三基因PCR检测志贺菌、副溶血弧菌和霍乱弧菌的研究

目的探索一种快速、经济、敏感的诊断方法,对常见的食品中的腹泻致病菌进行基因检测研究。方法建立一种快速标本处理和多基因PCR反应(multiplePCR)诊断方法,在一次PCR反应中同时扩增3种菌的致病基因:志贺菌的侵袭性(ipaH)基因、副溶血弧菌的热稳定直接溶血素(tdh)基因和霍乱弧菌Ο139的霍乱毒素(ctx)基因。扩增产物经电泳,出现与已知阳性对照细菌条带大小一致的条带即判断为阳性标本;另外对这些标准菌株进行Southernblot杂交鉴定。结果对标准志贺菌、副溶血弧菌和霍乱弧菌检测,多基因PCR法检测为阳性;PCR作为诊断方法较培养法阳性率高。结论三基因PCR具有简便、快速、特异、经济和不需要培养等特点,适用于食品检测。     

涂片与培养及PCR/RLB检测淋病奈瑟菌的比较研究

目的:建立以16SrRNA为靶基因的PCR-反向线点杂交技术(RLB)检测淋病奈瑟菌(Neisseria gonor-rhoeae,NG),并与涂片法及培养法比较。方法:选择NG16SrRNA基因设计一对PCR引物,生物素标记下游引物扩增NGDNA,然后与固定在尼龙膜上的特异性寡核苷核探针杂交。并对115例性病高危人群标本进行检测,然后与涂片法与培养法检测结果进行比较。结果:PCR扩增NGDNA的片段长度分别为414bp。通过对115例临床标本的检测,PCR/RLB的阳性率为31.3%,而涂片法和培养法的阳性率分别为15.7%和21.7%。结论:PCR/RLB是一种快速、敏感的检测方法,对NG感染的实验诊断具有十分重要的意义。     

应用核酸探针检测痢疾杆菌侵袭力的初步报告

采用菌落原位杂交法,用福氏5型痢疾杆菌大质粒上17Kb 基因片段,以32p 标记制备成探针,对80例痢疾志贺氏菌的侵袭力进行检测,结果带菌者菌株中侵袭力的阳性率92.8%,90.9%,病人菌株中袭力的阳性率侵P>0.05,两组菌的侵袭力差异无显著性。通过不同菌群侵袭力的分析,福氏痢疾杆菌侵袭力的阳性率似高于其他菌群,该探针特异、敏感、快速、经济,为硷测痢疾菌侵袭力的理想方法。     

结核分支杆菌异烟肼耐药基因的杂交检测

目的:探讨耐异烟肼结核分支杆菌的编码基因KatG和inhA基因的扩增以及突变情况.方法:采用PCR扩增技术对25株敏感株、35株耐药株及25例临床结核病人痰标本进行基因扩增;利用寡核苷酸探针反相斑点杂交技术对25株敏感株、35株耐药株及25例临床结核病人痰标本进行基因突变检测.结果:25株敏感株、35株耐药株KatG和inhA基因扩增均阳性;25例临床结核病人痰标本中KatG基因扩增阳性率为80%,inhA基因扩增阳性率为68%.结论:耐异烟肼菌株的基因突变率明显高于药物敏感株;PCR-寡核苷酸探针反相斑点杂交技术以其简便、快速、灵敏的特性能够为临床检测结核分支杆菌对异烟肼的耐药性提供初步依据.     

志贺菌6种毒力基因的多重PCR检测

目的:建立志贺菌6种毒力基因[志贺菌肠毒素I基因(setl)、志贺菌肠毒素2基因(sen)、侵袭性质粒抗原H基因(ipaH)、侵袭相关蛋白基因(ial)、志贺毒素1基因(stxl)及调控基因(virA)]的多重PCR鉴定方法,实现多基因的同时检测.方法:选掸志贺菌的6种毒力基因作为靶基因,以A群和C群4株标准及B群和D群4株临床分离株为模型,应用降落PCR方法在1个反应管中同时进行扩增,根据扩增片段大小定性判断结果.通过样本倍比稀释检验多重PCR的灵敏性,并在NCBI网站上用BLAST检索各引物的特异性.另选取河南省2001年至2007年115株志贺菌进行多重PCR检测,以验证多重PCR的可行性.结果:多重PCR能同时检测上述6种毒力基因,与单基因PCR分别检测6种毒力基因相比具有相近的灵敏度与特异性.应用多重PCR方法检测115株志贺菌,除stxl外,其余5种毒力基因的阳性率均在85%以上.结论:多重PCR鉴定志贺菌毒力基因具有简便、快速的特点,适用于毒力基因鉴定和流行病学调查研究.     

四种儿童常见肠道致病菌的多重PCR检测

目的 对儿童感染性腹泻能进行四种常见病原菌如肠致病性大肠埃希菌（enteropathogenic Escherichia coli,EPEC）、沙门菌属（Salmonella spp.）、志贺菌属(Shigella spp.)、空场弯曲菌(Campylobacter Jejuni)的快速检测。方法 建立多重PCR检测体系。结果 该方法用一次PCR即可检测四种肠道致病菌,灵敏度达10~100CFU/ml;同时利用16S rRNA基因的保守区域作为内参照,有利于对粪便标本的扩增进行质量控制;对粪便标本,整个检测过程约5 h。结论 通过检测编码细菌的毒力因子或特异性生化反应相关的酶的基因,多重PCR体系能特异、灵敏、快速地检测四种肠道致病菌;icsA基因可以作为志贺菌属检测的特异性靶基因;该方法可进一步完善成体外基因诊断试剂盒。     

结核分支杆菌异烟肼耐药基因的杂交检测

目的：探讨耐异烟肼结核分支杆菌的编码基因KatG和inhA基因的扩增以及突变情况。方法：采用PCR扩增技术对25株敏感株、35株耐药株及25例临床结核病人痰标本进行基因扩增；利用寡核苷酸探针反相斑点杂交技术对25株敏感株、35株耐药株及25例临床结核病人痰标本进行基因突变检测。结果：25株敏感株、35株耐药株KatG和inhA基因扩增均阳性；25例临床结核病人痰标本中KatG基因扩增阳性率为80％，inhA基因扩增阳性率为68％。结论：耐异烟肼菌株的基因突变率明显高于药物敏感株；PCR一寡核苷酸探针反相斑点杂交技术以其简便、快速、灵敏的特性能够为临床检测结核分支杆菌对异烟肼的耐药性提供初步依据。     

PCR技术应用于临床结核病的诊断研究

采用PCR(聚合酶链反应)技术,选择一对寡核苷酸引物,扩增的靶基因为克隆的PH_重组标准人型结核分枝杆菌2.4kb DNA。其基因片段是结核杆菌所特有,单一拷贝基因,与其他非典型分枝杆菌的基因无同源序列。研究结果表明:①扩增了人型和牛型结核杆菌标准株基因DNA 158bp 片段,而其他14种非典型分枝杆菌和金黄色葡萄球菌、脓杆菌 DNA 未扩增出相应产物.②10倍系列稀释人型结核菌 DNA,检测敏感性相当于10～50菌数/ml痰样。③60例临床肺结核病人痰样进行 PCR 技术检测和常规生物法测定比较,前者阳性率为58.3%,后者检测率11.70%。而20例非结核痰样用两种方法检测全为阴性。提示:PCR 技术诊断结核病快速、简易、特异、敏感、高效,是在基因水平上检测的一种新技术。     

LAMP快速检测沙门菌invA基因的方法建立与应用

目的：建立一种环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification, LAMP）,反应快速检测沙门茵的方法。方法：根据美国国立卫生研究院基因序列数据库（GenBank）上的鼠伤寒沙门菌的特异invA和fimA（登录号：M90846和M18283）基因序列,设计特异引物,提取标本DNA,然后以LAMP技术扩增invA基因,PCR方法扩增厅棚基因,采用琼脂糖电泳观察结果。结果：91份血培养阳性报警瓶,LAMP和PCR法检测出阳性18份,与最终培养结果一致;30份粪便标本,LAMP和PCR法检测出阳性5份,培养阳性3份,LAMP测限达到10^2CFU／mL。结论：LAMP是一种简便、快速、特异和敏感的检测临床和环境标本中沙门菌的有效方法。     

荧光PCR对从业人员肠道致病菌筛查的评价

目的评价荧光PCR法用于食品及公共场所从业人员肠道致病菌的筛查。方法随机采集12780份从业人员肛拭子标本用荧光PCR检测,以传统分离培养方法作为“金标法”进行对照,分析灵敏性和特异性。结果在12780份标本中,荧光PCR检测出沙门菌阳性14份,阳性率为1.10‰,培养法检测出10份,阳性率为0.78‰,沙门菌荧光PCR检测法的灵敏度为100％,特异性为99.97％。荧光PCR检测出志贺菌18份,阳性率为1.41‰,培养法检测出3份,阳性率为0.23‰,志贺菌荧光PCR法的灵敏度为100％,特异性为99.88％。结论荧光PCR法灵敏度性高,特异性强,简便快速,为从业人员健康检查提供了一套快速的筛查方法,值得广泛推广应用。     

兰州市志贺菌相关毒力基因

目的调查兰州市分离志贺菌株的毒力基因型。方法常规分离志贺菌,应用聚合酶链反应检测志贺菌肠毒素1基因（set1A和set1B）、志贺菌肠毒素2基因（sen）、侵袭性质粒抗原H基因（ipaH）、侵袭相关位点基因（ial）和多重调控基因（virA）。结果兰州市志贺菌毒力基因virA、set1A阳性率为100％;ipaH阳性率为93．7％;ial、sen、set1B阳性率分别为56．2％、62．5％、25．0％,set1B仅在福氏志贺菌Ⅳ型中检出。结论兰州市志贺菌中携带的毒力基因存在差异,virA、set1A和ipaH较稳定,可作为靶基因用于兰州市志贺菌的检验,set1B可用于筛选福氏志贺菌Ⅳ型菌株。     

A study on detecting and identifying enteric pathogens with PCR

Objective To develop a rapid and definite diagnostic test of bacterial enteritis caused by pathogenic enterobacteria, the most frequent etiologic agent of infectious enteritis in the world.Methods A set of conventional PCR assays were applied to detect and identify salmonella, shigella,and E. coli O157:H7 directly from pure culture and fecal samples.The general primers of pathogenic enterobacteria were located on the uidA gene, which were found not only in E. coli nuclear acid, but also in Shigella and salmonella genes.Shigella primer was from ipaH gene whose coded invasive plasmid relative antigen existed both in plasmid and in genome.The primers of salmonella were designed from the 16SrRNA sequence.The primer of E.coli O157:H7 was taken from eaeA gene.Five random primers were selected for RAPD. The detection system included common PCR,semi-nested PCR and RAPD. Results This method was more sensitive, specific and efficient and its processing was rapid and simple. For example, the method could be used to specifically detect and identify salmonella, shigella, and E. coli O157:H7,and its sensitivity ranged from 3 to 50CFU, and its detection time was 4 hours. Conclusion This PCR method, therefore, can serve as a routine and practical protocol for detecting and identifying pathogenic microorganisms from clinical samples.     

PCR检测与细菌培养方法在细菌性痢疾监测中的应用比较

目的 通过与PCR检测比较，确定细菌培养方法对细菌性痢疾疾病负担的低估程度。方法 从2002年细菌性痢疾监测研究获得的10105份腹泻标本中随机选取337份，采用针对ipaH基因的PCR方法检测其志贺菌感染，并同传统细菌培养方法进行比较。结果 337份腹泻标本中检测到ipaH基因212份，检出率为62．9％；而粪便培养阳性为39份，检出率为11．6％（P〈0．001）。Logistic回归分析显示影响PCR检出的因素依次为细菌培养结果（OR=15．5；95％CI：2．0-119．0），具有发热症状（OR=2．8；95％CI：1．2-6．2），菌痢流行季节的腹泻（OR=2．4；95％CI：1．4-4．3）及女性病例（OR=1．8；95％CI：1．1-3．0）。结论 与PCR检测相比，传统细菌培养方法使得菌痢的发病率在相当大的程度上被低估。     

临床分离志贺菌中质粒介导磷霉素耐药基因的检测

目的在磷霉素耐药志贺菌中检测质粒介导的磷霉素耐药基因fosA、fosA3和fosC2,并分析其传播方式。方法
　　琼脂倍比稀释法测定志贺菌对抗菌药物的最低抑菌浓度(MIC)。在磷霉素耐药菌株中利用聚合酶链式反应(PCR)检测其质粒介导的磷霉素耐药基因fosA、fosA3和fosC2。对阳性扩增产物进行测序分析并对阳性菌株进行接合试验,采用琼脂倍比稀释法测定接合子对12种抗菌药物的MIC值, PCR法检测接合子质粒介导磷霉素耐药基因,肠杆菌科基因间的重复序列PCR( ERIC-PCR)法对阳性菌株进行同源性分析。结果263株志贺菌中磷霉素耐药25株、中介7株,耐药率为9．5%。 PCR结果显示18株磷霉素耐药志贺菌fosA3阳性(基因登录号为KJ716852),阳性率为6.8%,未检出fo-sA和fosC2。18株fosA3阳性株中,13株结合成功,与受体菌相比,结合子对磷霉素的MIC值明显提高, ERIC-PCR法证实部分fosA3阳性志贺菌具有同源性。结论首次在临床分离的志贺菌中检测到质粒介导的磷霉素耐药基因fosA3,虽然目前检出率不高,但其传播可造成磷霉素耐药性的扩散,需要加强监测。     

鼻咽癌候选侵袭和转移相关基因的筛选

目的筛选影响鼻咽癌侵袭和转移能力的相关基因。方法利用cDNA基因芯片,比较高转移鼻咽癌细胞株5_8F和非转移鼻咽癌细胞株6-10B之间的差异表达基因,并利用在线Milano程序筛选鼻咽癌侵袭和转移相关基因,GOstat分析这些基因功能,最后荧光定量PCR鉴定差异表达基因。结果芯片分析结果显示,鼻咽癌细胞株5—8F与6-10B之间共有200多个差异表达基因。基于Milano程序分析后,发现与侵袭和转移能力相关的基因有33个,其中27个上调,6个下调。GOstat分析显示,这些基因参与了细胞移动、调节凋亡、细胞黏附等。结论经在线Milano程序分析鉴定的鼻咽癌5—8F和6-10B细胞株之间的这33个差异表达基因可能参与了鼻咽癌的侵袭和转移。     

PCR检测细菌的侵袭相关基因

目的：探讨ＰＣＲ检测细菌的侵袭相关基因方法的效果。方法：检测５４份腹泻患者粪便标本，采用ＰＣＲ法扩增志贺菌与大肠埃希菌的侵袭相关基因ｉａｌ。结果：ｉａｌ基因阳性率３３．３％，常规细菌培养鉴定方法阳性率２４．１％，前者缩短了检测时间，提高了灵敏度。结论：用ＰＣＲ方法检测细菌的侵袭相关基因可能更适于临床检验、流行病学调查，并可早期指导临床治疗     

分子信标PCR检测志贺菌ipaH基因

目的用分子信标探针PCR快速检测志贺菌属(Shigella)。方法根据GenBank上公布的福氏志贺菌M32063株ipaH基因序列,设计引物和分子信标探针,以4种细菌进行对照,进行特异性和灵敏度分析,建立Shigella的实时PCR技术快速检测,应用于食物中毒和食品检测。结果检测20个样本,Shigella呈阳性,其它呈阴性,时间约2h。结论Shigella分子信标探针技术具有快速、灵敏度高、特异性强等特点,可用于Shigella食物中毒快速诊断和食品微生物检测,为食源性疾病的早期、准确诊断提供新的检测手段。     

FTA滤膜结合PCR快速检测肉中志贺氏菌

目的建立一种肉中志贺氏菌的快速检测方法。方法利用FTA（Flinders Technology Associates）滤膜从肉中提取志贺氏菌基因组DNA,以志贺氏菌属的ipaH基因为模板设计引物进行PCR反应得到369 bp片段,经测序证实该片段为目的扩增产物。结果采用建立的FTA滤膜结合PCR检测肉中志贺氏菌的方法,人工污染牛肉、羊肉、猪肉、鸡肉匀浆液的检出限均为8×101CFU/ml匀浆,6 h即可完成整个检测过程。结论该方法灵敏度高、耗时短,为预防志贺氏菌食物中毒、控制细菌性痢疾的暴发流行提供了新的检测方法。     

LAMP和PCR法检测痢疾志贺菌的特异性和灵敏性比较

目的建立环介导等温扩增技术(LAMP)快速检测痢疾志贺菌,并对其特异性、灵敏度与传统PCR进行比较。方法以痢疾志贺菌侵袭性质粒抗原H基因(ipaH)为靶序列,设计6条特异性引物(内引物、外引物和环引物各2条),优化LAMP反应体系及反应条件,检测LAMP反应的灵敏度、特异性及模拟样品,同步与PCR进行比较。结果 LAMP法和PCR均能特异性地扩增出志贺菌靶DNA,而其他非志贺菌均未扩增出特有条带。检测细菌纯培养物和模拟食品的灵敏度LAMP法分别为5.3×101cfu/ml、6.8×101cfu/ml,PCR法分别为5.3×102cfu/ml和6.8×102cfu/ml。结论利用LAMP技术,可快速、灵敏、简便地检测痢疾志贺菌,与PCR方法比较,特异性强、操作简便、检测成本低、耗时短,有望发展成为快速检测痢疾志贺菌的有效手段。     

薯蓣皂苷元通过调控miR-34a及其靶基因发挥抗胃癌作用

目的探讨薯蓣皂苷元对人胃癌细胞AGS的增殖、克隆形成、迁移及侵袭的抑制作用及可能机制。方法采用细胞增殖抑制率法检测薯蓣皂苷元对胃癌细胞AGS的增殖抑制率,平板克隆形成实验检测其对AGS细胞克隆形成能力的影响,划痕实验观察薯蓣皂苷元对胃癌细胞迁移作用的影响,细胞侵袭实验检测其对AGS细胞侵袭作用的影响。采用小分子核糖核酸(miRNAs)靶基因预测方法预测miRNA-34a(miR-34a)靶基因,实时定量聚合酶链反应(qPCR)方法观察薯蓣皂苷元对AGS细胞miR-34a及其靶基因转录因子E2F1、E2F3、细胞周期蛋白D1(CCND1)表达水平的影响,并分析其与胃癌患者预后。结果 24、30、36、42μmol/L及48μmol/L浓度的薯蓣皂苷元均可显著抑制胃癌AGS细胞增殖,其作用与时间及浓度呈正相关;克隆形成实验显示24、30、36、42μmol/L及48μmol/L浓度的薯蓣皂苷元可抑制AGS细胞克隆形成能力(P<0.01);24、30、36、42μmol/L及48μmol/L浓度的薯蓣皂苷元处理后的胃癌细胞迁移及侵袭能力均显著降低(P<0.01),且其作用与时间、浓度呈正相关。36μmol/L浓度的薯蓣皂苷元作用于AGS细胞后,可显著提高miR-34a表达水平,并降低miR-34a靶基因E2F1、E2F3及CCND1表达水平;E2F1、E2F3及CCND1基因表达与胃癌患者预后呈显著负相关。结论薯蓣皂苷元可能通过调控miR-34a,下调E2F1、E2F3及CCND1基因表达,发挥抑制胃癌AGS细胞的增殖、克隆形成、迁移及侵袭功能。