高效小鼠CD40siRNA基因片段的筛选及对淋巴细胞CD40基因表达的影响

目的: 应用RNA干扰技术筛选高效小鼠CD40siRNA基因序列片段.方法: 体外化学合成小鼠CD40基因为靶标的siRNA 3对(siCD40-1、siCD40-2、siCD40-3),通过脂质体瞬时转染小鼠脾淋巴细胞(实验组),并分别以转染无关siRNA片段及未转染细胞作为对照(对照组).分别采用流式细胞术、实时荧光定量PCR检测转染24 h细胞表面CD40抗原、CD40 mRNA表达,蛋白质印迹检测转染48 h蛋白表达的变化.结果: 与对照组相比,实验组CD40抗原表达、CD40 mRNA及蛋白表达明显下降(P<0.01);3对实验组siRNA能明显抑制CD40基因表达,抑制率分别为69%、78%和41%,差异有统计学意义(P< 0.05).而各对照组之间比较差异无统计学意义(P>0.05).结论: siRNA可抑制小鼠淋巴细胞表达CD40,并具有良好的特异性,其中siRNA-2为最高效干扰片段.     

RNA干扰抑制胰岛素样生长因子-1表达并诱导胶质瘤细胞凋亡

目的研究RNA干扰效应对胶质瘤C_6细胞株胰岛素样生长因子-1(IGF-1)基因表达的抑制作用及其对C_6细胞凋亡诱导的作用。方法体外化学合成靶向IGF-1基因的小干扰RNA(siRNA),采用脂质体法将siRNA以不同浓度梯度转染C_6细胞株,设非特异的siRNA阳性对照组和未转染siRNA的阴性对照组；同时使用绿色荧光素标记的siRNA异硫氰酸荧光素(FITC)-siRNA转染细胞,于荧光显微镜下观察siRNA转染效率；逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)半定量检测siRNA对IGF-1基因表达的抑制作用；流式细胞术检测siRNA诱导细胞凋亡作用。结果荧光显微镜下荧光素标记的siRNA转染组可见到细胞内清晰的绿色荧光,脂质体Oligo- fectamine~(TM)2000的转染效率可＞95%；化学合成的siRNA明显抑制IGF-1 mRNA的表达,各特异性siRNA不同浓度转染组IGF-1 mRNA表达水平可下调约40%～70%,流式细胞术检测转染IGF1-siRNA细胞凋亡率为14．14%,明显高于对照组的0．95%。结论在细胞水平上,化学合成的靶向IGF-1的siRNA可明显抑制IGF-1基因的表达,引致胶质瘤细胞凋亡率明显上升,为进一步利用RNA干扰进行胶质瘤的基因治疗研究奠定基础。     

HDAC2 siRNA转染对人胰腺癌细胞增殖及凋亡的影响

［摘要］目的: 探讨RNA干扰沉默组蛋白去乙酰化酶2(histone deacetylase 2,HDAC2)基因表达对人胰腺癌细胞增殖和凋亡的影响。方法: 培养人胰腺癌PaTu8988细胞株,并将其随机分为5组:空白对照组,20 nmol／L HDAC2 siRNA阴性组,40 nmol／L HDAC2 siRNA阴性组,20 nmol／L HDAC2 siRNA组,40 nmol／L HDAC2 siRNA组。合成针对HDAC2基因的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA),利用阳离子脂质体将HDAC2 siRNA瞬时转染人胰腺癌PaTu8988细胞,分别采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和蛋白质印迹法检测HDAC2基因及蛋白的表达;MTT比色法检测细胞的增殖率;流式细胞术测定细胞凋亡率。结果: 与空白对照组和阴性siRNA 组对比,HDAC2 siRNA组的HDAC2基因和蛋白的表达水平均明显下降(P均<0.05),细胞增殖率减慢(P<0.01),凋亡率明显升高(P<0.01)。结论: 采用RNA干扰沉默人胰腺癌细胞HDAC2基因表达,可抑制癌细胞增殖和诱导其凋亡。     

JEV和EV71感染SH-SY5Y细胞内吞途径的初步研究

目的初步探讨乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)和肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)感染人神经细胞的内吞途径机制。方法通过蛋白酶K实验检测JEV和EV71感染人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞的入侵速率。采用MTT法检测针对不同内吞途径关键分子的小干扰RNA(small interfering RNA,si RNA)以及化学抑制剂对SH-SY5Y细胞的细胞毒性。用JEV和EV71感染si RNA或化学抑制剂预处理的SH-SY5Y细胞,荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,q RT-PCR)检测不同处理对两种病毒m RNA和靶蛋白表达的影响。结果确定针对网格蛋白重链的si RNA(si CHC)最高工作浓度为50 nmol/L,针对小窝蛋白1的si RNA(si CAV1)的最高工作浓度为100 nmol/L。q RT-PCR结果显示,si CHC转染神经细胞能抑制EV71 m RNA的表达(t=17.153,P0.01),但不能抑制JEV m RNA的表达(P0.05);而si CAV1转染神经细胞能抑制JEV m RNA的表达(t=11.406,P0.01),但不能抑制EV71 m RNA的表达(P0.05)。针对网格蛋白途径的化学抑制剂氯丙嗪(Chlorpromazine)可抑制EV71 m RNA的表达(t=4.114,P0.05),且呈剂量依赖性,而氯丙嗪并不影响JEV m RNA的表达(P0.05);针对小窝途径的化学抑制剂非律平(Filipin)可抑制JEV m RNA的表达(t=4.064,P0.05),且呈剂量依赖性,而非律平并不影响EV71 m RNA的表达(P0.05),与si RNA结果相一致。结论初步推测JEV入侵人神经细胞是通过小窝蛋白1依赖性的内吞作用入胞,而EV71感染人神经细胞则是通过网格蛋白依赖型的内吞途径。     

利用siRNA对β细胞上胰岛素受体的抑制作用

目的:利用siRNA抑制β TC-3细胞中胰岛素受体基因的表达.方法: 化学合成胰岛素受体(IR)基因的4对特异siRNAs(实验组:siRNA-1组,siRNA-2组,siRNA-3组,siR-NA-4组)和1对非特异siRNA(NC组).通过阳离子脂质体将siRNAs分别转染β TC-3细胞,24 h后荧光显微镜下观察不同浓度siRNA转染细胞的效率;应用逆转录PCR检测IRmRNA表达.结果: ①50,100,150,200 nmol/L siRNA转染βTC-3细胞24 h后,转染效率分别为(73.1±4.1)%,(92.9±3.4)%,(90.8±4.0)%,(93.9±2.8)%,选择190 nmol/L浓度作为siRNA转染浓度.②转染100 nmol/L siRNAs 24 h后,与对照组相比siRNA-1,2,3,4组B TC-3细胞IR mRNA表达都有不同程度下调,其中以siRNA-2组抑制效果最为明显,表达减少了70.5%.结论: 靶向IR mRNA的siRNA能在体外特异性的抑制IR的表达,为进一步研究β细胞上IR的功能提供了实验基础.     

1株肠道病毒71型毒株的分离与鉴定

目的 探讨手足口病病原体肠道病毒71型(EV71)的分离与鉴定方法。方法 采集手足口病疑似病例的咽拭子标本1份接种于人横纹肌肉瘤细胞(rhabdomyosarcoma cell, RD细胞),通过观察病毒的细胞病变效应(cytopathic effect, CPE)来分析EV71的分离效果。分别利用荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)及免疫印迹分析(Western Blotting)方法来鉴定EV71病毒特异性核酸和蛋白。扩增EV71VP1区全长基因,对其序列进行同源性比较及遗传进化分析。结果 手足口病疑似病例咽拭子标本接种RD细胞传代至第2代后出现CPE。RT-PCR和Western Blotting检测结果均显示,感染组RD细胞中有EV71病毒特异性条带,暂命名为EV71分离株2016SHYP001。序列分析结果显示,2016SHYP001株病毒的VP1区核苷酸与C型代表株的同源性较高,为93.1%~98.3%;其中与C4a亚型代表株的同源性最高,为98.3%。进化树分析发现本地流行株与深圳地区流行株的亲缘较近。结论 成功分离出一株新的EV71病毒株2016SHYP001,其株型为C4a亚型。     

环状RNA hsa_circ_103809在骨肉瘤中的表达及生物学作用实验研究

目的:探索环状RNA hsa_circ_103809在骨肉瘤中的表达及生物学作用.方法:采用荧光定量PCR(qRT-PCR)检测骨肉瘤组织及细胞系中hsa_circ_103809表达水平.将骨肉瘤细胞分为两组,实验组转染hsa_circ_103809 siRNA序列,对照组转染siRNA阴性对照(NC)序列.采用CCK...     

EV71入侵人神经母细胞瘤SK-N-SH细胞机制的初步研究

目的:初步研究肠道病毒71型(enterovirus type 71,EV71)入侵人神经母细胞瘤SK-N-SH细胞的机制。方法:将临床EV71分离株接种于人横纹肌肉瘤(rhabdomyosarcoma,RD)细胞,扩增和纯化病毒;MTT法检测不同病毒胞吞途径阻断剂对SKN-SH细胞生长抑制作用;用特异性的化学阻断剂预处理靶细胞后,Taq Man real-time PCR验证其对EV71 m RNA表达的影响。结果:RD细胞能够成功扩增出EV71病毒,病毒滴度为1×105 TCID50。随着药物浓度梯度的增加,SK-N-SH细胞的生长增殖受到抑制。Taq Man荧光定量RT-PCR结果显示氯丙嗪(chlorpromazine,CPZ)能够抑制EV71 m RNA的表达(Ρ<0.05),制霉菌素(nystatin,NT)对其影响不大(Ρ>0.05)。结论:初步推测EV71入侵SK-N-SH细胞是通过网格蛋白依赖性的内吞作用入胞。     

卷柏多糖对肠道病毒71型复制的体外抑制作用

目的研究卷柏多糖对EV71病毒复制的体外抑制活性。方法将卷柏多糖不同提取物设置不同剂量作用于人恶性横纹肌肉瘤细胞(RD),采用细胞病变效应(CPE)及细胞计数试剂盒(CCK8法)检测细胞存活率,并计算药物的半数中毒浓度(CC50);培养EV71感染的RD细胞,建立体外病毒感染模型,并设立正常细胞对照组和阳性药物对照组(利巴韦林3.2mg/L),将卷柏多糖不同提取物设置不同剂量作用于EV71感染后的RD细胞,应用CCK8法检测药物抗病毒抑制率,并计算药物的半数抑制浓度(IC50);收集药物作用于感染后RD细胞的培养液上清,进行荧光定量PCR检测,观察药物对EV71病毒RNA表达的影响。结果卷柏30%醇沉多糖和50%醇沉多糖对RD细胞的CC50值分别为396和142 mg/L,抑制EV71病毒致CPE的IC50值分别为40.8和26.2 mg/L。与病毒感染对照组相比较,卷柏30%和50%醇沉多糖作用后,经EV71感染的RD细胞培养液中病毒RNA拷贝数显著降低(P<0.05)。结论卷柏及其30%和50%醇沉多糖可以作为新的抗EV71的潜在药物。     

siRNA反向转染人肺动脉平滑肌细胞的条件优化

目的 寻找小分子干扰RNA转染人肺动脉平滑肌细胞的的最佳条件,建立有效的转染体系.方法 采用化学合成的能够抑制管家基因表达的siRNA,以0,5,10,15,30nmol/L的siRNA浓度,应用脂质体Lipofacet-amine RNAi MAX转染人肺动脉平滑肌细胞,转染48小时后通过显微镜观察和CCK-8检测细胞的增殖情况,评估转染效率.结果 对照组细胞生长正常,在不同转染浓度下,细胞的生长情况受到不同程度的影响.试剂对照组与空白对照组（0nmol/L组）细胞增殖无差异（P＞0.05）,10nmol/L以上浓度组的转染效率显著高于5nmol/L组（P＜0.05）,10、15和30nmol/L组转染效率差异不显著（P＞0.05）.结论 化学合成的siRNA可以在10nmol/L的浓度即可获得理想的转染效果.     

小分子干扰RNA转染效率的初步研究

目的:探讨小分子干扰RNA转染及转染效率的检测方法。方法:化学合成siRNA,转染人脐静脉内皮细胞,通过显微荧光、Western-blot等方法对转染剂的转染效率进行初步的监测和评估。结果:用转染剂siPORTTMNeoFXTM转染FITC标记的阴性对照siRNA和GFP siRNA,具有一定的转染效果,转染效率达35%。结论:检测siRNA转染活性的方法研究,为找到更好的检测方法奠定基础。     

木犀草素对肠道病毒71型感染细胞的影响

目的: 探讨木犀草素体外抗肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)感染的机制。方法: 分别用0、25、50、100、200、400 μg /mL木犀草素处理人横纹肌肉瘤（RD）细胞,48 h后检测细胞存活率;另将RD细胞分为对照组(常规培养)、木犀草素组(25、50、100 μg/mL)、EV71感染组和木犀草素(25、50、100 μg/mL)+EV71感染组,于病毒感染48 h后,MTT法检测各组细胞存活率,流式细胞术检测细胞凋亡,蛋白质印迹法检测Caspase-3表达,ELISA法检测细胞TNF-α,IL-β,IL-6和IL-10浓度。结果： 与0 μg/mL相比,25、50、100 μg/mL木犀草素对RD细胞存活率无明显影响(P>0.05);25、50和100 μg/mL木犀草素+EV71感染组RD细胞存活率均明显高于EV71感染组(P均<0.05);与EV71感染组相比,木犀草素+EV71感染组细胞凋亡率和Caspase-3表达明显降低,TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10分泌明显减少(P均<0.05)。结论： 木犀草素可能通过抑制细胞凋亡和减少促炎症因子分泌,抑制EV71对细胞的感染。     

UbcH10基因沉默对肺癌NCI-H226细胞增殖及细胞周期的影响

目的：通过脂质体转染siRNA方法沉默人肺鳞癌细胞NCI-H226中UbcH10基因,观察基因沉默后细胞增殖活性的变化及其对细胞周期的影响。方法：设计3条针对UbcH10基因CDS区不同位点的siRNA序列并构建shRNA表达载体,脂质体法转染重组质粒至NCI-H226细胞。转染后48小时,RT-PCR,Western-blot检测细胞内UbcH10 mRNA及蛋白含量。使用有效siRNA序列（pshRNA2）转染细胞,转染后24、48小时CCK-8检测细胞活性。使用有效siRNA序列转染细胞,转染后48小时收集细胞,流式法检测细胞周期。结果：成功构建shRNA重组质粒并转染NCI-H226细胞。转染siRNA 48小时后,3组NCI-H226细胞中UbcH10基因的mRNA及蛋白含量均明显下降;其中2号siRNA序列的沉默效果最好,UbcH10基因剩余表达量为对照组的14%。使用有效序列转染NCI-H226细胞24、48小时,细胞增殖活性明显降低,与基因未干预组比较,差异显著（P＜0.05）。使用有效序列转染NCI-H226细胞48小时,细胞明显阻滞于G2期,与基因未干预组比较有显著差异（P＜0.05）。结论：UbcH10基因沉默,可显著抑制NCI-H226细胞增殖活性,并使肺癌细胞阻滞于细胞G2期。     

Tbxa2r基因敲低对嘌呤霉素氨基核苷诱导的足细胞凋亡的影响

目的: 观察足细胞血栓素A2受体（Tbxa2r）基因敲低对嘌呤霉素氨基核苷(puromycin aminonucleoside,PAN)诱导的足细胞凋亡的影响。方法: 通过目标序列设计4条siRNA,评价细胞转染效率后,RT PCR检测siRNA干扰效果,蛋白质印迹法检测Tbxa2r蛋白表达,流式细胞仪检测PAN诱导的MPC5足细胞的凋亡情况。结果： 目标序列在转染24 h后几乎没有干扰效果,而在48 h时第3条siRNA(Tbxa2r mus 1677)干扰序列作用效果最好;在干扰72 h后,Tbxa2r蛋白表达量明显降低。PAN刺激48 h后,空白组与阴性对照组MPC5足细胞没有明显的凋亡现象,阳性对照组与Tbxa2r基因敲低PAN组细胞凋亡和坏死现象明显。结论： PAN能促进Tbxa2r基因敲低的足细胞发生凋亡和坏死。     

WNT4基因沉默对PAX2诱导肾小管上皮细胞间充质转分化的影响

目的：观察体外转染配对盒基因2（PAX2）对WNT4通路的激活作用及WNT4通路对PAX2诱导转分化的作用,探讨PAX2转分化机制。方法：应用脂质体介导将重组质粒pEGFP-PAX2转染入体外培养的大鼠肾小管上皮细胞,经G418 筛选,建立稳定表达PAX2细胞系。细胞分为稳定转染PAX2组、空载组和对照组。Western blotting法和实时荧光定量(Real-time)PCR法检测各组细胞WNT4和β-catenin表达。应用靶向WNT4基因的siRNA沉默稳定转染PAX2细胞的WNT4,应用荧光显微镜观察转染效率,进行沉默鉴定筛选出最佳干扰链。将最佳干扰链WNT4 siRNA转染至稳定转染PAX2细胞。在沉默24、48、72和96 h应用Western blotting法和Real-time PCR法检测β-catenin、正常肾小管上皮细胞表型标志物E-钙黏蛋白(E-cadherin)和成纤维细胞表型标志物α-肌动蛋白（α-SMA）表达,同时筛选出沉默最佳时间点。应用免疫组织化学染色法检测沉默最佳时间点组E-cadherin和α-SMA蛋白表达。结果：Western blotting和Real-time PCR检测,稳定转染PAX2细胞组WNT4 和β-catenin蛋白及mRNA表达水平较空载组和对照组明显增加（P<0.05）。阴性siRNA转染入稳定转染PAX2细胞24 h 后荧光显微镜观察,转染效率为47.46％±4.48％。3条WNT4干扰链分别转染至稳定转染PAX2细胞,Real-time PCR和Western blotting结果显示第3干扰链沉默效果最佳,WNT4 mRNA 表达抑制率为66.9 ％±3.8％（P<0.05）; WNT4 蛋白表达抑制率为63.7％±2.5％（P<0.05）。将最佳干扰链转染至稳定转染PAX2细胞,干扰24、48、72和96 h后,各时间点细胞中的β-catenin mRNA及蛋白表达水平较对照组下调,72 h组下调明显（P<0.05）;各时间点细胞中E-cadherin mRNA及蛋白表达水平较对照组明显上调,72 h组上调明显（P<0.05）;各时间点细胞中α-SMA mRNA及蛋白表达水平较对照组明显下调,72 h下调明显（P<0.05）。结论：PAX2转染至肾小管上皮细胞后激活了WNT4通路,PAX2在体外诱导正常肾小管上皮细胞间充质转分化可能是通过WNT4/β-catenin通路完成。     

Bmi-1 siRNA对宫颈癌Hela细胞体外增殖能力的影响

[目的]观察siRNA沉默Bmi-1表达对Hela细胞增殖能力的影响。[方法]构建了表达Bmi-1 siRNA的重组真核表达载体,将其转染入Hela细胞,利用荧光法观察转染效率。用RT-PCR及Western blot方法检测转染后细胞Bmi-1 mRNA及Bmi-1蛋白的表达情况;用MTT比色法、台盼蓝拒染法检测Bmi-1 siRNA对Hela细胞增殖的抑制作用;用流式细胞仪分析各组细胞的细胞周期;用平板克隆形成实验检测Bmi-1 siRNA对Hela细胞的单细胞增殖能力的影响;应用免疫细胞化学(SP法)及Western blot法检测各组细胞Ki-67及CyclinD1的表达。[结果]将构建好的重组质粒成功转染进入了Hela细胞中且转染效率在90%左右;Bmi-1 siRNA转染Hela细胞Bmi-1 mRNA及Bmi-1蛋白表达沉默,Bmi-1表达沉默后抑制Hela细胞增殖并使细胞周期阻滞于G0-G1期,能明显抑制Hela细胞的单细胞增殖能力;同时Ki-67及CyclinD1的表达均明显下降。[结论]siRNA介导的Bmi-1基因的表达沉默能抑制Hela细胞的增殖能力,Bmi-1表达可能与宫颈癌的发生发展相关。     

siRNA沉默细胞周期蛋白A2基因对骨肉瘤细胞增殖的抑制作用

目的研究siRNA对骨肉瘤MG-63细胞株及正常成纤维细胞细胞周期蛋白cyclin A2基因表达的抑制及对细胞增殖的影响。方法设计并化学合成靶向cycllnA2基因的siRNA,用oligofectamine将其转染到骨肉瘤细胞系MG-63及正常人成纤维细胞（HSF）中,用无义siRNA转染作为阴性对照,以单加缓冲液磷酸盐缓冲液（PBS）作为空白对照,实时-聚合酶链反应（PCR）、Western印迹方法检测cyclinA2基因沉默效果,采用MTT、RT-PCR、流式细胞、平板克隆培养等方法评价cycllnA2基因表达后被抑制后细胞的生长状态,同时检测细胞PCNA及cyclinB1基因表达的改变。结果1、10、50、100nmol／L浓度的cyclinA2-siRNA分别使MG-63细胞cyclinA2基因表达降低了9．4％,56．4％,79．2％和84．3％,同时cyclinA2蛋白表达也相应降低。转染10nmol／L及50nmol／LsiRNA后48h,MG-63细胞增殖抑制分别达到39．1％及54．9％,细胞周期阻滞于G0／G1期,平板克隆形成率降低,细胞中增殖细胞核抗原（PCNA）及cyclinB1的mRNA表达水平明显下降。对正常成纤维细胞HSF,50nmol／LcyclinA2-siRNA可抑制58．1％的cyclinA2基因及蛋白表达,其导致细胞周期出现轻度改变,但细胞的增殖及平板克隆形成能力未受影响。结论cyclinA2是肿瘤细胞增殖所依赖的关键基因,针对cyclinA2基因的siRNA能有效降低细胞中cyclinA2mRNA及蛋白的表达,其能抑制骨肉瘤细胞的生长而对正常细胞的增殖影响很小,靶向cyclinA2的siRNA有望成为治疗骨肉瘤的新途径。