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1.
目的:构建pEGFP—X真核表达载体,观察其在肝癌细胞株中的表达。方法:从质粒pcDNA3.1(+)-X酶切获HBVX基因片段,克隆至pEGFP—N1;用酶切、PCR和测序鉴定pEGFP—X载体;用脂质体法,将重组载体(pEGFP—X)和空载体(pEGFP-N1)瞬时转染肝癌细胞细胞株BEL-7402;分别用RT—PCR、荧光显微镜鉴定HBVX和EGFP基因表达。结果:鉴定证实pEGFP-X载体构建成功;该质粒瞬时转染的BEL-7402有HBVX基因表达,并发绿色荧光。结论:构建的pEGFP—X真核载体能在BEL-7402中表达,绿色荧光蛋白示踪利于表达HBVX基因稳定细胞株的筛选,并为探讨HBVX基因在HCC中的致瘤机理提供实验模型奠定基础。 相似文献
2.
目的构建绿色荧光蛋白(GFP)与人乙型肝炎病毒(HBV)X基因的重组表达载体,建立稳定表达HBVX蛋白(HBx)与GFP融合蛋白的HepG2细胞系,以进一步研究HBx的生物学功能及其在肝癌发生中的作用。方法应用PCR法从adr亚型HBV质粒pHBVDNA中扩增HBVX基因片段,PCR产物经HindⅢ和KpnⅠ双酶切后定向插入绿色荧光蛋白真核表达载体pEGFP-C1的相应酶切位点,转化宿主菌DH5α,采用上述双酶切及DNA测序鉴定重组质粒pGFP-HBx;采用脂质体转染法将pEGFP-C1质粒、pGFP-HBx重组质粒DNA转染人肝母细胞瘤细胞系HepG2细胞,G418选择抗性细胞克隆,荧光显微镜下观察GFP表达,挑取表达GFP的抗性克隆扩大培养、传代。采用RT-PCR检测转染细胞HBVX基因的表达。结果经酶切及测序鉴定成功构建了GFP-HBVX重组表达载体pGFP-HBx;将pEGFP-C1、pGFP-HBx重组质粒转染HepG2.,经G418筛选15d获得抗性细胞克隆。将带绿色荧光的抗性克隆细胞扩大培养并经传代70次,细胞仍表达强的荧光蛋白。RT-PCR检测表明转染pGFP-HBx重组体的HepG2/GFP-HBx细胞有HBVX转录、表达。结论成功构建了GFP.HBVX真核重组表达载体pGrP-HBx;获得了稳定表达GFP-HBx融合蛋白的HepG2细胞系,这为进一步研究FIBx的生物学功能以及HBx在肝癌发生中的作用与机制打下了基础。 相似文献
3.
目的:构建脂氧素A4受体样蛋白(LRLP)基因的真核表达载体,克隆后转染Hela细胞,观察LRLP基因在Hela细胞中的表达。方法:应用PCR方法.以小鼠睾丸cDNA为模板,扩增出LRLP基因片段,插入质粒pGEM—T中,转化人大肠杆菌JM109。扩增阳性重组质粒,经酶切后纯化并测序鉴定目的片段。构建含绿色荧光蛋白基因的真核表达载体pEGFP/LRLP,转化人大肠杆菌JM109扩增.酶切后再测序鉴定目的片段,抽提质粒后瞬时转染Hela细胞,置激光共聚焦显微镜下照像。结果:测序鉴定表明.克隆的LRLP序列与GenBank中LRLP原序列100%.符合,激光共聚焦显微镜下见Hela细胞中LRLP基因表达。结论:成功地构建了真核表达载体pEGFP/LRLP,并转染了Hela细胞。 相似文献
4.
目的建立稳定、高效的HBx、羧基末端截短的中分子表面蛋白(MHBst)体外表达细胞株,以进一步研究HBx、MHBst蛋白在肝癌发生中的作用及其机理。方法设计特异性引物,采用PCR方法从adr亚型HBV质粒pHBV DNA中扩增HBx、羧基末端截短至155位氨基酸的中分子表面蛋白(MHBst155)编码基因,并定向插入绿色荧光蛋白(GFP)表达载体pEGFP-C1的BglⅡ、KpnⅠ和BglⅡ、BamHⅠ酶切位点,转化宿主菌DH5α,提取质粒,分别用上述内切酶酶切及DNA测序鉴定重组质粒。采用脂质体介导将空载体、重组质粒分别转染到人肝肿瘤细胞株HepG2中,G418筛选抗性细胞克隆,荧光显微镜下观察GFP表达,挑取表达GFP的抗性克隆扩大培养、传代。采用RT-PCR、蛋白印迹检测抗性细胞中HBx、MHBst155的mRNA及蛋白水平。结果经酶切及测序鉴定成功构建了pGFP-HBx、pGFP-MHBst155重组表达载体,将空载体及重组质粒转染HepG2,经G418筛选约20 d获得抗性细胞克隆。将带有绿色荧光的抗性克隆扩大培养并经传代40次,细胞仍表达强的绿色荧光。RT-PCR及蛋白印迹检测表明转染重组体的HepG2/GFP-HBx、HepG2/GFP-MHBst155细胞有相应的条带,而空载体、空白对照组未出现条带。结论成功构建了HBx、MHBst155真核重组表达载体pGFP-HBx、pGFP-MHBst155,获得了稳定表达融合蛋白GFP-HBx、GFP-MHBst155的HepG2细胞系,为进一步研究HBx及MHBst蛋白在肝癌发生中的作用及分子机制构建了良好的平台。 相似文献
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目的构建癌蛋白SET与增强型绿色荧光表达载体(EGFP)的融合表达质粒pEGFP—N2-SET并获得表达。方法根据人SET基因序列。设计了一对含有Kozak序列、终止密码子、HindⅢ和KpnI酶切位点的引物。从人L-02肝细胞提取总RNA,以逆转录后cDNA为模板,PCR扩增获得SET基因片段,经双酶切后回收得到有以上两个酶切位点的SET基因片段,将此基因片段克隆至相同酶切回收后的pEGFP—N2载体中,获得重组质粒pEGFP—N2-SET。以Lipofectamine^TM2000为载体,将构建好的真核表达质粒转染到L-02肝细胞中进行瞬时表达。结果。经DNA测序鉴定证实,pEGFP—N2-SET重组质粒构建成功,经荧光倒置显微镜观察,证实能在细胞内进行蛋白表达。结论SET表达质粒的成功构建及表达为其进一步结构和功能研究奠定了基础。 相似文献
6.
目的构建含绿色荧光蛋白报告基因的真核表达质粒pEGFP—N1-hIL-1Ra,稳定转染兔软骨细胞后检测其表达。方法通过RT—PCR扩增hIL-1Ra基因,并在两端添加HindⅢ和BamHⅠ酶切位点。将pEGFP—N1载体经BamHⅠ酶切后电泳鉴定,利用定向克隆技术将经HindⅢ和BamHⅠ双酶切后的hIL-1Ra基因片段和pEGFP-N1载体经T4连接酶进行连接。重组的pEGFP—N1-hIL-1Ra在大肠杆菌DH5α感受态细胞内扩增,经过酶切电泳鉴定和DNA测序证明质粒构建是否成功。将构建正确的pEGFP—N1/hIL-1Ra重组质粒DNA由脂质体介导转染兔软骨细胞,RT—PCR检测基因的表达,western-blot检测蛋白的表达。结果通过对重组质粒pEGFP—N1-hlL-1Ra进行酶切鉴定以及DNA序列测定分析,证明真核表达质粒pEGFP—N1-hlL-1Ra构建成功,开放阅读框架正确。稳定转染兔软骨细胞后,RT-PCR得到目的基因片段,ELISA检测到目的蛋白的表达。结论利用DNA重组技术能成功将hIL-1Ra基因克隆入pEGFP—N1载体中,构建出真核表达质粒pEGFP-N1-hIL-1Ra,并获得了稳定表达目的IL-1Ra的兔软骨细胞系,为骨关节炎的基因治疗研究奠定了实验基础。 相似文献
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pEGFP-C2-GATA4真核表达载体的构建及在P19细胞中的表达 总被引:1,自引:0,他引:1
目的:构建小鼠GATA4基因融合绿色荧光蛋白真核表达载体pEGFP—C2-GATA4,并检验其在P19细胞中的瞬时表达.方法:以真核表达质粒pEFSA—GATA4为模板,PCR扩增得到小鼠GATA4基因片段,将目的片段亚克隆到pEG—FP—C2载体,卡那霉素筛选阳性克隆,经菌落PCR、酶切鉴定和测序鉴定.将重组质粒pEGFP—C2-GATA4以脂质体法瞬时转染P19细胞,用免疫细胞化学、共聚焦扫描显微镜、PCR、免疫印记法检测GATA4在P19细胞中的表达.结果:酶切、测序结果表明将基因片段GATA4正确插入pEGFP—C2载体,并可在P19细胞中检测到GATA4基因和GATA4-EGFP融合蛋白表达.结论:成功构建真核表达质粒pEGFP—C2-GATA4,并在P19细胞瞬时表达成功,为进一步研究GATA4在心脏发育中的作用奠定了基础. 相似文献
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目的 成功构建HBx及其截断型突变体HBx-Mut120的真核载体,建立了两者稳定表达的HepG2细胞系,并研究了目的基因对细胞生长的影响。方法 采用PCR扩增HBx及其截断型突变体HBx-Mut120基因,然后分别克隆到PCMV-Tag2B载体中,并构建成重组质粒HBx-PCMV-Tag2B和HBx-Mut120-PCMV-Tag2B,经过PCR、酶切、测序鉴定重组质粒后,将其转染人肝癌细胞HepG2,经Game 418筛选后得到稳定表达目的基因的HepG2细胞,最后通过RT-PCR和Western blot鉴定HBx、HBx-Mut120的mRNA和蛋白在HepG2细胞中的表达情况,并用流式细胞仪检测了各组细胞的周期。结果 (1)成功构建目的基因表达载体PCMV-Tag2B-HBx、PCMV-Tag2B-HBx-Mut120。(2)成功建立稳定表达HBx及其缺失片段的HBx蛋白的HepG2细胞系。(3)通过流式细胞仪检测各组细胞周期及对比,发现HepG2-HBx细胞和HepG2-HBx-Mut120细胞的生长分数(G2+S)明显高于HepG2细胞及空载体转染的HepG2细胞。结论 本实验成功构建携带HBx及其截断型突变体HBx-Mut120基因的重组表达质粒,转染人肝癌细胞HepG2细胞后分别能够稳定表达HBx蛋白和截断型HBx蛋白,HBx及其突变体稳转细胞后更能促进HepG2细胞的增殖,且突变型目的基因稳转细胞系转移能力较前明显增强。为进一步研究截断型HBx突变体在肝癌的发生、发展中的作用奠定了实验基础。 相似文献
9.
真核绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-C3-B7-2的构建 总被引:1,自引:1,他引:0
目的:构建含人B7-2基因的绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-C3-B7-2。方法:应用RT-PCR、巢式PCR方法从重症肌无力患者胸腺组织中扩增出人B7—2 cDNA基闪片段,经回收、纯化、酶切后,依次连接到质粒pGEM—T和pEGFP—C3上.结果与结论:酶切及测序证实成功构建了克隆载休pGEM—B7—2和真核绿色荧光表达载体pEGFP—C3—B7—2。 相似文献
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目的:通过构建GPC3增强型绿色荧光蛋白真核表达载体,研究磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(Glypican-3,GPC3)促细胞增殖效应的影响,探讨GPC3基因对肝癌细胞侵袭和转移能力的影响。方法:应用基因重组技术及限制性内切酶酶切构建并鉴定pEGFP-IRES-N1-GPC3增强型绿色荧光蛋白真核表达载体,经脂质体Lipofectamine^TM 2000介导转染BEL-7404后,通过G418筛选出抗性克隆,应用逆转录-聚合酶链反应(RT—PCR)检测GPC3 mRNA在真核细胞中的表达,并在激光共聚焦显微镜下观察目的蛋白在真核细胞内的表达情况,采用免疫荧光法和流式细胞仪检测GPC3对细胞增殖效应的影响。Transwell小室实验检测BEL-7404肝癌细胞的侵袭能力。结果:限制性内切酶酶切分析、重组质粒测序鉴定表明为正确重组子,荧光显微镜下可见转染的真核细胞胞膜区发出强绿色荧光,RT-PCR法表明GPC3在真核细胞中成功表达,转GPC3的BED7404肝癌细胞与对照组相比有促细胞增殖及侵袭和转移效应。结论:构建完成真核表达重组质粒pEGFP—IRES-N1-GPC3;GPC3基因在BEL-7404中成功表达;GPC3可促进肝癌细胞的增殖,其通过增加细胞的侵袭能力而促进肝癌的转移。 相似文献
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目的为了探讨HBx基因与肝癌发生的关系,构建HBx基因重组腺病毒载体。方法应用pAdEasyTM腺病毒载体系统,首先从质粒pCDNA3.1-HBx中酶切得到HBx基因,插入腺病毒穿梭质粒pAdTrack—CMV中,得到pAdTrack—CMV—HBx,将其PmeI酶切线性化后,转到含腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的BJ5183感受态细菌中,通过同源重组得到重组腺病毒质粒载体pAd—HBx,经PacⅠ酶切线性化后转染人胚肾293细胞,产生重组腺病毒颗粒Ad—HBx。结果、PCR和酶切鉴定证明重组腺病毒Ad—HBx构建成功,在转染的293细胞中可以观察到绿色荧光蛋白GFP。结论成功构建了携带HBx基因的重组腺病毒载体,为后续研究奠定了基础。 相似文献
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【目的】克隆人类DNA聚合酶 (pol β)基因全长cDNA ,构建该基因的真核高效表达载体。【方法】抽提人胚肺纤维细胞HLF总RNA进行RT PCR扩增 ,用pGEM T载体经T/A克隆、DNA测序确定后 ,用双酶切将 pol β全长cDNA定向克隆到绿色荧光蛋白表达载体 pEGFP C1,转染大肠杆菌DH5α ,筛选阳性克隆 ,双酶切鉴定重组质粒。【结果】经RT PCR获得 1 0 3kb的产物 ,经DNA测序 ,确定所扩增片段为人类 pol β基因全长cDNA ,进而成功筛选出真核表达载体 pEGFP C1 β。【结论】成功构建人 pol β基因全长cDNA真核表达载体 ,为进一步建立该基因的高表达细胞株提供基础 相似文献
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目的构建人乙酰肝素酶(HPSE)基因启动子驱动的肿瘤细胞特异性表达载体,并分析其活性。方法PCR扩增人类基因组DNAHPSE启动子核心片段,并测序鉴定和分析转录因子结合位点(TFBS)。双酶切插入pEGFP-1的多克隆位点,构建肿瘤细胞表达载体pEGFP-Hp。将经酶切和测序鉴定的重组质粒pEGFP—Hp及质粒pEGFP-1(阴性对照)和pEGFP—N1(阳性对照)分别转染正常人脐静脉内皮细胞(ECV)和不同的肿瘤细胞(肝癌细胞HepG2、喉癌上皮细胞Hep2和慢性白血病K562细胞)。荧光显微镜观察和流式细胞术分析其促转录活性。结果扩增的HPSE启动子核心片段长度为561bp,序列分析与GenBank收录一致,含有3个SPI、4个Ets相关元件、2个早期生长反应基因-1及E47、N—mye和NGFI—p300等TFBS各1个。重组质粒pEGFP—Hp经酶切和测序鉴定与预期结果一致。荧光显微镜观察显示,转染pEGFP-1细胞中均无荧光表达;转染pEGFP—N1细胞均有强荧光表达;转染pEGFP—Hp质粒的ECV几乎无荧光表达,HepG2和Hep2细胞有较强荧光,K562细胞仅有较弱荧光。流式细胞术检测表明,pEGFP—Hp在ECV、HepG2、Hep2和K562细胞的平均转染率分别为3.9%、21.3%、10.8%和6.5%,pEGFP-N1转染率分别为17.1%、24.0%、14.0%和11.0%,二者比值均小于1。结论成功构建了由HPSE核心启动子驱动的真核细胞表达载体,该载体可在肿瘤细胞特异性表达,但其活性需进一步加强。 相似文献
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目的:克隆caveolin-1(CAV1)基因开放阅读框的cDNA序列,构建PEGFP—N1/CAV1的真核表达载体。方法:设计并合成带酶切位点及保护碱基的引物,RT—PCR法扩增caveolin-1基因,PEGFP—N1载体及caveolin-1基因片段进行限制性双酶切,电泳后回收切开的PEGFP—N1及caveolin-1片段,经连接反应后构建PEGFP—N1/CAV1真核表达载体。结果:PEGFP—N1/CAV1重组质粒经PCR电泳结果显示,得到一条在555bp的片段;重组质粒经限制性内酶切双酶切电泳结果证实,可释放一条在555bp的片段和4.8kbp的载体片段;重组质粒测序结果,经BLAST比对,100%符合;瞬时转染宫颈癌Hela细胞48h荧光显微镜及实时荧光定量PCR证实重组质粒在宫颈癌Hela中得到表达。结论:成功构建了同时携带有绿色荧光蛋白及G418筛选位点的PEGFP—N1/cAV1真核表达载体复合体。 相似文献
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目的分别构建携带绿色荧光蛋白报告基因的伯氏疟原虫(Plasmodiumberghei)环子孢子(CSP)全长基因和去除中央重复序列的CSP的融合蛋白真核表达质粒,并检测其在Hela细胞中的表达。方法采用PCR技术,从伯氏疟原虫基因组中扩增全长CSP基因,将其定向克隆入pEGFP-N1,构建pEGFP/PbCSP全长基因重组质粒,酶切、PCR及序列分析鉴定;同样,采用PCR技术扩增PbCSP的N端和C端两个片段,先将C端片段定向克隆入pEGFP-N1,构建pEGFP/PbCSP-C重组质粒,再将PbCSPN端片段定向克隆入pEGFP/PbCSP-C,构建pEGFP/PbCSP'重组质粒,酶切、PCR及序列分析鉴定。将pEGFP/PbCSP和pEGFP/PbCSP′分别用脂质体介导转染体外培养的Hela细胞,荧光显微镜及RT-PCR检测融合蛋白的表达。结果PCR、酶切及测序证实目的基因PbCSP全长和片段分别正确连接至pEGFP-N1的多克隆位点,两种重组质粒转染Hela后,荧光显微镜及RT-PCR均检测到目的蛋白在Hela中表达。结论成功构建了携带绿色荧光蛋白报告基因的伯氏疟原虫CSP全长基因和该基因片段的融合蛋白真核表达质粒,并在Hela细胞中获得表达。 相似文献
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双亚基共表达重组人白细胞介素12真核质粒pEGFP—C1_IL-12的构建及表达 总被引:2,自引:0,他引:2
目的 构建携带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)和人白细胞介素12双亚基目的基因(hIL-12,P35、P40)的真核表达质粒pEGFP-C1_IL-12,为进一步研究基因的定位、表达及hIL-12的抗肿瘤作用奠定基础.方法 提取脂多糖(LPS)诱导后的人脐带血淋巴细胞总RNA,RT-PCR法扩增人白细胞介素12的双亚基P35和P40的全长cDNA,采用重叠PCR法连接两个亚基,双酶切双亚基片段及载体pEGFP-C1,T4 DNA连接酶连接,重组质粒转化大肠埃希菌,挑取阳性克隆,PCR、双酶切及测序鉴定证实质粒构建成功.借助脂质体将重组质粒转染人肝癌细胞系HepG2,通过荧光显微镜检测报告基因的表达,RT-PCR及Western blot法检测目的基因的表达.结果 PCR及测序鉴定证实重组质粒pEGFP-C1_IL-12构建成功,RT-PCR及Western blot法证实重组质粒在HepG2细胞内正常表达.结论 携带报告基因(GFP)和双亚基目的基因(hIL-12,P35、P40)的重组真核质粒pEGFP-C1_IL-12构建成功,并能在人肝癌细胞系HepG2中表达. 相似文献
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目的:构建携带HBx基因的重组逆转录病毒载体,为进一步研究HBx基因在HBV相关性HCC(原发性肝癌)发病机制中的作用以及建立肝癌动物模型奠定基础.方法:根据基因库中已公布的HBx序列设计引物,采用PCR技术从HBx腺病毒质粒中扩增出HBx基因.将HBx基因克隆到逆转录病毒载体pSEB-HUS质粒中.酶切、PCR及测序鉴定后经脂质体介导转染L02细胞,Western Blotting检测HBx蛋白的表达.结果:PCR、酶切及测序鉴定证实目的基因正确克隆至逆转录病毒质粒pSEB-HUS中,目的基因序列与GENE BANK报道一致,转染L02细胞后荧光显微镜可观察到GFP的表达.Western Blotting检测可见HBx蛋白的表达.结论:成功构建HBx重组逆转录病毒载体. 相似文献
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乙型肝炎病毒X基因cDNA的克隆及真核表达载体的构建 总被引:5,自引:2,他引:5
目的为研究HBVX基因(HBx)与原发性肝细胞癌发生的关系,克隆HBx的cDNA并构建HBx真核表达载体。方法 利用逆转录聚合酶链反应(RT—PCR)方法从HepG2.2.15细胞中扩增出HBx的cDNA,克隆到质粒PCDNA3.1中。结果RT—PCR扩增出约460bp片段,经酶切鉴定显示HBx的cDNA真核表达载体(HBx—PCDNA3.1)构建成功,测序结果显示HBx的cDNA与已发表的的序列相同。结论成功地构建了HBx的真核表达载体HBx—PCDNA3.1。 相似文献
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前列腺组织特异性表达载体pPSA-EGFP的构建 总被引:1,自引:1,他引:0
目的:构建前列腺组织特异性表达载体。方法:利用基因重组技术将PSA基因上游5.8kb的调控序列克隆至真核表达载体pEGFP-1,构建前列腺组织特异性表达载体pPSA-EGFP;用脂质体Lipo-fectamine将载体pPSA-EGFP分别转染前列腺癌细胞株PC.3m、乳腺腺癌细胞株MCF-7、结肠腺癌细胞株HT-29、肝癌细胞株HepG2、宫颈癌细胞株HeLa和肺腺癌细胞株A549多种细胞,转染后48h荧光显微镜下观察GFP的表达情况,pPSA-EGFP和phAR共转染PC-3m细胞。结果:在pPSA-EGFP和phAR共转染的PC-3m细胞中绿色荧光蛋白表达明显,MCF-7细胞中绿色荧光蛋白表达微弱,其他细胞中荧光蛋白不表达。结论:构建的前列腺表达载体pPSA-EGFP具有组织特异性。 相似文献
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