion with those antibodies. This study found human dental pulp cells expressed alpha 1, alpha 3, alpha 5, alpha 6, alpha v, and beta 1 integrin subunits. The adhesion of human dental pulp cells to laminin and fibronectin was not inhibited by monoclonal antibody to any subunit, except that anti-beta 1 antibody inhibited pulp cells adhesion on laminin. These data provide information for further studying the role of integrins in dental pulp cell biological function.     

人β防御素在牙髓组织中的表达及与炎症因子的关系

目的:探索人β-防御素(humanβ-defensin,HBD)家族成员在人牙髓组织中的表达,以HBD2为代表,探讨HBD在牙髓炎症反应中所受调控及HBD家族成员之间的调节关系.方法:在NCBI GEO Profiles数据库中检索HBD在人牙髓组织中表达的基因芯片信息,并运用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)进行验证.运用4种炎症因子TNF-α、IL-1 α、IL-1β和IL-6不同组合刺激人牙髓细胞,采用实时荧光定量核酸扩增检测法(qPCR)检测相应组分对HBD2表达水平的影响;HBD110预处理及LPS刺激牙髓细胞后,采用qPCR方法检测TNF-α、IL-1α和HBD2的表达水平.采用GraphPad Prism5.01对实验组和对照组的结果进行统计学分析.结果:在NCBI GEO Profiles数据库中检索到27种HBD家族成员在人牙髓组织中表达.TNF-α、IL-1α、IL-1β和IL-6联合作用,可显著提升HBD2的表达水平.HBD110通过调控TNF-α和IL-1α的表达,提高HBD2的表达水平.结论:除已有报道的HBD1、HBD2、HBD3和HBD4外,其他HBD家族成员在人牙髓组织中表达,且HBD2在牙髓组织中受炎症因子及其他HBD家族成员的调控.