阿霉素联合p21CIP1基因转染对人肝母细胞瘤细胞株HepG2增殖的影响

背景与目的:阿霉素类药物是治疗肝母细胞瘤的传统化疗药,但近年来其疗效不佳是困扰临床的一大问题,目前配合基因治疗提高阿霉素的疗效,是肝母细胞瘤治疗发展的新趋势。本实验研究阿霉素与p21基因转染联合对人肝母细胞瘤HepG2细胞增殖的影响。方法:实验分为空白对照组、单独加药组、pcDNA3转染对照组、p21转染组及p21转染 药物联合组。用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测转染后HepG2细胞的生长趋势,联合处理后细胞增殖抑制状况;荧光定量PCR检测转染后p21mRNA的表达情况,联合处理后survivinmRNA的水平变化。结果:转染后,p21转染组在第3d和第4d的生长速度明显慢于两对照组(P<0.01);经鉴定其有p21mRNA表达量的增高,是空白对照组的155倍(P<0.05)。以空白组为对照,在第3～5d,联合组增殖抑制率明显高于单独加药组和p21转染组(第3d:43.92%vs.32.97%、35.77%,P<0.01;第4d:59.86%vs.39.35%、40.96%,P<0.01;第5d:51.81%vs.33.91%、10.68%,P<0.01);且1～4d内随联合用药时间的延长,抑制效应增强(r=0.91,P<0.05),并在第4d时较显著(Q=1.07)。荧光定量PCR显示,联合组survivinmRNA水平显著低于p21转染组(P<0.01);与单独加药组比较,联合作用仅在48h时差异有统计学意义(P<0.01)。结论:在一定时间范围内p21可增强阿霉素对HepG2细胞的增殖抑制作用,降低胞内survivinmRNA的表达。     

乙型肝炎病毒X基因经p53依赖性与非依赖性途径对p21WAF1表达的影响

背景与目的:研究表明,在不同情况下乙型肝炎病毒 X基因(HBx)对 p21WAF1的表达具有不同的影响,但作用机制仍不清楚.本研究的目的是探讨 HBx对 p53下游基因 p21WAF1的影响.方法:通过正、反义野生型 p53(wtp53)与 HBx单转染及共转染人肝癌细胞株 SMMC-7721细胞,以及 HBx转染不同内源性 p53状态的肝癌细胞株,检测 p21WAF1启动子荧光素酶基因表达,并用流式细胞仪观察细胞周期的变化 ,Western blot法比较 p53、p21WAF1表达水平的变化.结果:正、反义 wtp53与 HBx 单转染及共转染 SMMC-7721细胞 ,HBx与正义 wtp53共转染组(1.007± 0.098)与单转染正义 wtp53(0.490± 0.012)相比,p21WAF1启动子荧光素酶基因表达明显升高(P< 0.05),其余各组 HBx均可导致 p21WAF1启动子荧光素酶基因表达明显减少(P< 0.05).Western blot法表明 HBx可导致 p53的表达增加,但 p53表达较低的 SMMC-7721细胞转染 HBx后 p21WAF1蛋白的表达减弱 ,p21WAF1启动子荧光素酶基因表达(0.053± 0.010)也较对照组(0.094± 0.013)明显减少(P< 0.05),而 p53表达较强的 HepG2细胞转染 HBx后 p21WAF1蛋白的表达增强、p21WAF1启动子荧光素酶基因的表达(1.252± 0.052)较对照组明显升高(0.767± 0.031)(P< 0.05).细胞周期结果表明瞬时转染 HBx的 SMMC-7721和 Hep3B细胞停滞在 G0-G1期细胞数(42.31%、36.96%)较对照组(47.10%、42.90%)减少,而瞬时转染 HBx的 HepG2细胞(63.62%)停滞在 G0-G1期的细胞数较对照组(57.42%)增加,但稳定筛选后 ,pcDNA3HBxHepG2细胞(57.31%)停滞在 G0-G1期细胞数较对照组(61.49%)减少.结论:HBx一方面可能引起 p53蛋白在细胞内积聚导致 p21WAF1表达升高,另一方面可直接抑制 p21WAF1启动子的转录活性.     

p53p21双基因转染对肝癌细胞生长的抑制作用研究

 目的　研究 p5 3和 p2 1双基因对肝癌细胞的联合基因治疗效果。 方法　通过磷酸钙 -DNA共沉淀法将p5 3和 p2 1双基因真核共表达载体及单基因表达载体引入肝癌细胞SMMC 772 1,用直接镜检 ,DNAladder检测法和四甲基偶氮唑 (MTT)法等研究细胞生长情况。结果　转染外源 p5 3p2 1双基因的肝癌细胞SMMC 772 1与未转染及单基因转染的肝癌细胞SMMC 772 1相比 ,其增殖速度显著下降。结论　p5 3和p2 1双基因对肝癌细胞的联合基因治疗效果比较明显 ,对肝癌基因治疗的进一步研究具有指导意义。     

横纹肌肉瘤P53,MDM2基因及p53,p21,p185蛋白表达检测比较

目的：探讨ｐ５３、ｐ２１、ｐ１８５蛋白表达及ｐ５３、ＭＤＭ２基因与横纹肌肉瘤（ＲＭＳ）分化和预后的关系，并对几种检测方法进行了比较。方法：应用免疫组化方法检测ＲＭＳｐ５３、ｐ２１、ｐ１８５蛋白表达，银染ＰＣＲＳＳＣＰ检测ＲＭＳｐ５３的突变，原位杂交检测ＲＭＳｐ５３和ＭＤＭ２基因。结果：ｐ５３、ｐ２１、ｐ１８５蛋白在ＲＭＳ的阳性率分别为６７２％（４１／６１）、６８（３４／５０）、６０％（３０／５０）；检测３０例ＲＭＳ，ｐ５３基因７例发生点突变原位杂交检测ＲＭＳ的ｐ５３、ＭＤＭ２基因突变的检出率分别为６６７％和７７４％；上述结果均与年龄、性别、肿瘤组织类型无关，而与肿瘤分化转移和预后有关。结论：ｐ５３、ｐ２１、ＭＤＭ２蛋白表达及癌基因检测均有助于判断肿瘤恶性程度和肿瘤预后，上述３种方法比较，免疫组化与原位杂交检测的阳性结果基本相符，提示免疫组化方法同样能反映肿瘤恶性程度和预后，是一种简便可行的检测方法。     

EB病毒相关胃癌与mdm2，p53及p21基因异常的研究

 目的 探讨p53基因突变以及mdm2，p53和p21蛋白表达异常在EBV相关胃癌（EBVaGC）发生发展中的作用。方法 应用免疫组化技术检测13例EBVaGC、45例临床病理资料与之匹配的EBV阴性胃癌（EBVnGC）组织中 mdm2，p53和p21蛋白的表达；PCR-SSCP银染技术结合DNA序列分析检测p53基因exon 5~8突变；RT-PCR检测EBV相关基因的表达。结果 E-BVaGC组与EBVnGC组相比，两组间mdm2，p53和p21蛋白的阳性检出率差异无统计学意义（P = 0.830 0；P = 0.791 2；P = 0.353 1），但EBVaGC组p53蛋白过表达率（15.38 %）明显低于EBVnGC组（57.78 %），两组间差异有统计学意义（P = 0.008 5）。mdm2蛋白阳性表达与p53蛋白过表达呈显著正相关（P = 0.000 8，r = 0.439 1）；p21与p53蛋白共同表达率较高，但经计数资料相关性统计学分析表明两者无显著相关性（P = 0.2501，r = 0.202 5）。2例EBVnGC检测到p53基因突变，突变均位于exon 5，13例E-BVaGC和58例相应癌旁组织均未检测到p53基因突变。13例EBVaGC核抗原基因EBNA1均为阳性，潜伏膜蛋白基因LMP1均为阴性，即刻早期基因BZLF1，早期基因BARF1和BHRF1阳性率分别为46.15 %（6／13），46.15 %（6／13）和15.38 %（2／13），三者与EBVaGC组织中mdm2，p21和p53蛋白的表达均无显著相关性（P＞0.05）。 结论 EBV感染以及mdm2，p53和p21蛋白表达异常与胃癌发生有关； p53基因突变可能并非胃癌组织中p53蛋白异常累积的主要原因；胃癌组织中EBV感染与p53蛋白的异常表达有关，而与mdm2和p21蛋白的异常表达以及p53基因突变无显著相关性。     

ARF-mdm2-p53的相互作用途径

细胞周期素依赖性激酶4（cyclin-dependent kinase4,CDK4)抑制蛋白基因p16INK4α及其可变读框基因（alterative reading frame,ARF)-INK4α-ARF基因位于人染色体9p21的CDKN2A位点,该位点编码两个重叠的基因;p16INK4α和ARF基因,这两个基因的阅读框架不同,因此,p16和ARF基因的氨基酸顺序是完全不同的,ARF主要通过mdm2参与mdm2-p53通路的调节。目前研究表明ARF基因在肿瘤发生过程中可有起一定的作用,ARF基因功能的失活可能主要通过该基因启动子高度甲基化。本文就ARF与mdm2及p53相互作用途径做一综述。     

p53和p21基因蛋白表达与胃癌侵袭力的关系

采用免疫组织化学方法研究了６８例胃癌中癌细胞ｐ５３和ｐ２１基因蛋白表达与癌细胞侵袭力的关系。结果表明：６８例胃癌中有３６例ｐ５３基因蛋白染色阳性（５２．９％）,４８例ｐ２１基因蛋白染色阳性（７０．６％）;浸润于浆膜层和肌层的癌细胞ｐ５３蛋白染色的阳性程度明显高于粘膜层癌细胞（Ｐ＜０．０５）;浸润性生长的癌细胞中ｐ５３和ｐ２１蛋白阳性程度均明显强于膨胀性生长的癌细胞（Ｐ＜０．０５）;淋巴结转移病例的癌细胞其ｐ５３和ｐ２１蛋白染色阳性率（分别为５４．３％和７３．９％）与无淋巴结转移的病例（分别为５０．０％和６３．６％）无显著性差异（Ｐ＞０．０５）;有淋巴结转移的病例中,原发癌ｐ５３蛋白阳性强度与转移癌正相关（γ＝０．６８,Ｐ＜０．０１）。结果提示：ｐ５３和ｐ２１基因蛋白染色阳性程度较高的胃癌细胞具有较强的侵袭力。     

腺病毒介导的野生型p53基因对肺腺癌细胞株生长的抑制作用

为研究野生型p53基因对肺腺癌细胞株GLC-82细胞生长的作用,确立腺病毒介导的野生型p53基因在肿瘤治疗中的意义,应用分子克隆技术首先构建了野生型p53复制缺陷型腺病毒重组体,应用生化染色方法确定了重组体的转染效率,以免疫组化法及PCR技术分别确定了腺病毒载体介导的p53基因转染GLC-82细胞后p53蛋白和p53 cDNA的表达情况;最后应用细胞生物学方法检测了p53对GLC-82细胞扩增及细胞周期的影响.结果表明所构建的重组体可以高效、快速转染GLC82细胞,抑制GLC-82细胞扩增,使细胞合成期和分裂后期的量减少,出现细胞凋亡现象:提示野生型p53基因导入可作为治疗肺腺癌的途径之一     

神经酰胺通过非p53途径诱导鼻咽癌细胞中p21WAF1的表达

[目的]探讨第二信使神经酰胺信号传导诱导鼻咽癌细胞p21^WAF1表达的机理。[方法]Western blot法检测p53,p21,Jun,NFкB基因表达,试剂盒检测SAPK/JNK的活性。[结果]在鼻咽癌CNE2细胞中阿霉素能刺激p53表达,不能上调p21^WAF1的表达,可见在CNE2细胞中p53为功能异常型,C2-神经酰胺处理CNE2细胞后,可见p53蛋白呈现下降趋势;而p21^WAF1蛋白在处理4、16小时时,p21^WAF1表达明显增高,但36小时后p21^WAF1恢复到基础水平,在6.25μmmol/L,12.5μmmol/L,25μmmol/L的C2-神经酰胺处理24小时后p21^WAF1上升,而50μmmol/L的C2-神经酰胺处理24小时后,p21^WAF1开始下降,C2-神经酰胺处理CNE2细胞2小时后,JNK的活性开始增加,6小时时保持激活状态,12小时时下降,c-Jun/AP1蛋白在神经酰胺处理后3小时开始明显增高,持续到12小时,24小时下降至基础水平;C2-神经酰胺对CNE2细胞中NFкB蛋白表达没有明显的变化。[结论]C2-神经酰胺在鼻咽癌细胞CNE2中,通过p53非依赖性途径诱导p21^WAF1的表达,神经酰胺激活JNK,从而激活AP-1因子,可能是其诱导p21^WAF1表达的机理。     

原发性肝细胞癌组织中乙肝病毒整合与p53基因突变关系研究

应用Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交方法检测１５例原发性肝细胞癌及癌旁组织乙肝病毒（ＨＢＶ）存在状态，采用ＰＣＲ－ＳＳＣＰ（Ｐｏｌｙ－ｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ－ｓｉｎｇｌｅｓｔｒａｎｄｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）银染技术研究其ｐ５３基因突变。结果癌组织中１３例（８６．７％）有ＨＢＶＤＮＡ整合，同时３例伴游离ＨＢＶＤＮＡ；癌旁４例（２６．７％）有ＨＢＶＤＮＡ整合，而游离的ＨＢＶＤＮＡ却有６例。癌组织中ｐ５３基因变异８例（５３．３％），１例位于第５外显子，各有２例位于第６、第７外显子，３例位于第８外显子，癌旁组织未见ｐ５３基因异常，ｐ５３基因异常的癌组织中均有ＨＢＶＤＮＡ整合。研究结果表明，ＨＢＶＤＮＡ整合与ｐ５３基因突变密切相关，ＨＢＶＤＮＡ可能通过整合基因组后导致抑癌基因突变失去抑癌作用而引发肝癌。     

P53与乙型肝炎病毒增强子Ⅰ上游P53样应答元件结合序列关系研究

在前期工作中,我们经计算机序列分析发现,在乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)基因组增强子I上游l047～l059bp存在P53样应答元件结合序列5′TGCC(G)TTGCCT-3′,体外实验应用凝胶迁移方法(EMSA和EMSSA)发现这段序列与P53蛋白能够进行特异性结合。本实验拟观察肝癌细胞中P53蛋白与HBV基因组P53样应答元件结合序列之间的关系。     

Epigallocatechin Gallate Enhances Inhibition Effect of DDP on the Proliferation of Gastric Cancer BGC-823 Cells by Regulating p19Arf-p53-p21Cip1 Signaling Pathway

Objective: To indicate the effect of Epigallocatechin gallate (EGCG) and Cisplatin (DDP) on proliferation of gastric cancer BGC-823 cells and the relative underlying mechanism. Methods: Cultured BGC-823 cells were treated by 5 μg/mL DDP, 25 μg/mL EGCG and combined 5 μg/mL DDP with 25 μg/mL EGCG, a blank group was used as control. Cell morphology was observed by 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) staining. The ability of cell proliferation was detected by 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT)assay. The cell cloning rate was determined by colony formation assay. The ability of cell migration was detected by cell scratch test. The cell cycle distributions and apoptosis were analyzed by flow cytometry, The expression of p19Arf, p53, p21Cip1 mRNA was determined by RT-qPCR. The protein levels of p19Arf, p53, p21Cip1 were measured by Western blot. Results: Compared with DDP or EGCG treatment alone, EGCG combined with DDP treatment significantly caused nuclear shrinkage, reduced the proliferation rate, the ability of cell clone and migration. EGCG combined with DDP treatment caused cell cycle arrest in G1 phase in BGC-823 cells, increase of apoptosis (21.3%) vs EGCG (7.25%) and DDP (3.86%) single-use group (p <0.01), up-regulated gene and protein expressions of p19Arf, p53, p21Cip1 (p <0.01). Conclusion: EGCG can enhance the effect of DDP on inhibiting BGC-823 cell proliferation and inducing apoptosis via activating the p19Arf-p53-p21Cip1 signaling pathway.     

c-erbB-2、H-ras p21、p53及PCNA在原发性肝癌中的表达

应用免疫组化ＬＳＡＢ法，对５０例原发性肝癌、癌周肝组织及１０例正常肝组织中ｃ－ｅｒｂＢ－２、Ｈ－ｒａｓｐ２１和ｐ５３癌基因蛋白及ＰＣＮＡ表达进行比较研究。结果表明，ｃ－ｅｒｂＢ－２、Ｈ－ｒａｓｐ２１、ｐ５３及ＰＣＮＡ阳性表达率，在癌组织中分别为７０．０％、６８．０％、４６．０％及８２．０％；在癌周肝组织中分别为２２．０％、６４．０％、４．０％及５２．０％；正常肝组织中（除Ｈ－ｒａｓｐ２１外）未见表达，且癌组织与非癌组织（Ｈ－ｒａｓｐ２１除外）及正常肝组织之间有显著差异（Ｐ＜０．０５）。ｃ－ｅｒｂＢ－２和ｐ５３蛋白的表达与原发性肝癌的组织学分级有密切关系（Ｐ＜０．０５），且二者的表达有高度的相关性（Ｐ＜０．００５），在癌、癌周肝组织中，２种以上癌基因蛋白同时表达总率分别为１４４．０％、１２．０％，癌基因蛋白与ＰＣＮＡ同时表达总率分别为１５０．０％、８４．０％。提示肝癌的发生是由多种癌基因独立并协同作用伴有细胞异常增殖的恶性转化过程。     

大肠小扁平腺瘤内镜和组织学特征及p53、p21表达研究

[目的]探讨大肠小扁平腺瘤的形态学特征及p53、p21表达的生物学意义。[方法]①用电子结肠镜及光学显微镜观察50例大肠小扁平腺瘤形态学特征。②用免疫组化二步法检测50例小扁平腺瘤及对照组26例大肠癌、15例正常人大肠黏膜中p53、p21表达率。[结果]①小扁平腺瘤发生于大肠任何部位．其发病率依次以横结肠、乙状结肠、直肠为多见；肠镜下见病灶呈圆形或椭圆形，扁平状，基底宽，体积〈1cm。②光镜下小扁平腺瘤呈管状腺瘤样图像，上皮具有不同程度的异型增生。⑧小扁平腺瘤中p53、p21的表达率分别为58％（29／50）、56％（28／50）。随着小扁平腺瘤异型增生程度的增高．p53、p21的表达率也逐渐升高（P〈0．05）。p53、p21在正常肠黏膜、小扁平腺瘤及大肠癌组中阳性表达率均逐渐升高，三组问差异有显著性（P〈0．05）。[结论]大肠小扁平腺瘤有其独特的形态学特征，p53、p21的表达与大肠小扁平腺瘤的癌变发生发展有密切关系。     

转染野生型p53基因对人肺腺癌细胞作用的研究

目的研究外源性野生型p53基因对人肺腺癌细胞系GLC-82的生物学作用.方法将含有野生型p53基因的pDOR-neo逆转录病毒载体,通过Lipofectin转染GLC-82细胞,采用流式细胞分析、电镜下观察、3H-TdR掺入试验、软琼脂培养集落形成率测试及裸小鼠成瘤性实验,观察野生型p53基因对GLC-82细胞的生物学效应.结果电镜下观察可见,转染野生型p53基因可使GLC-82细胞出现一些病理现象,如细胞质中有明显的空泡及线粒体肿胀;流式细胞仪分析结果显示,野生型p53基因可阻止GLC-82细胞周期停止于G1-S区域;3H-TdR掺入试验结果提示野生型p53基因能够抑制GLC-82细胞的DNA合成,软琼脂培养集落形成率减少及裸小鼠成瘤减慢.结论转染野生型p53基因可抑制GLC-82细胞恶性增殖.     

p53在宫颈鳞癌组织中的表达及其意义

目的 通过检测宫颈鳞癌组织p53功能表达状况，观察p53功能表达对宫颈鳞癌预后的影响，以指导治疗。方法 采用western印迹法检测60例宫颈鳞癌组织中p53功能表达。60例宫颈癌患者中位年龄44岁；FIGO分期：Ⅰa期3例，Ⅰb期31例，Ⅱa期10例，Ⅱb期16例。用SPSS10．0统计软件包分析不同的p53功能表达对宫颈鳞癌生物学行为的影响及预后的差异。结果 p53功能表达异常之宫颈鳞癌（16例），其病理分级以Ⅲ级为主（P〈0．01），深肌层浸润及淋巴结转移较p53功能表达正常者（44例）常见（P〈0．01），有50．0％（8／16）的病例在1年内复发（P〈0．01），3年生存率（42．6％）较p53功能表达正常者（78、3％）为低（P〈0、01），平均生存时间（32，93个月）较p53功能表达正常者（60．69个月）明显为短（P〈0．01）。结论 p53功能表达异常者，癌的恶性程度及复发率高，患者的生存期短。     

The predictive value of p53, p53R2, and p21 for the effect of chemoradiation therapy on oesophageal squamous cell carcinoma

The p53 family regulates cell-cycle arrest, triggers apoptosis or is involved in repair of DNA damage. In the present study, we analysed the expression of some p53 family proteins and their responses to chemoradiation therapy (CRT) in cases of oesophageal squamous cell carcinoma (ESCC). We immunohistochemically investigated the relationship between p53, p53R2, and p21 expression in biopsy specimens of untreated primary tumours and their clinical and histological responses to CRT in 62 patients with ESCC. Chemoradiation therapy consisted of 5-fluorouracil plus cisplatin and 40 Gy of radiation. The rates of clinical and histological responses (complete or partial) to CRT were 71.0% (clinical) and 52.8% (histological). The rate of positive expression was 43.5% for p53, 37.1% for p53R2, and 54.8% for p21 expression. Statistically significant correlations were found between p53 or p53R2 expression and favourable response to CRT (P=0.0001 or 0.041 clinical, P=0.016 or 0.0018 histological, respectively). Furthermore, in p53-negative tumours, CRT was more effective in tumours with p53R2 negative expression than those with p53R2 positive expression (P=0.0014). We demonstrated that the negative expression of p53 and p53R2 expression was closely related to the effect of CRT and should predict the CRT outcome in patients with ESCC.