低温冻存对成人骨髓间质干细胞生物学特性的影响

目的：研究低温冻存对骨髓间质干细胞（MSCs）其生物学特性的影响，探讨MSCs理想的保存方法。 方法： 体外分离培养、扩增正常成人骨髓MSCs,在5％DMSO-30%FBS-DMEM冻存保护剂条件下，分别采用二步法和程控降温冻存方法低温保存3月，以台盼蓝拒染回收率(TBR)、MSCs生长曲线、MSCs表面抗原表达以及其多向分化能力检测，比较两种不同的冻存方法对MSCs生物学特性的影响。 结果： 程控降温冻存后MSCs活力优于二步法［TBR（87.67±2.52）％ vs （79.00±3.61）％，P<0.05］。多因素方差分析显示MSCs代数和冻存方法均是影响冻存后MSCs增殖的重要因素。两种冻存方法中P8代细胞的增殖能力明显劣于P1代细胞（P<0.01）或P4代细胞（P<0.01）。MSCs程控冻存后增殖能力与冻存前无差异（P<0.05），优于二步法冻存后的增殖能力（P<0.05）。 程控冻存后MSCs稳定表达CD29、CD44、CD166（与冻存前比较，P>0.05）。而二步法冻存后细胞CD29表达下降（与冻存前比较，P<0.05）。两种冻存方法对MSCs向成骨细胞、脂肪细胞和神经元细胞分化没有显著影响，与冻存前比较，P>0.05。 结论： 采用5％DMSO-30%FBS-DMEM冻存保护液和程控降温的冻存体系，可较完整保持MSCs生物学特性，是深低温保存MSCs的理想方案。     

快速深低温冻存对新生大鼠卵巢组织免疫原性的影响

目的:探讨快速冻存法冻存新生大鼠卵巢器官的效果,以及冻存对卵巢抗原性的影响。方法:采用快速冻存法冻存出生1 d的鼠(新生鼠)卵巢组织,移植入同系去卵巢成年雌性大鼠的肾被膜下,利用免疫组织化学方法及Western blot检测观察移植物内CD8 和CD4 T淋巴细胞的浸润情况。结果:新生鼠卵巢组织移植后动情周期恢复率(66.67%)低于新鲜移植组(90.51%),但无显著性差异。各移植物内毛细血管丰富;有正常发育阶段的各级卵泡、间质腺及闭锁卵泡;CD8 和CD4 阳性细胞计数值及其蛋白表达明显低于新鲜移植组。结论:快速冻存法可有效地冻存新生鼠的卵巢;冻存降低新生鼠卵巢组织抗原性。     

弓形虫低温冻存方法探讨

本文报道采用１０ %的二甲亚砜（ＤＭＳＯ）为弓形虫速殖子冻存保护剂 ,冻存弓形虫。经复苏后观察至少有３０ %的虫体仍然存活 ,其中部分虫株已存放长达３年之久 ,为深入展开对弓形虫的研究提供物质基础 ,现将结果报告如下。材料和方法一、材料 :（一）弓形虫株 :采用标准毒株—ＲＨ株（二）保护剂 :二甲亚砜（三）液氮冻存管 :１．５ｍ（ＮＵＮＣ丹麦）（四）液氮罐 :ＹＤＳ -３５ -１２５型（成都液氮容器厂）二、方法 :以弓形虫速殖子接种小鼠腹腔 ,７２ｈ后处死 ,用２ｍｌ生理盐水冲洗腹腔 ,对液计数 ,取适量腹水混悬液加入二甲亚砜 ,使…     

腺垂体细胞培养及低温冻存研究

垂体移植目前依就是解决垂体功能低下的有效治疗手段。垂体细胞的培养及低温冻存是垂体移植研究中心的基础。本文对腺垂体培养的发展过程及目前的现状进行了简要的回顾和概括,对低温冻存的理论发展过程做过综述,同时从腺垂体移植发展的角度对垂体细胞培养及垂体移植工作的意义前景做了展望。     

腺垂体细胞培养及低温冻存研究

垂体移植目前依就是解决垂体功能低下的有效治疗手段.垂体细胞的培养及低温冻存是垂体移植研究中的基础.本文对腺垂体培养的发展过程及目前的现状进行了简要的回顾和概括,对低温冻存的理论发展过程做过综述,同时从腺垂体移植发展的角度对垂体细胞培养及垂体移植工作的意义前景做了展望.     

自动程序降温法冻存小鼠脾淋巴细胞的研究

<正> 深低温保存淋巴细胞在移植免疫学、免疫试验质控和治疗,以及老年医学研究中有重要应用价值。采用程序降温仪实施自动程序降温是国外目前研究最多,并且是迄今最有效的冻存淋巴细胞的方法。我们利用国产装置建立了自动程序降温冻存小鼠脾淋巴细胞的方法,取得良好的效果,现将实验结果报告如下。     

成骨细胞培养及冻存复苏后生物学特性比较

目的 :了解冻存复苏过程对保持成骨细胞生物学特性的影响。方法 :通过细胞组化、免疫组化以及图像分析等方法对冻存和非冻存 (新鲜制备 )的细胞在其形态及功能方面进行了比较。结果 :两组ALP染色、茜素红S法、V G法、免疫组化法的结果均差异无显著性 (P >0 0 5 )。但细胞存活率与冻存时间密切相关 ;随冻存时间延长 ,其存活率下降。结论 :两组细胞保持了某些相似的生物学行为 ,如细胞形态、生长过程、基质分泌等。冻存时间对保存的成骨细胞存活率有影响。     

-80℃冰箱直接冻存对细胞因子诱导的杀伤细胞杀伤活性的影响

目的:研究-80℃冰箱直接冻存对细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)杀伤活性的影响。方法采用非程序降温方法-80℃冰箱冻存CIK,于冻存后6、12、18周复苏,通过LDH释放法分别测定其对K562细胞的杀伤活性,与新鲜未经冻存的CIK的杀伤活性进行比较。结果:未冻存的CIK在培养至第11天时,有较多贴壁成团细胞,而冻存后复苏培养的CIK贴壁成团细胞较少。比较各组细胞杀伤活性,冻存6、12周后复苏的CIK与未冻存的CIK,对K562细胞的杀伤活性无显著性差异(P>0.05),冻存18周后复苏的CIK的杀伤活性与未冻存的CIK对K562细胞的杀伤活性有显著性差异(P<0.05)。结论:采用-80℃冰箱直接冻存CIK,在12周内复苏应用于临床治疗较好。     

组织工程研究与开发中的冻存技术

综述了有关组织工程种子细胞、支架材料和工程化组织的冷冻保存问题。对冻存技术在组织工程研究和开发中的重要作用进行了阐述。指出低温保存可能是长时间保存有活性的组织工程产品的有效方法之一。组织工程种子细胞采用低温冷冻保存 ;组织工程支架材料用冷冻干燥保存 ;工程化组织的保存采用玻璃化冷冻保存方法。     

两种冻存液中海马神经元细胞复苏后生物学特性比较

目的:建立海马神经元适宜的冻存方法.方法:将新生24 h以内的大鼠海马消化成单个细胞后分别直接冻存于血清浓度不同的冻存液中,复苏后进行台盼蓝染色观察细胞活性;培养后观察其生长状态并在第7天固定细胞,分别进行Hoechst,微管蛋白(Tubulin)和神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)显色后,荧光显微镜下计数海马神经元、胶质细胞的百分率,从而建立最佳冻存方法.结果:冻存于高浓度血清冻存液中的神经元百分率为87.5%,冻存于低浓度血清冻存液中的神经元百分率为73.8%,高浓度血清冻存液中的细胞复苏后的状态及神经元存活率明显优于保存于低浓度血清冻存液中的;而冻存于高低浓度血清冻存液中的胶质细胞百分率分别为9.5%和16.5%,胶质细胞在高浓度血清的相对含量明显低于低血清组.结论:高浓度血清冻存液更利于海马神经细胞冻存后的复苏和生长.     

组织工程化肌腱种子细胞深低温保存的实验研究

对肌腱种子细胞进行深低温保存，研究保存过程中多个环节的影响因索对细胞存活率的影响及深低温保存对种子细胞生物学特性、胶原分泌功能的影响。实验结果表明二甲基亚砜是肌腱种子细胞深低温保存中比较好的抗冻保护剂；冻存后使用与培养时不同的营养血清处理对细胞有损害，可降低细胞存活率；在冷冻保存过程中，细胞存活率与细胞浓度有一定关系，浓度太低可能降低细胞存活率；细胞在冷冻保存时，降温速度对细胞存活率有影响，慢速的分步降温组细胞存活率明显高于直接人液氮的快速降温组；采用10％二甲基亚砜加15%小牛血清加75% DMEM配方保存肌腱种子细胞，对其分泌胶原功能无明显影响，对其生长曲线、细胞周期及染色体众数无明显改变，适于肌腱种子细胞的保存。     

脱蛋白骨-钛网支架成骨细胞复合物修复骨缺损的研究

探讨成骨细胞和脱蛋白骨-钛网(DPB- TM)支架复合物修复骨缺损的能力。用新西兰兔30只,随机分成3组,各10只。实验组第三代胎兔成骨细胞以5×10 6 m l- 1浓度接种于DBP- TM支架中,复合物体外培养1周后修复颅骨1.5 cm×1.5 cm缺损。对照组 、,同样的缺损分别用DBP- TM支架修复和注射成骨细胞悬液。术后12周,三维CT检查后,对取下的标本进行大体、扫描电镜、组织学观察及生物力学测试。结果显示,实验组植入的复合物与正常骨组织之间分界线模糊,有骨小梁通过,界面紧密融合;支架上有大量新骨形成,且支架部分被吸收;植入12周后的复合体抗压强度(18.93±1.12 MPa)大于正常颅骨(16 .96±1.6 0 MPa) (P<0 .0 5 )。对照组均无新生骨,仅见缺损区有纤维样组织覆盖。因此,体外培养的成骨细胞经增殖后接种于DPB- TM支架中可以用来修复骨缺损。     

液氮冷冻保存对主动脉瓣膜细胞活性及细胞外基质的影响

液氮冷冻保存是目前最好的同种心瓣膜保存方法 ,但液氮冷冻保存也可导致瓣膜的结构损害。为了探讨液氮冷冻保存对主动脉瓣膜组织结构的影响情况 ,本实验通过采用XTT比色法、形态学观察、免疫组织化学荧光染色法研究了不同冷冻保存时间对猪主动脉瓣膜细胞活性及细胞外基质的影响。研究结果显示 ,液氮保存后瓣膜细胞活性明显下降 (P <0 .0 5 ) ,细胞超微结构损害增加 ,可溶性细胞外基质纤维连接蛋白与硫酸软骨素不同程度流失 ,间质胶原纤维排列紊乱。但在冻存时间小于 3月时 ,损害的程度与冻存时间无明显关系。     

Effects of Freezing and Cryopreservation on the Mechanical Properties of Arteries

Cryoplasty, a freezing therapy, is being used for the treatment of restenosis in peripheral arteries. In addition, cryo-preserved arteries are increasingly used in vascular grafts. While studies are being performed to establish the efficacy of such treatments, very little is known about the postcryosurgical or postcryo-preservation changes in mechanical properties of the arteries. Few studies have examined the effect of freezing in the absence of cryoprotective agents (CPAs), and the several studies done in the presence of CPAs have given mixed results. To examine this issue further, we froze pig femoral arteries in a controlled rate freezer, using an aluminum probe, both in the presence at (−80°C to 1°C/min) and absence (at −20°C for 2 or 5 mins) of CPA and Fetal bovine serum (FBS). Following freezing, artery samples were subjected to uniaxial tensile testing. The weights of the tissue were measured before and after freezing. Our results suggest that freezing does have an effect on stress-strain properties, particularly in the low stress region corresponding to physiological conditions. The mechanisms of this change in mechanical properties may include the loss of smooth muscle cell viability, damage to extra cellular matrix (ECM), bulk redistribution of water, or changes in alignment caused by ice crystal growth. In the case of samples frozen in the absence of CPA or FBS, the results indicated a drastic reduction in weight of the tissue suggesting the importance of bulk water redistribution as one underlying mechanism. To further examine potential mechanisms, we subjected cryopreserved vessels to the same uniaxial tests. The extent of changes in mechanical properties and bulk water redistribution was greatly attenuated; reinforcing that water movement might play a role in the changes observed with freezing.     

机械拉伸对成骨细胞增殖及IGF-1 mRNA表达的影响

应用体外周期性机械拉伸装置对大鼠成骨细胞施加拉伸刺激。研究了应变15％,频率20次／min的拉伸刺激下不同加载时间对成骨细胞增殖及IGF-1 mRNA表达的影响。发现在受载12 h时,细胞相对增殖指数最大,随受载时间的增加而逐渐趋向于1,同时IGF-1 mRNA表达显著增加。说明成骨细胞对周期性机械拉伸刺激的响应,可能是通过增强成骨细胞IGF-1的自分泌作用来发挥其促增殖的生物学效应。并且受载的成骨细胞经过自身调控后,逐渐适应于新的力学环境,保持一种新的平衡状态。     

Effects of Constant Static Pressure on the Biological Properties of Porcine Aortic Valve Leaflets

An understanding of how mechanical forces impact cells within valve leaflets would greatly benefit the development of a tissue-engineered heart valve. In this study, the effect of constant ambient pressure on the biological properties of heart valve leaflets was evaluated using a custom-designed pressure system. Native porcine aortic valve leaflets were exposed to static pressures of 100, 140, or 170 mmHg for 48 h. Collagen synthesis, DNA synthesis, sulfated glycoaminoglycan (sGAG) synthesis, alpha-SMC actin expression, and extracellular matrix (ECM) structure were examined. Results showed that elevated pressure caused an increase in collagen synthesis. This increase was not statistically significant at 100 mmHg, but at 140 mmHg and 170 mmHg collagen synthesis increased by 37.5 and 90%, respectively. No significant difference in DNA or sGAG synthesis was observed at elevated pressures, with the exception that DNA synthesis at 100 mmHg decreased. A notable decline in alpha-SMC actin was observed over the course of the experiments although no significant difference was observed between the pressure and control groups. It was concluded that elevated pressure caused a proportional increase in collagen synthesis of porcine aortic valve leaflets, but was unable to preserve alpha-SMC actin immunoreactive cells.     

胚胎干细胞向成骨、软骨细胞定向分化研究进展

骨、软骨组织工程的热点之一是寻找合适的种子细胞.胚胎干细胞因具有全能性和无限增殖的能力有望成为组织工程中的种子细胞新来源.主要介绍了胚胎干细胞定向诱导分化为成骨、软骨细胞研究所取得的进展,并展望了胚胎干细胞作为组织工程种子细胞的前景和所面临的困难.     

力学刺激对3月龄骨质疏松大鼠成骨细胞增殖与合成功能的影响

探讨周期性双轴力学应变对成骨细胞增殖与分化合成功能的影响。将正常 3月龄雌性 SD大鼠和骨质疏松大鼠颅顶骨分离的成骨细胞分别在含 10 %胎牛血清的 F- 12培养液中培养 ,并接种在双轴力学应变装置中。当细胞生长至亚融合状态 (Subconfluence) ,给细胞施加力学刺激 ,频率为 1Hz,力学刺激分别为 4 0 0、10 0 0、4 0 0 0μ strain;作用时间分别为每天 30 m in,2、4、8h,共加载两天。以未受力学刺激的细胞为对照组 ,受力学刺激的细胞为实验组 ,并进行比较。采用流式细胞技术测定细胞增殖变化 ;采用同位素标记方法检测成骨细胞骨钙素、I型胶原 C端前肽 (PICP)和总蛋白的分泌量。结果表明 :1)在静态培养条件下 ,3ovx组与 3control组比较 ,其细胞功能活性无明显变化 ,但 3ovx组大鼠成骨细胞增殖活性明显增高 ,这与绝经后骨质疏松骨代谢的高转换率相一致。 2 )4 0 0、10 0 0 μstrain力学刺激可以促进 3control组成骨细胞 I型胶原、骨钙素和总蛋白的分泌量增加 ,促进成骨细胞的分化成熟 ;在 10 0 0μstrain力学刺激下 ,成骨细胞合成骨基质的能力增加最为明显。同时 ,在 4 0 0、10 0 0μstrain力学刺激的初期也可以促进成骨细胞的增殖 ,而促进成骨细胞的分化成熟的作用大于促进细胞增殖的作用。 3)在4 0 0 0 μ