cDNA芯片技术在强直性脊柱炎研究中的初步应用

目的 了解强直性脊柱炎（AS）病人外周血单个核细胞（PBMC）基因表达谱与类风湿关节炎（RA）及健康志愿者有无差异,寻找疾病发生及炎症相关的异常变化基因,初步探讨其变化意义。方法 以含588个基因的cDNA微阵列检测7例活动期AS、6例活动期RA病人以及7位正常对照者PBMC基因表达谱,并挑选至少有4例关节炎病人表达增多的13个炎症反应相关的细胞因子,扩大研究病例数以半定量逆转录聚合酶链（RT－PCR）方法验证其表达水平。结果 cDNA微阵列检测结果显示,AS和RA病人基因表达谱明显异常。在正常对照组、AS和RA病人的异常高表达的基因表达率分别为8．4％、32．5％和44．8％,两组关节炎病人与正常对照者比较P均＜0．001;而且RA组异常表达率又明显多于AS组（P＜0．012）,2例活动性肺结核病人也有类似的高表达。以RT－PCR法验证的13个基因的表达水平,发现22例AS,8例RA病人基因表达结果与cDNA微阵列检测结果一致。结论 AS病人PBMC基因表达谱明显异常,与RA病人也明显不同,13个细胞因子的高表达对AS无特异性。     

系统性红斑狼疮患者外周血单个核细胞中PDCD5 mRNA的表达及意义

目的 通过检测系统性红斑狼疮(SLE)患者外周血单个核细胞(PBMC)凋亡相关基因程序化细胞死亡因子5(PDCD5)mRNA 表达变化,从而探讨PDCD5基因与SLE发生与发展的关系.方法 应用逆转录PCR(RT-PCR)半定量检测67例SLE患者和50例健康者PBMC中PDCD5 mRNA的表达.结果 SLE活动期患者PDCD5 mRNA 阳性表达率明显高于健康者(P＝0.00);SLE活动期患者PDCD5 mRNA表达水平明显高于稳定期患者和健康者(P<0.01),稳定期患者PDCD5 mRNA比健康者也明显升高(P<0.01).SLE活动期患者PBMC中PDCD5的表达与反应SLE疾病活动的指标如SLEDAI、补体C3、抗ds-DNA抗体等呈显著相关(P<0.05).狼疮性肾炎患者和非狼疮性肾炎患者PDCD5表达差异无统计学意义(P>0.05).结论 SLE患者PBMC中PDCD5表达上调,且与SLE疾病活动相关,提示PDCD5通过增加表达量而导致异常淋巴细胞凋亡,参与SLE的发生、发展.     

Tregs细胞CCR4、CCR6表达异常在类风湿关节炎患者发病时的意义

目的探讨Tregs细胞CCR4、CCR6受体在类风湿关节炎（RA）患者发病时的意义。方法选择45例活动期RA患者（RA组）及30例健康体检者（对照组）,从外周血分离单个核细胞（PBMC）,采用流式细胞分析法检测RA患者外周血中CD4+Foxp3+细胞（Tregs）占比及其该类细胞上CCR4、CCR6的表达水平,并对Tregs上CCR4、CCR6水平与RA临床活动指标进行相关性分析。结果与对照组比较,RA活动期患者外周血Tregs细胞数量明显减少,差异有统计学意义（P＜0.05）;RA活动期患者外周血Tregs细胞表面趋化因子受体CCR4、CCR6表达水平与对照组的差异有统计学意义（P＜0.05）;RA活动期患者外周血Tregs细胞CCR4、CCR6表达水平与DAS28评分呈正相关（P＜0.05）。结论 RA患者外周血中Tregs细胞上趋化因子受体CCR4、CCR6表达增加,可能是Tregs细胞获得定向迁徙至病变关节能力的表现,也是机体炎症反应时反馈性调节的一种现象。     

TLR2在类风湿性关节炎中的表达及意义

目的探讨TLR2在类风湿性关节炎（RA）发病中的作用。方法选取活动期RA患者29例,非活动期RA患者20例及健康对照组18例。采用流式细胞术（FCM）检测RA患者外周血单核细胞表面TLR2表达率及蛋白相对含量,结合RA常规临床检测指标,对各组进行对比研究。结果①活动期RA患者CD14＋单核细胞上TLR2表达率及蛋白相对含量均显著高于非活动期和健康对照组（P〈0．05）,而非活动期RA患者CD14＋单核细胞TLR2表达率及蛋白相对含量与健康对照相比差异无统计学意义;②外周血CD14＋单核细胞上TLR2蛋白相对含量与ESR、血清CRP呈正相关（P〈0．05）,与RF无明显相关。结论活动期RA患者TLR2高表达,且其表达与疾病活动指标相关。TLRs信号通路可能参与了RA的病理过程,促进了外周血单核细胞的活化,进而引起炎症介质的释放。     

类风湿关节炎患者骨代谢相关基因表达及信号通路的变化

［摘要］目的: 探讨类风湿关节炎(rheumatoid arthritis, RA)患者骨代谢相关基因骨保护素、核因子κB受体活化因子配体(RANKL)及核转录因子κB （NF κB）、骨形态发生蛋白（BMP）信号通路的表达。方法: 应用聚合酶链式反应(PCR)技术检测 40例RA患者和32例健康对照者外周血单个核细胞(PBMC)中骨保护素、RANKL、NF κB p50、NF κB p52、NF κB p65、BMP 2、BMP 9 的mRNA表达水平,比较两组骨保护素/RANKL比值,并分析差异有统计学意义的指标与红细胞沉降率（ESR）、血清C 反应蛋白（CRP）和DAS28评分等疾病活动指标的相关性。另选取10例初发RA患者和10例健康对照者,检测其 PBMC 中NF κB p65 mRNA的水平。 结果： 与健康对照者相比,RA患者RANKL mRNA相对表达量明显上升(P<0.01),骨保护素/RANKL比值明显下降(P<0.01),NF κB p65 mRNA相对表达量明显下降(P<0.01),骨保护素、NF κB p50、NF κB p52、BMP 2及BMP 9的 mRNA相对表达量两组间差异无统计学意义,RANKL、NF κB p65、骨保护素/RANKL与血ESR、血清CRP和DAS28评分无相关性。与健康对照组相比,初发RA患者的NF κB p65 mRNA表达量增高(P<0.05)。结论： RA患者PBMC表达破骨指标增加,并可能通过NF κB信号通路影响骨代谢。     

类风湿关节炎患者IL-17、IL-18、IL-6和TNF-α检测的意义

目的探讨白细胞介素-17（IL-17）、白细胞介素-18（IL-18）、白细胞介素-6（IL-6）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）在类风湿关节炎（RA）患者外周血中的表达和临床意义。方法应用ELISA方法对40例活动期RA患者、40例稳定期RA患者和40例健康对照组的外周血血清中的JL—17、IL-18、IL-6和TNF—α含量进行检测分析。结果活动期RA患者的血清中IL-17、IL-18、IL-6和TNF-α含量明显高于稳定期RA患者（P〈0.01）和健康对照组（p〈0．01）;稳定期RA患者的血清中IL-17和IL-18含量高于健康对照组（P〈0．05）,而IL-6和TNF-α含量与对照组相比,差异无统计学意义（P〉0．05）。结论RA患者IL-17、IL-18、1L-6和TNF—α含量的变化特点与病情相关,联合动态监测有助于临床观察和治疗。     

类风湿关节炎患者TH17细胞及其相关细胞因子的表达及临床意义

目的 探讨类风湿关节炎(RA)患者TH17细胞及其相关细胞因子的表达及临床意义.方法 收集大连医科大学附属第一医院门诊RA初治活动期患者的外周血标本32例为活动期RA组,健康献血者30例为健康对照组,所有受试者清晨空腹坐位肘静脉采血.应用酶联免疫吸附法(ELISA)及反转录PCR(RT-PCR)法,分别检测外周血血清中IL-17水平和外周血单个核细胞(PBMC)中IL-17mRNA表达水平;将PBMC一组不加刺激,另一组用佛波酯(50 ng/mL)和离子霉素(1μg/mL)刺激4h后,流式细胞仪检测TH17细胞数量.结果 活动期RA患者血清IL-17水平(15.76 ±0.62) pg/mL与健康对照组(8.67±0.12) pg/mL比较,差异有显著性意义(P＜0.05).活动期RA患者PBMC的IL-17mRNA表达水平(1.94±0.46)与健康对照组(0.84±0.16)比较,差异有显著性意义(P＜0.05).RA组血清IL-17水平与mRNA表达水平呈正相关(r=0.70,P＜0.05),且与疾病活动程度(DAS28)评分呈正相关(r=0.99,P＜0.05).活动期RA患者外周血TH17细胞比例(2.50±0.54)％与健康对照组(0.03±0.00)％比较,差异有显著性意义(P＜0.05).但刺激组(3.23±0.05)％与无刺激组(2.50±0.54)％比较,差异无显著性意义(P＞0.05).RA患者组TH17细胞数量与疾病活动程度(DAS28)评分呈正相关(r=0.96,P＜0.05).结论 活动期RA患者TH17细胞及其主要效应性细胞因子IL-17在细胞、蛋白和基因表达水平上均明显升高并与疾病活动程度呈正相关,对临床制定治疗方案、判断疗效有指导意义.     

强直性脊柱炎患者PBMC中IP-10、IFN-γ和IL-4 mRNA表达水平及意义

为探讨强直性脊柱炎患者外周血单个核细胞(PBMC)中诱导蛋白10(IP-10)、干扰素-γ(IFN-γ)和白细胞介素-4(IL-4)mRNA水平及意义。选取强直性脊柱炎患者92例(观察组),其中稳定期42例,活动期50例;同时选取健康体检者100例作为对照组,采用RT-PCR检测PBMC中IP-10、IFN-γ和IL-4 mRNA表达。观察组PBMC中IP-10、IFN-γ和IL-4 mRNA相对表达量分别为明显高于对照组;观察组活动期患者PBMC中IP-10、IFN-γ和IL-4 mRNA相对表达量分别明显高于稳定期;观察组患者ASDAS评分、IP-10、IFN-γ和IL-4 mRNA相对表达量与ASDAS评分呈正相关。结果显示强直性脊柱炎患者PBMC中IP-10、IFN-γ和IL-4 mRNA表达明显升高,与病情程度有一定关系。     

强直性脊柱炎患者PBMC中IP-10、IFN-γ和IL-4 mRNA表达水平及意义

为探讨强直性脊柱炎患者外周血单个核细胞(PBMC)中诱导蛋白10(IP-10)、干扰素-γ(IFN-γ)和白细胞介素-4(IL-4)mRNA水平及意义。选取强直性脊柱炎患者92例(观察组),其中稳定期42例,活动期50例;同时选取健康体检者100例作为对照组,采用RT-PCR检测PBMC中IP-10、IFN-γ和IL-4 mRNA表达。观察组PBMC中IP-10、IFN-γ和IL-4 mRNA相对表达量分别为明显高于对照组;观察组活动期患者PBMC中IP-10、IFN-γ和IL-4 mRNA相对表达量分别明显高于稳定期;观察组患者ASDAS评分、IP-10、IFN-γ和IL-4 mRNA相对表达量与ASDAS评分呈正相关。结果显示强直性脊柱炎患者PBMC中IP-10、IFN-γ和IL-4 mRNA表达明显升高,与病情程度有一定关系。     

类风湿关节炎患者血清IL-13水平表达及对外周血单个核细胞中Th17细胞亚群分化的影响

目的:探讨类风湿关节炎(RA)患者血清IL-13表达及对RA患者外周血单个核细胞(PBMC)中Th17细胞亚群分化的影响.方法:通过酶联免疫吸附试验(ELISA)检测活动期RA患者(活动组,n=30)、稳定期RA患者(稳定组,n=30)和健康体检者(正常组,n=30)外周血血清白细胞介素-13(IL-13)表达水平,分...     

类风湿关节炎患者外周血中糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体相关基因及其配体的表达和意义

目的:研究糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体家族相关基因(GITR)与其配体(GITRL)在类风湿关节炎(RA)患者外周血中的表达及其与临床指标的相关性,探讨GITR/GITRL 在RA中的意义.方法:采用实时荧光定量PCR法检测RA组(n=53)、骨关节炎(OA)组(n=35)及正常对照组(n=35)外周血GITR/GITRL mRNA含量,同时利用流式细胞仪检测上述三组患者的GITR在CD4+CD25+ T细胞的表达,并研究GITR mRNA与RA患者DAS28评分、抗环瓜氨酸(CCP)抗体、C反应蛋白(CRP)、红细胞沉降率(ESR)及类风湿因子(RF)的关系.结果:RA患者外周血GITR mRNA水平和GITRL mRNA水平(分别为12.38±5.72,16.41±10.16)明显高于正常对照组(分别为8.75±3.78,11.99±8.42)及OA组(分别为9.59±5.87,12.09±7.53;均P＜0.05).RA患者与OA组及正常对照组比较,外周血CD4+CD25+GITR+T细胞的比例也明显增高[分别为(28.12±16.85)%,(21.01±14.42)%,(19.98±9.40)%,均P＜0.05].RA患者GITR mRNA表达水平与DAS28评分及ESR呈明显正相关(r值分别为0.361和0.427,P＜0.01).结论:RA患者GITR/GITRL表达增多,与RA发病及疾病活动度有关.     

TWEAK/Fn14在骨关节炎患者中的表达及其临床意义

目的:探讨TWEAK/Fn14在骨关节炎患者中的表达及其临床意义,为临床早期诊断骨关节炎探索新的方法。方法:收集35例骨关节炎患者为实验组,选择12例骨折患者作为对照组,采用ELISA方法检测两组人群血浆中TWEAK、RAN-TES、IL-18和IL-21水平,RT-PCR检测TWEAK mRNA在外周血单个核细胞和软骨细胞中的表达以及Fn14 mRNA在软骨细胞中的表达。结果:TWEAK、RANTES、IL-18、IL-21和ESR在实验组患者血浆中较对照组高表达(P<0.05)。在PBMC和软骨细胞中表达TWEAK mRNA,以及在软骨细胞表达Fn14mRNA,实验组均高于对照组(P<0.05)。结论:TWEAK在骨关节炎患者的血浆、PBMC和软骨细胞中高表达,Fn14在骨关节炎患者软骨细胞中高表达,表明TWEAK/Fn14可能参与了骨关节炎的病理发病过程,有望成为该病诊断的标志物。     

混合性结缔组织病患者外周血单个核细胞中甲基转移酶DNMT1 mRNA的表达水平及意义

目的:探讨甲基转移酶DNMT1在混合性结缔组织病(MCTD)患者外周血单个核细胞(PBMC)中的表达及其意义。方法:分离MCTD患者及正常人群PBMC,采用Qiagen RNA/DNA mini kit提取RNA,实时-定量PCR检测DNMT1mRNA的表达。结果:MCTD患者PBMC中甲基转移酶DNMT1 mRNA表达较正常对照组明显降低,两组比较有统计学意义(P<0.001)。结论:MCTD患者PBMC中甲基转移酶DNMT1表达水平显著降低,DNMT1可能在MCTD发病中起作用。     

类风湿关节炎外周血和关节液树突状细胞的膜分子表达及功能研究

目的研究类风湿关节炎（rheumatoid arthritis,RA）患者树突状细胞（dendritic cell,DC）的膜分子表达水平和功能的变化,探讨DC在RA发病机制中的作用。方法应用流式细胞术、混合淋巴细胞培养测定诱导DC细胞表面分子表达、对同种异体T细胞功能情况,诱导成熟后DC表面分子表达与临床活动及预后相关指标ESR、CRP、RF、Stoke指数的相关性。结果RA外周血来源DC表达CD83、CD209、CD80、HLA—DR较正常人外周血来源DC增高（P〈0．05）,RA关节液来源DC较RA外周血来源DC表达CD83、CD209、CD86、CD80明显增高（P〈0．05）。RA关节液组较RA和正常人外周血DC对同种异体T细胞的刺激明显增强。RA患者外周血诱导成熟DC表型CD83、CD209与stoke评分指数呈正相关。结论提示RA时关节内免疫反应可能与局部DC分化、成熟能力增强有关,后者可通过激活T细胞引起自身免疫反应,造成滑膜组织损伤。RA患者DC表面共刺激分子表达水平的增高可能与患者免疫亢进及所致的免疫损伤有关。     

类风湿关节炎患者外周血TWEAK基因启动子区甲基化状态及其表达

目的:通过检测外周血肿瘤坏死因子样凋亡弱诱导剂(tumor necrosis factor-like weak inducer of apoptosis,TWEAK)基因DNA甲基化水平、mRNA表达水平及血清蛋白浓度,探究TWEAK基因与类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)发病机制的关联。方法:采用MassARRAY法检测112例RA患者和86例匹配的健康志愿者外周血TWEAK基因DNA甲基化水平,采用实时荧光定量PCR法检测外周血TWEAK基因mRNA表达水平,采用酶联免疫吸附测定法检测血清TWEAK蛋白浓度。比较RA组和健康对照组TWEAK基因DNA甲基化水平、mRNA表达水平及血清蛋白浓度,并分析其与疾病活动度的关系。结果:RA组TWEAK基因总体甲基化水平和CpG_11、CpG_17.18.19.20、CpG_40.41.42位点甲基化水平高于健康对照组(P=0.002,P=0.01,P=0.006,P=0.002),高疾病活动度组CpG_55.56位点甲基化水平高于中低疾病活动度组(P=0.041)。RA组外周血TWEAK基因mRNA表达水平低于健康对照组(P=0.023),高疾病活动度组TWEAK基因mRNA表达水平低于中低疾病活动度组(P=0.035)。RA组血清TWEAK蛋白浓度与健康对照组差异无统计学意义(P=0.508), 但其与mRNA表达水平呈正相关(r=0.482,P<0.001)。结论:TWEAK基因与RA的发病和病情活动程度密切相关,其高甲基化状态可能为调控mRNA低表达的表观遗传学机制之一,可作为临床监测和评价RA病情的重要指标之一。     

外周血单个核细胞表面HLA-A和HLA-B在结直肠肿瘤中的表达

目的检测外周血单个核细胞表面（PBMC）HLA-A和HLA-B在结直肠肿瘤患者中的表达,并探讨其在肿瘤发生发展中的作用。方法以Beta-actin为内参照,实时荧光定量RT-PCR方法检测结直肠肿瘤患者（结直肠肿瘤组,n=50）、结直肠良性病变患者（良性病变组,n=35）和健康体检者(正常对照组,n=42)外周血单个核细胞HLA-A和HLA-B mRNA的表达,并比较结直肠肿瘤不同TNM分期中HLA-A和HLA-B mRNA的表达。三组平均年龄相近。用Rest( relative expression software tool)软件计算相对表达率（Ratio）。结果正常对照组PBMC的HLA-A和HLA-B mRNA相对表达率分别为0.99±0.47,1.13±0.60;结直肠良性病变组相对表达率分别为0.76±0.59,0.84±0.57;结直肠肿瘤组分别为0.38±0.31和0.39±0.35。结直肠肿瘤组PBMC的HLA-A mRNA和HLA-B mRNA相对表达率低于正常对照组和结直肠良性病变组（P＜0.001）。结直肠肿瘤组HLA-A mRNA在TNM不同分期之间的表达无统计学差异(P＞0.05);HLA-B mRNA在TNMⅠ期患者中的表达高于Ⅱ期和Ⅳ期（P＜0.05）,在其他不同分期之间差异无统计学意义(P＞0.05)。结论结直肠肿瘤患者外周血单个核细胞HLA-A和HLA-B与其细胞免疫相关,在抗肿瘤免疫中起重要作用。     

阿托伐他汀对强直性脊柱炎患者外周血单个核细胞体外干预后Toll样受体2、Toll样受体4的表达变化研究

目的：观察天然免疫分子Toll样受体2（TLR-2）、Toll样受体4（TLR-4）在强直性脊柱炎（ankylosing spondyli-tis,AS）患者外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells,PBMC）的mRNA水平表达,研究其与AS发病的相关性,并探讨阿托伐他汀是否对AS患者TLR-2、TLR-4的表达有影响。方法：研究对象包括AS活动期患者30例和健康志愿者30例,分别抽取外周静脉血分离单个核细胞,提取细胞mRNA。采用半定量的RT-PCR方法,检测AS患者和健康志愿者外周血单个核细胞中TLR-2、TLR-4的mRNA,通过灰度分析与β-actin相比得到目的基因相对表达水平。分离12例AS活动期患者静脉血外周血单个核细胞体外培养,并给予阿托伐他汀（终浓度为0.01 mmol/L）处理,以自身非处理细胞为对照,24 h后收获细胞,提取mRNA,采用RT-PCR方法,观察阿托伐他汀对细胞TLR-2、TLR-4的mRNA表达的影响。所有数据采用配对t检验。结果：AS患者TLR-2 mRNA的相对表达水平为（1.59±1.43）,较健康志愿者（0.06±0.039）高（P〈0.05）;AS患者TLR-4 mRNA的相对表达水平为（0.60±0.73）,较健康志愿者（0.06±0.039）高（P〈0.05）;阿托伐他汀干预组TLR-2和TLR-4的mRNA表达均低于不干预对照组（P〈0.05）。结论：AS患者PBMC的TLR-2、TLR-4的表达均较健康志愿者高,提示TLR-2和TLR-4可能参与了AS的发病。阿托伐他汀可下调AS患者PBMC的TLR-2和TLR-4的表达,可能是AS新的有价值的治疗靶点之一。     

定量PCR检测类风湿关节炎患者外周血单个核细胞Notch基因表达

目的:探讨4种Notch受体基因在类风湿性关节炎(RA)患者外周血单个核中的表达及其意义.方法:采用免疫磁珠分离纯化RA患者外周血T,B及单核细胞,定量PCR检测4种Notch受体mRNA表达水平,并与正常人进行比较.结果:与正常人相比,RA患者T细胞Notch 2,Notch 3及Notch 4表达量增加(P＜0.01),其中Notch 3主要表达于活化的T细胞,而Notch 1水平在两者间未见明显差异.B细胞及单核细胞4种Notch受体表达均较低,且两者间亦未见显著差异.结论:RA患者存在Notch基因表达的改变,一群高表达Notch 3基因的活化T细胞可能在RA疾病机制中具有重要的意义.