β-防御素2研究进展

防御素是一类分子量约为4．0～5．0kMr、含有6个半胱氨酸残基、三对二硫键的阳离子多肽。防御素不仅通过直接杀菌作用抵御入侵机体的病原微生物，还在介导获得性免疫反应、调节机体的免疫炎症反应和创伤修复过程中起着重要作用。β-防御素2是人体中第一个被发现的可诱导性防御素，因此，β-防御素2的基因表达调控、生物学活性、与皮肤／肺部疾病发生发展相关性等方面的研究较为深入。采用重组DNA技术从原核表达体系、真核表达体系中获取具有生物学活性的β-防御素2多肽，并研究其在呼吸道细菌感染、脓毒症所致肺损伤／肺功能障碍发生发展中的保护作用，将有助于阐明β-防御素2在免疫相关疾病中的作用，有助于阐述肺损伤／呼吸功能障碍发生发展的机制与防治。     

白细胞介素-10对人外周血白细胞β-防御素2基因诱导性表达的影响

目的:探讨炎症抑制因子白细胞介素-10(白介素-10)在β-防御素2(hBD-2)基因诱导性表达中的作用。方法:22例健康人被纳入本研究中,以终浓度0 ng/m l的LPS、100 ng/m l的LPS、10ng/m l的IL-10、100 ng/m l的LPS+10 ng/m l的IL-10加入900μl人外周血中,于37℃刺激培养6 h后,提取外周血白细胞总RNA,用实时定量RT-PCR的方法测定外周血白细胞hBD-2mRNA的表达水平。结果:0 ng/m l的LPS或10 ng/m l的IL-10刺激6 h的白细胞中未检测到hBD-2 mRNA,100 ng/m l的LPS刺激6 h后hBD-2mRNA的表达水平为166.9±35.14,而IL-10与LPS共同刺激6 h后hBD-2 mRNA的表达水平为30.40±9.18。IL-10使hBD-2mRNA的诱导性表达水平明显降低(P<0.05)。结论:人外周血白细胞中hBD-2基因呈现诱导性表达,IL-10能下调hBD-2的诱导性表达。     

β-防御素2基因腺病毒表达载体的构建与真核表达

目的：探讨重组腺病毒载体在真核细胞中稳定表达阳离子抗菌肽——β-防御素2的可行性。方法：采用RT-PCR方法扩增得到大鼠β-防御素2（rBD2）基因片段，定向插入到腺病毒穿梭质粒pShuttle-CMV中，重组质粒pShuttle-CMV-rBD2转化E．coli BJ5183-AD-1后，与腺病毒基因组质粒pAdEasy-1发生同源重组，重组质粒pAdEasy-rBD2转染293细胞进行腺病毒表达载体的包装。将包装成功的腺病毒感染cos-7细胞，并建立SD大鼠腺病毒感染模型，进行β-防御素2多肽的体外和体内表达，采用Western blot与免疫组化方法检测其表达。结果：重组腺病毒表达载体构建成功，包含大鼠β-防御素2基因，滴度达到10^9PFU／ml，Western blot与免疫组化方法分别检测到β-防御素2在SD大鼠体外、体内的表达。结论：重组腺病毒载体能在真核细胞中稳定表达阳离子抗菌肽——β-防御素2。     

乳糖诱导鸡β-防御素3在大肠杆菌中的融合表达

目的研究用乳糖作为诱导剂对鸡β-防御素3(Gal-3)基因重组蛋白的表达,探讨工程化生产的可能性。方法分别比较乳糖诱导浓度、诱导时机、诱导时间及诱导温度对重组表达产物的影响,并以IPTG诱导作为对照,确定较为优化的乳糖诱导条件。结果对于重组目的产物,乳糖作为诱导剂也可以起到良好效果,诱导产物的表达量与IPTG诱导产物相当。最优表达条件为终浓度2 g/L乳糖37℃下诱导3 h,可以达到良好的诱导效果。结论乳糖可以诱导Gal-3基因表达,并取得良好效果,为工业化生产提供了良好的实验参考和借鉴。     

小鼠β防御素3在大肠杆菌中的融合表达及其抗菌作用的初步研究

目的构建小鼠β防御素3（mouse βdefensin3,mBD3）基因的原核表达载体pET-32a（＋）／mBD3,诱导mBD3融合蛋白在大肠杆菌中的表达,并融合蛋白的抗菌活性。方法运用PCR技术从质粒pcDNA3．1（＋）／mBD3中扩增mBD3基因片段,将该片段插入pET-32a（＋）原核表达载体,并对构建的重组质粒进行PCR、酶切和测序鉴定。将鉴定正确的质粒转化大肠杆菌表达菌株Rosetta-gami（2）,用畀丙基-D硫代半乳糖苷（IPTG）诱导融合蛋白的表达。采用SDS-PAGE和WesternBlot鉴定融合蛋白。通过镍亲和层析获得纯化的融合蛋白,用微量液体稀释法测定融合蛋白鼠B防御素3（fmBD3）的抗菌活性。结果mBD3的原核表达载体PET-32a（＋）／mBD3构建成功,在大肠杆菌中表达出fmBD3并提取获得纯化的融合蛋白。fmBD3对单细胞真菌具有较好的抑制和杀灭作用,可抑制革兰阳性菌的生长,而对革兰阴性菌元作用。结论构建的原核表达载体在大肠杆菌中成功表达fmBD3,该融合蛋白显示出较强的杀真菌作用和一定的抗细菌作用,为进一步研究鼠防御素的抗微生物活性奠定了实验基础。     

人β-防御素3的cDNA克隆和表达载体的构建

目的 克隆人β-防御素3(hβD-3)cDNA并构建其原核表达载体，为更深入的抗菌肽活性研究及制备新型肽类抗生素创造条件。方法 从人扁桃体组织中提取总RNA，经RT-PCR扩增编码hβD-3成熟肽的cDNA序列，将其克隆至pUC18载体进行序列测定，然后构建于新型原核表达载体pQE-80L中。结果 RT-PCR扩增得到约135bp的目的DNA片断，序列分析与GenBank中报道的编码hβD-3成熟肽的cDNA序列完全一致。结论 hβD-3eDNA的克隆和原核表达载体的构建，为进一步制备抗耐药菌的肽类抗生素奠定了基础。     

鸡β-防御素的研究进展

鸡β-防御素在动物机体组织中分布较为广泛,在多种组织上皮细胞中均可合成,是机体抵御外界微生物侵袭的重要化学屏障,在机体内源性免疫防御中具有重要作用.它作用于微生物细胞膜的防御机理以及不易引起耐药性的特点,已引起各国研究者的日益重视.本文着重描述了鸡β-防御素的起源与分子结构、抗菌作用机理、抗菌活性、获取方法、基因工程及...     

构建大肠杆菌表达GST兔防御素NP-1融合蛋白表达载体的研究

利用计算机软件对兔防御素基因进行分析，消除大肠杆菌不表达或低效表达密码子。同时利用相关软件对基因进行分析，消除可能影响融合基因表达的一些因素，构建兔防御素大肠杆菌高效表达载体。通过初步表达分析，融合蛋白表达量为菌体总蛋白的27．7％。     

人MT-1E融合蛋白在大肠杆菌中的表达及纯化

目的：体外表达人源性MT-1E融合蛋白并进行纯化。方法：采用RT-PCR方法获得人MT-1E基因的编码区，将其克隆入原核表达载体pQE40，并在大肠杆菌M15中表达，对蛋白的表达形式及诱导条件进行分析。用Ni-NT agarose亲和层析柱纯化目的蛋白。结果：重组蛋白在原核细胞中以可溶和不可溶两种表达形式存在。但以不可溶性形式为主。表达量随诱导时间延长而增加，在诱导8h时目的蛋白约占菌体总蛋白的32％。经亲和层析获得较高纯度的人MT-1E融合蛋白。结论：利用基因重组原核表达技术获得较纯的人源性MT-lE融合蛋白。为进一步研究金属硫蛋白的功能及特异性抗体的制备奠定了基础。     

人β防御素-2研究进展

内源性抗生素肽(endogenous antibiotic peptides)是动、植物天然免疫的重要介质,在哺乳动物(包括人)中,由于对革兰氏阳性菌、阴性菌、真菌、螺旋体、分枝杆菌及某些包膜病毒等均有很强杀伤活性,故将其命名为防御素(defensin).迄今为止,在人体中已发现的防御素共有两类(α、β)10种.其中β防御素家族共发现3种,分子量为4～5kD,含38～47个氨基酸残基阳离子,分别为人β防御素-1,2,3(human β-defensin-1,2,3. hBD-1,2,3).德国Harder J等[1]于1997年首先发现hBD-2,他们用大肠杆菌亲和柱结合高压液相层析法在牛皮癣病人皮肤中分离并纯化到约4.3kD的多肽,经氨基酸序列分析表明与牛的TAP(气管抗菌肽)、LAP(舌抗菌肽)及hBD-1同源,属于人β抗菌肽成员之一,命名hBD-2.已证实hBD-2是黏膜和上皮细胞抵抗微生物入侵的重要介质,在持续暴露在病原微生物的器官表面发挥重要的抗菌作用.     

人心肌肌钙蛋白Ⅰ在大肠杆菌中的高效表达及纯化

目的:获得高纯度的人心肌肌钙重组蛋白,为临床上检测心肌损伤及预后提供新的诊断方法.方法:利用RT-PCR方法从人心肌细胞的cDNA文库中扩增编码人心肌肌钙蛋白Ⅰ的cDNA,并克隆到大肠杆菌表达载体中,表达含凝血酶识别序列的MS2-cTnI 融合蛋白,纯化后用Western-blot进行鉴定.结果:从人心肌cDNA文库中扩增出编码人cTnI的cDNA,克隆并在大肠杆菌中表达,表达量达30%以上.经离子交换柱纯化,最终产物纯度在95%以上.可与其特异性单克隆抗体反应.结论:cTnI能够在大肠杆菌中高效表达和纯化,为今后检测心血管疾病提供了一种高效快捷的方法.     

人肌红蛋白原核表达载体的构建、表达及蛋白纯化

目的：构建人肌红蛋白（Mb）原核表达载体并诱导其表达、纯化及鉴定目的蛋白pQE。方法：根据已报道的人Mb基因序列,采用RT-PCR技术从人骨骼肌组织中获得肌红蛋白cDNA序列。将所得的PCR产物插入克隆载体pGEM-Teasy中,得重组质粒,经酶切、PCR及测序鉴定正确后,将酶切目的片段插入原核表达载体pQpQEE30中并转化大肠杆菌(E.coli)M15,通过IPTG诱 导表达出带有6个组氨酸的融合蛋白。经镍固定金属亲和层析纯化。结果：序列分析表明,人Mb基因成熟肽编码区含有465 bp,编码153个氨基酸;与GenBank(NM203378) 中已报道的Mb核苷酸序列有98.50 %同源性。经IPTG诱导表达,SDS-PAGE 电泳和免疫印迹分析显示,表达的融合蛋白占菌体蛋白总量的31%,相对分子质量约为16 700,并与商品化的人Mb单抗呈特异性反应。经Ni²⁺-NTA agarose 纯化获得SDS-PAGE 电泳下单一条带。结论：在大肠杆菌中获得了人Mb的高效表达。     

人β2微球蛋白基因在大肠杆菌中的稳定、高效表达

目的应用基因工程技术表达人β2微球蛋白基因(β2m)。方法采用逆转录PCR技术,从Raji细胞株获得β2m的基因序列;将其与改建后的质粒pBV220连接,转染大肠杆菌BL21,经42℃诱导后,以SDS-PAGE鉴定阳性表达克隆,产物经过柱纯化。结果获得了编码成熟β2m的全长cDNA和高效、稳定表达人β2m的大肠杆菌克隆。结论成功地在大肠杆菌中获得了β2m基因的高效表达,为制备主要组织相容性复合体(MHC)-四聚复合物系统奠定了基础。     

人视黄醇结合蛋白4 cDNA全长的克隆、表达和纯化

目的 构建人视黄醇结合蛋白4(RBP4)cDNA全长的原核表达质粒(pET-28a(+)-hRBP4)并在大肠杆菌中高效表达.方法 取成人正常肝脏组织提取总RNA,RT-PCR后的扩增产物回收,构建克隆载体pMD-RBP4,设计带酶切位点BamHⅠ和HindⅢ的引物,PCR后酶切插入pET-28a(+)中,转化BL21(DE3),IPTG诱导表达,Western blot检测其特异表达,并对rhRBP4诱导表达时IPTG的浓度、时间和温度等条件进行了优化;用镍亲和层析柱进行纯化,SDS-PAGE鉴定其纯度.结果 测序证实所得的hRBP4 cDNA序列与其在GenBank中的序列基本一致,重组质粒pET-28a(+)-RBP4的双酶切结果与预期大小完全一致,IPTG诱导后高效表达的蛋白质以不溶性包涵体形式存在;Western blot结果证实表达产物为RBP4.IPTG诱导的最佳浓度是0.04 mmol/L,时间为6 h,温度为37℃,镍亲和层析后经电泳证实其纯度可达96%.结论 经诱导表达和纯化的rhRBP4可用于制备抗体和进一步研究.     

重组人源胰岛素原C肽在大肠杆菌中的克隆、表达与纯化(英文)

目的:构建一种新型表达载体(pEDCC),表达并纯化得到人源胰岛素原C肽。方法:将编码截短的门冬酰胺酶突变体(ansB-C),天然C肽,人IgG1铰链区(hinge),额外的酸敏感二肽(DP)以及富含碱性氨基酸的8肽(KRKRKKSR)的核苷酸序列依次分别插入pET28a载体中,构建表达载体pEDCC。在乳糖的诱导下,融合蛋白ansB-C-hinge-DPKRKRKKSRNGS-GR-C-peptide以包涵体形式高效表达。融合蛋白经洗涤和乙醇分级沉淀纯化后,通过酸水解将PKRKRKKSRNGSGR-C-peptide释放出来。C肽N端14肽用胰蛋白酶切割,通过DE52柱与C-peptide分离。结果:构建的表达载体pEDCC序列正确,融合蛋白经分离纯化得到了高纯度的重组人源胰岛素原C肽。结论:以截短的门冬酰胺酶作为融合伙伴,并以富含碱性氨基酸的8肽调节等电点是一种生产重组人源胰岛素原C肽的有效方法。     

人NKp46基因克隆及其在大肠杆菌中的表达和纯化

目的：对人NKp46进行基因克隆并探讨其在大肠杆菌中重组表达和纯化。方法：用RT PCR法自人外周血单个核细胞总RNA扩增hNKp46片段（约900?bp）,克隆至质粒载体pMD18 T,并对克隆的DNA片段进行序列分析。用限制酶EcoRⅠ和NcoⅠ消化pMD18 T hNKp46重组质粒,分离hNKp46片段,并插入原核表达载体pET30a(+)的相应限制酶位点,酶谱分析鉴定重组表达载pET30a(+) hNKp46。转化菌株BL21(DE3)经IPTG诱导,用SDS PAGE和Western Blotting鉴定表达的重组蛋白。采用His·Bind Purification Kit对重组蛋白进行纯化。结果：RT PCR扩增的DNA片段与hNKp46 cDNA大小一致。重组质粒pMD18 T hNKp46的DNA序列分析显示,克隆的DNA序列与文献报道的hNKp46的cDNA序列一致。SDS PAGE表明,重组蛋白相对分子质量为38.5?kD,其表达量达菌体总蛋白的40％左右。Western Blotting分析显示,重组蛋白能特异地与抗His·Tag抗体结合。纯化得到纯度为95.5％的重组蛋白,纯化回收率达40％。结论：成功构建了人NKp46表达载体,并获得了稳定表达的工程菌株,纯化了重组蛋白。     

颗粒酶B的表达纯化和鉴定

目的：克隆颗粒酶B(GraB)，构建GraB的原核表达载体，从而建立其原核表达体系，获得高效表达的重组GraB。方法：抽提人外周血淋巴细胞总RNA,进行RT-PCR克隆GraB cDNA，构建GraB原核表达载体，用限制性酶切和DNA测序进行鉴定；异丙基-1-硫代-β-呋喃半乳糖苷（IPTG）诱导表达，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析表达产物。表达产物亲和层析纯化并用免疫印迹法鉴定，以GraB底物测定其活性。结果：表达产物以可溶性分子形式存在于菌体中，具有良好的抗原性和特异性，并能作用于GraB特异性底物。结论：建立了GraB原核表达系统。     

IL-18在大肠杆菌中的可溶性表达和纯化

目的：研究人IL-18成熟蛋白（mhIL-18）在大肠杆菌中的高效的非包涵体表达以及纯化方案。方法：利用PCR方法扩增出mhIL-18基因，构建融合型表达载体pPTYB1-IL18，转化入大肠杆菌ER2566中，IPTG诱导表达，优化表达条件，超声裂解细胞，采用SDS-PMGE和Weslern blot分析重组蛋白的表达，亲和层析后用MTT法检测表达mhIL-18的活性。结果：成功构建载体并转化入ER2566后，经IPTG诱导，表达量可占菌体总蛋白的26％以上，其中80％以上的mhIL-18融合蛋白以可溶、有活性的形式存在。亲和层析后的mhIL-18纯度可达95％，具有显著的IL-18的生物学活性。结论：成功的在大肠杆菌中的高效以非包涵体表达mhIL-18，并具有显著的IL-18的生物学活性。     

人酸性成纤维细胞生长因子基因在大肠杆菌中的高效表达及 …

用ＨｉｎｄⅢ和ＥｃｏＲ１双酶酶切经改造的ＰＵＣ－ａＦＧＦ质粒,获得了人酸性成纤维细胞生长因子（ｈａＦＧＦ）基因,将该基因片段插入表达载体ｐｄｄ２２３－３,筛选得到了重组质料,ｐｋｋ－ｈａＦＧＦ,加ＩＰＴＧ诱导该粒质转化的大肠杆菌ＪＭ１０９表达,ｈａＦＧＦ在发酵液中的表达水平约８９ｍｇ／Ｌ。用肝素亲和层析的方法,获得了电沪纯ｈａＦＧＦ样品。纯化过程中ｈａＦＧＦＧ活力回收率６５％。纯化ｈａＦＧＦ样品的