siRNA干扰MT1H基因对A549/DDP细胞耐药性的逆转

目的：探讨siRNA干扰金属硫蛋白1H（metallothionein 1H,MT1H）基因逆转A549/DDP细胞耐药的可行性。方法：采用RT-PCR方法检测MT1H基因在A549和其顺铂耐药株A549/DDP细胞中的表达;将针对MT1H的siRNA导入A549/DDP细胞;用RT-PCR和斑点印迹方法分析MT1H基因表达情况;MTT法观察细胞顺铂耐药性;TUNEL、流式细胞术检测顺铂诱导细胞凋亡率;免疫细胞化学分析凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax的表达。结果：MT1H在A549/DDP细胞中高表达但不在A549细胞中表达;A549/DDP细胞转染48 h后,与对照组比较,MT1HsiRNA转染组MT1H mRNA和蛋白表达均明显下调,细胞对DDP的药物敏感性明显提高,DDP诱导凋亡率明显增加,Bcl-2表达明显下降,Bax表达无变化。结论：MT1H基因沉默能降低Bcl-2表达,增强顺铂对A549/DDP细胞凋亡诱导作用,有效逆转A549/DDP细胞耐药。     

CIK细胞对RNAi沉默PD-L1基因的肺腺癌A549细胞的体外抑制作用

目的:观察沉默肺癌A549细胞的程序性死亡受体1（programmed death ligand 1,PD-L1）基因表达后,CIK细胞对其体外抑癌的作用。方法:分离外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC),加入细胞因子(cytokine,CK),体外细胞因子诱导为杀伤细胞(cytokine induced killer cells,CIK cells)。将已构建的PD-L1 shRNA 重组质粒 pGPU6/PD-L1,应用脂质体转染法转染入A549细胞。RT-PCR法检测PD-L1基因的表达;Western blotting法检测PD-L1蛋白的表达;CCK8法检测CIK细胞对各组A549细胞的杀伤率。结果:成功将pGPU6/PD-L1转染入A549细胞;RT-PCR结果显示pGPU6/PD-L1使A549细胞PD-L1基因表达水平降低;Western blotting 结果显示 pGPU6/PD-L1 转染A549细胞使 PD-L1蛋白表达减少;CCK8结果显示 pGPU6/PD-L1能够增强CIK细胞对A549细胞的体外抑瘤能力。结论:下调肺癌细胞A549的PD-L1 mRNA表达,MTT证明能够增强CIK细胞对其体外杀伤作用。     

上调miRNA-506对肺癌耐药细胞株A549/DDP耐药性的逆转及其机制

目的:探讨微小核糖核酸（miRNA）-506对人非小细胞肺癌顺铂耐药株A549/DDP细胞耐药性的逆转及其可能机制。方法:构建miRNA-506 模拟物,应用脂质体法转染A549/DDP细胞。应用实时逆转录酶链聚合反应（qRT-PCR）法验证各组细胞中miRNA-506的表达情况,CCK8法检测顺铂对细胞的抑制作用。流式细胞术Annexin V／PI双染检测各组细胞的凋亡。Western blot检测MDR1、MRP1、Bcl-2、Bax的蛋白表达。结果:qRT-PCR结果显示,miRNA-506转染组miRNA-506的表达量明显高于对照组（P<0.05）。CCK8结果显示,上调miRNA-506 增强A549/DDP细胞对顺铂的敏感性。流式细胞术结果显示上调miRNA-506 促进顺铂诱导的A549/DDP细胞凋亡。上调miRNA-506可以使A549/DDP细胞MDR1、MRP1和Bcl-2蛋白的表达下降,使Bax蛋白的表达升高。结论:上调miRNA-506能逆转A549/DDP细胞对顺铂的耐药,这一过程可能通过miRNA-506调控多药耐药蛋白和凋亡相关蛋白实现。     

重组凋亡素诱导人卵巢癌细胞顺铂耐药株凋亡

[目的]探讨凋亡素基因（VP3）在卵巢癌细胞株CoC1及CoC1细胞耐药亚株CoC1/DDP中的诱导凋亡情况。[方法]构建重组凋亡素真核表达载体pcDNA3.1-VP3。在体外将pcDNA3.1-VP3转染入卵巢癌细胞株CoC1及CoC1细胞耐药亚株CoC1/DDP中,RT-PCR检测凋亡素在细胞中的表达,用流式细胞仪检测细胞凋亡。[结果]RT-PCR证实VP3基因在CoC1及CoC1/DDP中存在并在转录水平表达。转染pcDNA3.1-VP3细胞凋亡率明显高于转染空质粒组（P〈0.01）,转染pcDNA3.1-VP3细胞凋亡率CoC1/DDP细胞明显高于CoC1细胞（P〈0.01）。[结论]凋亡素诱导人卵巢癌细胞CoC1和CoC1顺铂耐药亚株CoC1/DDP凋亡,且更易诱导CoC1顺铂耐药亚株CoC1/DDP细胞的凋亡。     

Fascin真核表达载体的构建及其在肺癌A549细胞中的表达

目的:构建fascin基因的pcDNA3.1(+)表达载体pcDNA3.1(+)-fascin,将其转染肺癌A549细胞,观察其表达,并检测转染前后细胞内F-肌动蛋白(F-actin)的变化。方法:应用RT-PCR从Hela细胞中扩增fascin基因,酶切后和真核表达载体pcDNA3.1(+)重组,获得重组表达载体pcDNA3.1(+)-fascin。经酶切、电泳,DNA测序鉴定后,将其及对照空载体转染肺癌A549细胞,采用Western blotting检测fascin在A549细胞中的表达情况;免疫荧光染色后采用激光共聚焦显微镜观察fascin对F-actin的影响。结果:成功克隆fascin基因片段,并将其重组到pcDNA3.1(+)载体中,经酶切及DNA测序鉴定正确。pcDNA3.1(+)-fascin转染A549细胞,Western blotting鉴定转染后fascin在A549细胞中高表达。激光共聚焦显示fascin基因能够在A549细胞内促进F-actin形成丝状突出。结论:成功构建了pcDNA3.1(+)-fascin真核表达载体,并将其转染肺癌A549细胞;激光共聚焦观察显示fascin能够促进A549细胞内F-actin形成丝状突出,可能是促进A549细胞转移的结构基础之一。     

Fascin真核表达载体的构建及其在肺癌A549细胞中的表达

目的：构建fascin基因的pcDNA3.1（＋）表达载体pcDNA3.1（＋）-fascin,将其转染肺癌A549细胞,观察其表达,并检测转染前后细胞内F-肌动蛋白（F-actin）的变化。方法：应用RT-PCR从Hela细胞中扩增fascin基因,酶切后和真核表达载体pcDNA3.1（＋）重组,获得重组表达载体pcDNA3.1（＋）-fascin。经酶切、电泳,DNA测序鉴定后,将其及对照空载体转染肺癌A549细胞,采用Western blotting检测fascin在A549细胞中的表达情况;免疫荧光染色后采用激光共聚焦显微镜观察fascin对F-actin的影响。结果：成功克隆fascin基因片段,并将其重组到pcDNA3.1（＋）载体中,经酶切及DNA测序鉴定正确。pcDNA3.1（＋）-fascin转染A549细胞,Western blotting鉴定转染后fascin在A549细胞中高表达。激光共聚焦显示fascin基因能够在A549细胞内促进F-actin形成丝状突出。结论：成功构建了pcDNA3.1（＋）-fascin真核表达载体,并将其转染肺癌A549细胞;激光共聚焦观察显示fascin能够促进A549细胞内F-actin形成丝状突出,可能是促进A549细胞转移的结构基础之一。     

SOX4对非小细胞肺癌细胞A549的顺铂耐药作用的影响

背景与目的 肺癌是最严重的恶性肿瘤之一,其中非小细胞肺癌发病率在肺癌中居首位.部分患者对顺铂耐受是导致化疗失败的主要原因.SOX4是转录调节因子,在多种肿瘤的发生发展过程中发挥着重要的作用,通过调控β-catenin的表达对Wnt信号通路进行调控.本研究旨在探讨SOX4对非小细胞肺癌细胞A549的顺铂耐药作用的影响.方法 体外诱导法建立顺铂耐药的肺癌细胞株A549/DDP,CCK8法检测A549及A549/DDP细胞对顺铂的耐药性.绘制A549与A549/DDP细胞生长曲线.Western blot检测耐药细胞株中SOX4的蛋白表达水平.CCK8法检测敲减SOX4后耐药细胞株A549/DDP对顺铂耐药性.实时定量PCR和免疫印迹法检测敲减SOX4后A549/DPP细胞中β-catenin和Survivin蛋白的表达.结果 成功构建非小细胞肺癌顺铂耐药细胞株A549/DDP,其耐药性是亲本细胞的13.7倍,差异有统计学意义(P<0.001).生长曲线显示耐药细胞株与亲本细胞增殖速度没有统计学差异(P<0.05);与A549细胞相比,耐药细胞A549/DDP细胞中SOX4的表达显著增高(P<0.001).敲减SOX4后,A549/DDP细胞的耐药性显著降低;敲减SOX4后,A549/DDP细胞中β-catenin和Survivin的mRNA和蛋白表达水平显著降低.结论 SOX4的表达水平影响非小细胞肺癌细胞A549对顺铂的耐药性.     

NDV-HN致人肺腺癌A549细胞凋亡的实验研究

摘 要：［目的］ 探讨NDV-HN诱导人肺腺癌A549细胞凋亡的相关机制。［方法］ （1）构建包含绿色荧光素蛋白（GFP）及NDV-HN的慢病毒sfGFP-HN载体,用293V细胞包装慢病毒Lv-sfGFP-HN,用293V细胞进行空载质粒转染组（空载组）慢病毒包装,命名为Lv-sfGFP;（2）以空载组A549-sfGFP细胞和空白组A549为对照,用慢病毒转染方法建立稳定表达NDV-HN蛋白的A549细胞株,即A549-sfGFP-HN细胞株,RT-PCR、Western blot检测A549细胞NDV-HN蛋白的表达;（3）分别在A549-sfGFP-HN和A549两组细胞中加入顺铂,流式细胞术检测细胞凋亡;（4）在基因水平和蛋白水平上分别用RT-PCR和Western blot检测各组细胞凋亡相关蛋白Bcl-2的表达。［结果］ （1）Lv-sfGFP-HN和Lv-sfGFP慢病毒分别转染A549细胞后,只在转染组A549-sfGFP-HN细胞检测到NDV-HN蛋白。（2）转染组A549-sfGFP-HN细胞凋亡率明显高于空白组A549细胞 (P＜0.01),转染组A549-sfGFP-HN细胞加入顺铂后,其细胞凋亡率明显增加。（3）转染组A549-sfGFP-HN细胞与空载质粒转染组A549细胞和空白组A549细胞相比,凋亡相关蛋白Bcl-2表达量明显下调(P＜0.01)。［结论］ 慢病毒转染NDV-HN到A549细胞后导致A549-sfGFP-HN细胞出现凋亡,且与Bcl-2下调有关。转染NDV-HN的肺癌细胞联合使用抗癌药物顺铂,增加了肺癌细胞凋亡率。     

过表达miR-205对顺铂诱导的肾上腺皮质癌细胞株SW-13凋亡的影响及其机制

目的 研究过表达miR-205对顺铂（cisplantin,CDDP）诱导的肾上腺皮质癌细胞株SW-13凋 亡的影响及其机制。方法 设转染pcDNA3.1( + )-miR-205的SW-13细胞和转染 pcDNA3.1( + )的SW-13 细胞分别为实验组和对照组。在不同浓度顺铂作用下,采用CCK-8法比较两组细胞对CDDP敏感度; H33342及AnnexinV-FITC/PI荧光观察细胞凋亡,AnnexinV-PE/7AAD荧光流式细胞术检测细胞凋亡 率;用Western blot检测目的蛋白的表达水平;qPCR检测相关基因mRNA水平的变化。结果 不同浓度 顺铂作用下,实验组细胞生长抑制率、凋亡率明显高于对照组（P＜0.01,P＜0.05）;在0、20、30 μg/ml浓度的CDDP处理后,实验组促凋亡蛋白Bax、Caspase-9以及E2F1和VEGF-A mRNA水平较对照 组升高,而抗凋亡蛋白Bcl-2表达则降低。结论 上调SW-13细胞miR-205可降低E2F1、VEGF-A的表 达水平,促进顺铂诱导细胞的凋亡,增强肾上腺皮质癌细胞对顺铂的敏感度。     

人基因BAG-1高表达载体的构建及其对肺腺癌细胞放射敏感度的影响

目的通过构建BAG-1高表达载体来研究BAG-1在肺腺癌细胞放射敏感度中的作用。方法提取人肺癌A549细胞中总RNA,通过RT-PCR扩增BAG-1基因,构建pcDNA3.1-BAG-1表达载体,转染肺癌细胞A549,通过Western blot筛选出BAG-1高表达A549细胞株。通过克隆形成实验,研究BAG-1对肺腺癌细胞放射敏感度的影响。结果成功构建pcDNA3.1-BAG-1载体;筛选出BAG-1高表达A549细胞株;BAG-1高表达降低肺腺癌细胞放射敏感度。结论BAG-1高表达参与放射抵抗,有望成为肿瘤治疗的新靶点。     

miRNA-451逆转非小细胞肺癌A549/DDP细胞对顺铂的耐药性及其机制研究

目的:探讨microRNA-451(miR-451)逆转非小细胞肺癌A549/DDP细胞对顺铂的耐药性及其可能的作用机制.方法:应用实时荧光定量PCR法(real-time fluorescent quantitative PCR,qRT-PCR)检测耐DDP细胞株A549/DDP及其亲本细胞株A549中miR-451的表达差异,同时检测A549/DDP细胞转染miR-451 mimic后miR-451表达的变化;分别应用MTT法、克隆形成实验、流式细胞术检测转染后A549/DDP细胞对DDP药物敏感度,细胞增殖能力,联合DDP处理后细胞凋亡变化;Western印迹法检测转染后A549/DDP细胞Akt、p-Akt( Ser473)、bcl-2和bax的表达变化.结果:miR-451在耐DDP细胞株A549/DDP中的表达量显著低于敏感细胞株A549 (P ＜0.05),A549/DDP细胞转染miR-451 mimic24h后,细胞中miR-451的表达水平较对照组明显提高(P＜0.05).在A549/DDP细胞中过表达miR-451可产生以下效应:相较于对照组,DDP对A549/DDP/miR-451细胞的半数抑制浓度(half inhibition concentration,IC50)减低(P＜0.05),A549/DDP/miR-451细胞的增殖能力减弱,A549/DDP/miR-451经过DDP处理后细胞凋亡增多(P＜0.05).Western印迹法结果显示,与对照组比较,转染miR-451 mimic的A549/DDP细胞p-Akt ( Ser473)、bcl-2表达水平降低;bax表达水平升高.结论:miR-451可能通过诱导细胞凋亡,抑制细胞增殖,上调bax蛋白及下调p-Akt( Ser473)、bcl-2蛋白表达而逆转A549/DDP细胞对DDP的耐药性.     

地塞米松联合顺铂对肺腺癌 A549 细胞增殖和凋亡的影响

目的：探讨地塞米松（dexamethasone,DEX）联合顺铂（cisplatin,DDP）在体外对肺腺癌2,549细胞增殖和凋亡的影响及可能的机制。方法：体外培养人肺腺癌A549细胞。MTF法检测DDP和DEX对A549细胞增殖的影响。流式细胞术分析细胞周期及细胞凋亡。Westernblot检测DEX和DDP对A549细胞内VDR表达水平的影响。结果：地塞米松≥500nmol／L浓度时对A549细胞有一定的增殖抑制作用（P〈0．05）;〈500nmol／L浓度时对A549细胞无明显抑制作用（P〉0．05）;DDP浓度在0．3125-10ug／ml范围内对A549细胞增殖有明显的抑制作用,并呈浓度及时间依赖性（P〈0．05）。流式细胞仪检测到DDP＋DEX组的G．期细胞比例下降,s期比例上升（P〈0．05）,且细胞凋亡数目增加（P〈0．05）。Westernblot观察到DDP＋DEX组VDR表达水平明显升高（P〈0．05）。结论：DEX可能通过上调A549细胞内VDR表达水平,与顺铂协同促进细胞凋亡、诱导细胞周期阻滞,进而提高顺铂化疗敏感性。     

miRNA-192对非小细胞肺癌A549／DDP细胞顺铂耐药性的影响

目的 探讨抑制microRNA-192（miR-192）在非小细胞肺癌A549／DDP细胞对顺铂（DDP）耐药性方面的影响及可能机制。方法 通过实时荧光定量PCR（qRT-PCR）法检测人肺腺癌耐DDP细胞株A549／DDP及其亲本细胞株A549细胞中miR-192的表达水平,A549／DDP细胞转染miR-192抑制剂（inhibitor）和miR-阴性对照（NC）48h后采用qRT-PCR检测转染效率,分别采用MTT法、克隆形成实验及流式细胞术检测转染48h后A549／DDP细胞对DDP的药物敏感性、细胞增殖能力及细胞凋亡变化,Western blotting检测转染48h后细胞中Bax和Bcl-2的表达变化。结果 miR-192在A549／DDP细胞中的表达水平高于A549细胞（P＜0.05）;转染miR-192 inhibitor 48h后的A549／DDP细胞miR-192水平低于转染miR-NC者（P＜0.05）;转染miR-192 inhibitor后,A549／DDP细胞的增殖能力减弱、凋亡细胞增多、DDP对其半数抑制浓度降低、Bax蛋白水平升高和Bcl-2蛋白水平下降,与转染miR-NC者比较,差异均有统计学意义（P＜0.05）。结论 抑制miR-192能够降低A549／DDP细胞对DDP的耐药性,其作用机制可能是通过增加细胞凋亡以及下调Bcl-2蛋白和上调Bax蛋白表达来实现的。     

5-氮杂-2’-脱氧胞苷联合低浓度顺铂对肺癌细胞增殖影响的实验研究

目的 探讨5-氮杂-2’-脱氧胞苷（5-Aza-CdR）与低浓度顺铂（DDP）联合用药对非小细胞肺癌（NSCLC）A549细胞增殖的影响。方法 选择1μmol／L DDP、10μmol／L 5-Aza-CdR及两者联合分别处理体外培养的A549细胞,MTT法检测处理前后的细胞增殖活性,流式细胞仪、Hoechst 33258染色分别观察处理前后的细胞周期、凋亡率及凋亡形态学变化。结果 MTT法显示,与单独1μmol／L DDP组比较,联合组能够明显抑制A549细胞的增殖,A549细胞的凋亡率亦明显增加;流式细胞仪显示,联合组作用于细胞G0／G1期,使A549细胞生长阻滞在此期,细胞的增殖指数降低;与单独1μmol／L DDP组比较,联合组A549细胞的凋亡形态学改变更明显。结论5-Aza-CdR联合低浓度DDP能够明显抑制NSCLC A549细胞的增殖和诱导A549细胞的凋亡。     

顺铂诱导A549细胞凋亡的研究

目的 探讨顺铂诱导肺癌细胞凋亡的规律，机制以及在肿瘤化疗中的作用。方法 应用形态学观察，琼脂糖凝胶电泳，原位DNA断裂点的末端标记法和流式细胞仪分析技术，检测顺铂诱导A549细胞的凋亡作用。结果 3mg/L顺铂诱导的细胞凋亡在12-72h持续存在并逐渐增强，呈时间依赖性；顺铂浓度分别为1、3、5、7mg/L时均诱导了细胞凋亡，呈浓度依赖性，在顺铂作用下，细胞被阻滞于G1期。结论 诱导细胞凋亡可能是顺铂抗肿瘤作用的重要机制。     

miRNA-223对非小细胞肺癌A549／DDP细胞顺铂耐药性的影响

目的 探讨microRNA-223（miR-223）在非小细胞肺癌（NSCLC）A549／DDP细胞对顺铂（DDP）耐药性方面的影响及可能机制。方法 采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测DDP耐药肺腺癌细胞株A549／DDP及其亲本细胞株A549中miR-223的水平,将A549／DDP细胞分为3组：对照组、空转染组（转染无关序列）和抑制组（转染miR-223 inhibitor）,于转染24、48、72及96 h后分别采用qRT-PCR和CCK-8法检测转染效果及细胞增殖情况,CCK-8法评价转染后A549/DDP细胞对DDP的药物敏感性变化,采用流式细胞术检测转染48 h后的细胞凋亡和细胞周期情况,Western blotting检测转染48 h后耐药基因蛋白P 糖蛋白（P-gp）、多药耐药相关蛋白1（MRP1）及肺耐药相关蛋白（LRP）的表达。结果 A549／DDP细胞中的miR-223水平较高,为A549细胞的（7.14±0.26）倍（P＜0.05）;抑制组转染后的miR-223水平降低,转染96 h后的miR-223水平分别降至对照组的（67.15±2.84）％和空转染组的（65.80±3.47）％,差异均有统计学意义（P＜0.05）;与对照组相比,抑制组转染后的增殖抑制率、凋亡率及G0／G1期细胞比例均升高,而S和G2／M期细胞比例及3种耐药基因蛋白水平均降低,以上差异均有统计学意义（P＜0.05）。DDP对抑制组细胞的半数抑制浓度（IC50）值为（15.67±1.30） μg／ml,低于对照组的（33.71±2.61） μg／ml（P＜0.05）。结论 miR-223可增加A549／DDP细胞对DDP的耐药性,可能与耐药基因蛋白表达上调有关;降低miR-223水平可抑制A549／DDP细胞增殖、诱导凋亡及细胞周期阻滞,并下调耐药蛋白的表达,从而增加A549/DDP细胞对DDP的敏感性。     

灭活细胞周期检测点激酶基因对顺铂诱导肺癌细胞凋亡的影响

目的 观察顺铂(DDP)作用下肺癌A549细胞系的细胞周期和凋亡的动力学特点,以及灭活细胞周期检测点激酶1(Chk1)和细胞周期检测点激酶2(Chk2)基因对DDP诱导的肺癌细胞凋亡的影响.方法 优化转染条件后,将肺癌A549细胞分为8组进行转染,分别为正常组(未经任何处理的A549细胞)、对照组(A549细胞接受10 μmol/L的DDP作用12 h)、转染Chk1正义寡核苷酸链(sODN)组、转染Chk1反义寡核苷酸链(AsODN)组、转染Chk2 sODN组、转染Chk2 AsODN组、联合转染Chk1和Chk2 sODN组以及联合转染Chk1和Chk2 AsODN组,其中后6组转染24 h后再以10 μmol/L的DDP处理12 h.采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot法,检测转染Chk1或Chk2 sODN、AsODN后,A549细胞中Chk1或Chk2 mRNA和蛋白的表达.采用流式细胞仪Annexin V-FITC法和Sub-G1法,检测转染Chk1和(或)Chk2 sODN、AsODN后,DDP作用下A549细胞的细胞周期和凋亡变化.结果 10μmol/L的DDP作用12 h后,非同步化处理的A549细胞出现了明显的S期阻滞现象.转染24 h后,Chk1或Chk2 AsODN可明显抑制A549细胞中Chk1 mRNA和蛋白或Chk2 mRNA和蛋白的表达.与单独转染Chk1或Chk2 sODN组相比,单独转染Chk1或Chk2 AsODN组DDP诱导下A549细胞的凋亡率约提高了1～2倍(P＜0.05);但联合转染Chk1和Chk2 AsODN组与单独转染Chk1 AsODN或Chk2 AsODN组相比,A549细胞凋亡率的差异无统计学意义(P=0.521和P=0.339).结论 灭活Chk1和Chk2基因引起化疗增敏的机制可能是通过解除S期阻滞这种肿瘤细胞的自我保护机制实现的,Chk1和Chk2基因可作为肺癌化疗药物增敏治疗的有效靶点.