食管鳞癌组织hPOT1和hTERT的表达及其相关因素的研究

目的:探讨人端粒保护蛋白(hPOT1)、端粒酶逆转录酶(hTERT)在食管病变中的表达及其临床意义.方法:采用免疫组化ABC法检测60例食管鳞状细胞癌、30例食管上皮内瘤变和20例食管正常组织中hPOT1和hTERT的表达.分析其间的相关性,并探讨与食管癌,临床病理特征之间的关系.结果:食管鳞癌组织中,hPOT1和hTERT的阳性率分别为93.3%和83.3%,较上皮内瘤变组(23.3%,40%)及正常上皮组(40%,0)显著增加,P=0.00.hPOT1和hTERT的表达与肿瘤浸润深度、淋巴结转移和TNM分期呈正相关,且hPOT1和hTERT在食管鳞状细胞癌的表达呈一定的正相关,P=0.003.结论:hPOT1和hTERT在食管癌组织中表达异常增高,提示hPOT1和hTERT与食管癌的发生、发展有密切的关系.     

hTERT原核重组质粒的表达

目的本课题拟观察原核重组质粒pGEX-4T-1-hTERT在BL21细菌中的表达，为进一步探讨以hTERT为靶点的肿瘤基因免疫治疗提供实验依据。方法IPTG诱导带有pGEX-4T-1-hTERT质粒的BL21细菌融合蛋白的表达，取不同时间的培养物进行SDS—PAGE分析，并进行薄层凝胶光密度扫描测定目的蛋白表达量，同时对表达产物进行Western—blot检测。结果对SDS-PAGE结果分析发现，含pGEX-4T-1-hTERT质粒的BL21细菌能够表达出63kD的融合蛋白。薄层凝胶光密度扫描测定其表达水平最高为28．4％，以IPTG诱导4h表达量最高。Western—blot检测表明该融合蛋白可被hTERT多抗识别。结论诱导pGEX-4T-1—hTERT重组质粒，获得分子量为63kD的GST-hTERT融合蛋白。用抗hTERT目的基因片段表达的相应抗原蛋白。     

食管黏膜上皮癌变过程中PTEN、PCNA的表达及意义

目的 探讨食管黏膜上皮癌变过程中PTEN、PCNA表达及相互关系。方法 对128例正常食管黏膜、单纯增生、非典型增生、食管癌切除标本，采用S—P免疫组化染色法检测PTEN、PCNA表达情况。结果 随食管上皮增生程度加重，PTEN阳性表达含量渐减，PCNA表达递增，食管癌与其他组间差异显著(P＜0．05)；PTEN、PCNA阳性表达呈显著负相关(P＜0．01)。结论 食管黏膜上皮癌变过程中PTEN有明显缺失现象，与细胞增殖有密切关系。     

食管上皮癌变过程中cyclin E和p21WAF1的表达及其意义

目的研究细胞周期调控因子cyclinE和p21^WAF1基因在食管上皮癌变过程中的表达及其意义。方法应用免疫组化S—P方法和原位杂交方法分别检测48例食管癌组织和相应癌旁组织(正常黏膜17例，非典型增生组织31例)中cyclinE和p21^WAF1蛋白及mRNA表达。结果从食管正常黏膜到非典型增生组织和癌组织，cyclinE蛋白和mRNA阳性表达率皆呈逐渐升高的趋势，食管癌组织和癌旁组织之间差异有显著性。高分化鳞癌中蛋白阳性表达率显著高于其它各组，mRNA阳性表达率显著高于正常黏膜和非典型增生Ⅰ级。p21^WAF1蛋白及mRNA在癌旁组织和癌组织中表达皆较高，两者差异无显著性。cyclinE和p21^WAF1基因表达无显著相关性。结论食管癌变过程中，细胞周期蛋白cyclinE表达水平增高，和组织分化程度显著相关，其异常是食管癌变过程中的早期事件，可能作为食管高分化鳞癌的诊断标志物之一。p21^WAF1基因在食管癌组织中高表达，可能与细胞周期调控的反馈机制有关。     

食管黏膜上皮癌变过程中PTEN、PCNA的表达及意义

目的　探讨食管黏膜上皮癌变过程中PTEN、PCNA表达及相互关系。方法　对 12 8例正常食管黏膜、单纯增生、非典型增生、食管癌切除标本 ,采用S -P免疫组化染色法检测PTEN、PCNA表达情况。结果　随食管上皮增生程度加重 ,PTEN阳性表达含量渐减 ,PCNA表达递增 ,食管癌与其他组间差异显著 (P <0 0 5 ) ;PTEN、PCNA阳性表达呈显著负相关 (P <0 0 1)。结论　食管黏膜上皮癌变过程中PTEN有明显缺失现象 ,与细胞增殖有密切关系     

胃癌hTERT、Syk表达与分子边界的临床研究

目的探讨胃癌及其切缘组织中hTERT、Syk表达及其分子边界与手术切缘的安全性关系。方法应用免疫组化方法检测39例胃癌标本及其切缘组织中的hTERT、Syk的表达。结果（1）hTERT在胃癌组织中阳性表达率为69.2%,近端切缘距癌肿4 cm的阳性表达率为0,远端切缘距癌肿3 cm的阳性率为0。（2）Syk在胃癌的阳性表达率为5.1%,肿瘤旁正常胃黏膜组织中表达率为100.0%。（3）hTERT的阳性表达从癌中心向胃癌周边切缘组织逐渐递减,而Syk则相反,在近端切缘癌中心与癌旁3 cm、4 cm处比较差异有统计学意义（P〈0.05）,在远端切缘癌中心与癌旁2 cm、3 cm处比较差异有统计学意义（P〈0.05）。结论hTERT和Syk在胃癌及其周边组织中存在着分子边界,距胃癌中心近端4 cm及远端3 cm是hTERT、Syk的分子边界。     

hTERT原核重组质粒的表达

目的本课题拟观察原核重组质粒pGEX4T1hTERT在BL21细菌中的表达,为进一步探讨以hTERT为靶点的肿瘤基因免疫治疗提供实验依据。方法IPTG诱导带有pGEX4T1hTERT质粒的BL21细菌融合蛋白的表达,取不同时间的培养物进行SDSPAGE分析,并进行薄层凝胶光密度扫描测定目的蛋白表达量,同时对表达产物进行Westernblot检测。结果对SDSPAGE结果分析发现,含pGEX4T1hTERT质粒的BL21细菌能够表达出63kD的融合蛋白。薄层凝胶光密度扫描测定其表达水平最高为28.4%,以IPTG诱导4h表达量最高。Westernblot检测表明该融合蛋白可被hTERT多抗识别。结论诱导pGEX4T1hTERT重组质粒,获得分子量为63kD的GSThTERT融合蛋白。用抗hTERT目的基因片段表达的相应抗原蛋白。     

Survivin在食管鳞癌组织中的表达及其意义

目的：探讨Survivin在食管鳞癌中的表达及其临床意义。方法：采用免疫组织化学检测47例食管鳞癌组织和10例正常食管黏膜的Survivin蛋白的表达，探讨其与食管鳞癌临床病理特征及预后之间的关系。结果：Survivin阳性表达定位于肿瘤细胞胞浆内。47例食管鳞癌组织Survivin阳性表达率为93．6％。在正常食管黏膜无阳性表达。Survivin表达水平与组织学分化程度有相关关系，高分化鳞癌中低表达者居多，而中分化鳞癌中高表达者居多，二者呈负相关（P〈0．05）。总体生存率单因素分析显示Survivin高表达组生存预后明显差于低表达组，有显著性意义（P〈0．05）。Logistic多因素回归分析显示Survivin表达水平为独立预后因素（P〈0．05）。Survivin表达水平与食管癌治疗失败（手术后3年内复发和转移死亡）有明显相关关系，高表达组发生治疗失败的病例明显增多（P〈0．01）。结论：Survivin表达水平与组织学分化程度有相关关系，为食管癌的独立预后因素；Survivin高表达预示食管癌治疗失败的机会增大。     

口腔颌面部肉瘤中hTERT蛋白的表达

目的 探讨口腔颌面部肉瘤中hTERT蛋白表达的生物学意义。方法 应用免疫组化方法检测37例口腔颌面部肉瘤和14例良性间叶组织肿瘤中hTERT蛋白的表达情况。结果 口腔肉瘤中hTERT蛋白的阳性表达率明显高于良性肿瘤（P〈0．05）,并随肉瘤分化程度的降低而呈升高趋势,其中低度恶性肉瘤与高度恶性肉瘤比较差异有统计学意义（P〈0．05）。hTERT蛋白表达与肉瘤复发密切相关（P〈0．05）,发生淋巴结转移或远处转移的肉瘤中hTERT蛋白表达虽明显升高,但无统计学意义（P〉0．05）。结论 hTERT蛋白表达与口腔颌面部肉瘤的临床病理特征密切相关,表明hTERT基因在口腔颌面部肉瘤发生发展过程中可能起重要作用。     

Expression of a mutant hTERT in human bladder carcinoma cell line T24 and its clinical significance

Objective: To construct a mutant pEGFP- hTERT expression vector, to observe its steady expression in transfected human bladder carcinoma cell line T24 and its role in molecular regulatory mechanisms of telomerase, and to provide a new target gene for bladder cancer. Methods:PCR amplification was performed by using primers based on the known gene sequence of hTERT. PCR production was cloned into plasmid pGEMT-T easy and the sequence of mutant hTERT gene was analyzed. A recombinant mutant hTERT vector (pEGFP-hTERT) was constructed at the EcoR I and Sa/I sites of the pEGFP-C1 vector. After transfecting the fusion gene into bladder carcinoma cell line T24 by calcium phosphate-DNA coprecipitation, the steady expression of GFP-hTERT fusion protein was tested by fluorescent light microscopy. The proliferation changes of bladder carcinoma cell line T24 were detected by light microscopy and senescence correlated [3-galactosidase staining. Results: Identification of pEGFP-hTERT by enzyme digestion showed that mutant hTERT fragment had been cloned into EcoR I and Sal I sites of the pEGFP-C1 vector. The steady expression of GFP-hTERT fusion protein was localized in the nucleus of transfected cells. Expression of senescence-associated ~-galactosidase in transfected cells gradually increased with extended cultured time and cell growth was suppressed. Conclusion: The mutant-type hTERT gene suppresses the proliferation of bladder carcinoma cell line T24 by competitive effect on telomerase activity. This suggests that hTERT gene might be a suitable gene target for bladder cancer therapy.     

食管鳞癌端粒酶活性、端粒酶逆转录酶及bcl-X/L表达的研究

目的：探讨食管鳞癌组织中端粒酶活性、端粒酶逆转录酶（hTERT)及bcl-X/L的表达及其它们之间的关系。方法：应用TRAP－银染法检测45例食管鳞癌组织的端粒酶活性，采用原位杂交及免疫组织化学方法对癌组织进行了hTERT及bcl-X/L表达的检测。结果：癌组织端粒酶活性阳性率为82．2％，hTERT及bcl-X/L的表达阳性率分别为64．4％及71．1％，bcl-X/L的蛋白表达及hTERT的mRNA表达与端粒酶活性均有相关性。结论：食管鳞癌组织中端粒酶活性、hTERT及bcl-X/L的表达阳性率均较高。hTERT及bcl-X/L的表达对端粒酶活性有一定调节作用。     

hTERT转录调控区克隆及在人癌细胞的转录特异性分析

目的　通过克隆人癌细胞中端粒酶逆转录酶 (hTERT)基因上游转录调控区并观察其在不同人癌细胞和正常细胞中的转录活性 ,探讨人hTERT基因在细胞癌变中的激活机制。方法　用PCR方法克隆HeLa和PG癌细胞hTERT基因转录调控区 ,并进行DNA序列测定 ;将转录调控区重组于荧光酶报告载体 ,瞬时转染人癌细胞HeLa、PG、2 93和正常人二倍体细胞 2BS后 ,测定荧光酶活性以确定调控区转录活性。结果　于人HeLa和PG癌细胞分别克隆hTERT基因转录起始点附近 6 36bp(- 5 31～ 90 )和 95 0bp(- 5 31～ 40 4 )的转录调节区 ,其序列与GenBank人hTERT启动子序列相同。将两转录调控区分别重组于荧光酶报告载体pGL2 ,得到pGL2 6 36和pGL2 95 0 ,并同时构建了pGL2 X(- 5 31～ - 2 72 )和pGL2 S (第一内含子区 )。瞬时转染细胞后发现 :pGL2 6 36和pGL2 95 0在癌细胞中的转录活性明显增高 ,而在人二倍体 2BS细胞中几无转录活性。重组体pGL2 S和pGL2 X在端粒酶阳性肿瘤细胞中的转录活性明显降低 ,pGL2 S的转录活性略高于pGL2 X。结论　人HeLa和PG癌细胞中hTERT转录调控区无基因突变并高度保存 ;hTERT调控区具有癌细胞特异性转录调节活性 ,表明hTERT转录水平的激活与端粒酶阳性及细胞癌变密切相关 ;hTERT上游 2 72为其核心     

去甲斑蝥素对食管癌细胞株Eca-109中hTERT的表达和PTPRO基因启动子甲基化影响的实验研究

目的 探索去甲斑蝥素（NCTD）诱导食管癌细胞Eca-109对人端粒酶逆转录酶（hTERT）表达和受体O型蛋白酪氨酸磷酸酶（PTPRO）基因启动子甲基化的影响。方法 MTT比色法检测不同浓度（0、1、2、4、8、16 μg／ml） NCTD及不同作用时间（12、24 h）对食管癌细胞Eca-109增殖的影响;TUNEL法配合激光共聚焦扫描显微镜检测NCTD+Eca-109组（实验组）和Eca-109组（对照组）细胞凋亡情况;甲基化特异性PCR（MSP）检测实验组和对照组中PTPRO基因启动子的甲基化状态,Western blotting检测实验组和对照组hTERT蛋白的表达。结果 MTT检测显示,NCTD 可抑制Eca-109细胞增殖,呈时间和浓度依赖性,不同作用时间和浓度的细胞增殖抑制率的差异有统计学意义（P＜0.05）;TUNEL法结合激光共聚焦扫描显微镜观察显示,实验组细胞内部结构发生剧烈的变化,较对照组细胞核染色质致密浓染,核形缩小;MSP检测显示,对照组PTPRO基因启动子发生明显甲基化;Western blotting检测显示,实验组hTERT蛋白表达较对照组明显降低（P＜0.05）。结论 NCTD对食管癌细胞Eca-109有细胞毒性,能够抑制细胞生长,其机制可能与下调hTERT蛋白表达和PTPRO基因启动子去甲基化有关。     

非小细胞肺癌端粒酶催化亚基hTERT mRNA测定及其临床意义

[目的]阐明非小细胞肺癌(NSCLC)端粒酶催化亚基hTERT与TNM分期的关系并探究其与多药耐药相关基因蛋白MRP,LRP的关系。[方法]对50例NSCLC手术切除标本进行以下测定 :以RT_PCR和免疫酶标法(ELISA)检测肺癌手术标本中端粒酶活性 ;应用PCR和定量放射端粒扩增法 (TRAP)检测hTERT活性 ,并对其灰度扫描以定量测定hTERT;以RT-PCR检测冰冻肺癌组织的MRP和LRP的mRNA水平。[结果]50例NSCLC中端粒酶阳性率为84% (42/50) ,hTERT阳性率为78%(39/50) ,两者之间呈较好的相关性 (P<0.001)。端粒酶阳性组hTERT定量值为136.98±53.63;端粒酶阴性组定量值为15.50±43.84,有显著性差异(P<0.05)。MRP的阳性率为42% (21/50) ;LRP为68% (34/50)。hTERT定性 ,定量表达与MRP呈强相关而与LRP无关。不同的肿瘤细胞病理类型或T分期之间 ,hTERT的定性和定量表达无显著差异。不同N分期者hTERT定量值有显著差异。而hTERT阳性率定性测定差异未达到统计学意义。不同TNM分期的hTERT的定量表达有明显差异。不同分化程度之间端粒酶活性、hTERT的定性和定量表达差异均无统计学意义。[结论]NSCLC的hTERT定量和定性表达与端粒酶之间均有很好的相关性和一致性。hTERT表达水平的高低与NSCLCTNM分期及淋巴结转移有关。hTERT与MRP有相关性