以超顺磁性氧化铁标记的神经干细胞移植后的磁共振成像示踪研究

目的探讨神经干细胞移植后存活细胞迁徙及分化的无创性监测方法。方法采用超顺磁性氧化铁（SPIO）纳米粒子和5溴2脱氧尿嘧啶核苷（Brdu）在体外对神经干细胞进行双标记，然后移植至大脑中动脉梗死大鼠模型（MCAO）的脑内（健侧）。术后1d以及1、2、3、4、5和6周，采用磁共振仪检测标记细胞的迁徙。第6周磁共振扫描后处死大鼠，依据磁共振成像（MRI）提示的移植细胞迁徙部位切取脑组织，进行普鲁士蓝染色和免疫组织化学染色，观察神经干细胞的迁徙及分化情况。结果移植后3周，MRI显示细胞沿胼胝体迁徙的条带状低信号，并在随后的定期MRI中观察到其向中线移动，脑组织标本普鲁士蓝染色及免疫组织化学染色的阳性位置与MRI结果一致，而且移植的神经干细胞可以分化为星形胶质细胞及神经元。结论MRI可动态监测SPIO标记的神经干细胞移植后在体内的迁徙路径，且对受者无创。     

磁性荧光双标人骨髓间充质干细胞归巢至大鼠急性损伤肝组织示踪显像

目的观察磁粒子和荧光染料双标人骨髓间充质干细胞归巢至大鼠急性损伤肝组织的示踪。方法以超顺磁性氧化铁(SPIO)和氯甲基苯甲酰氨(CM-Dil)标记永生化人骨髓间充质干细胞(UE7T-13)。普鲁士蓝染色检测细胞内铁,荧光显微镜和流式细胞仪检测CM-Dil标记阳性率。建立12只急性肝损伤大鼠模型,分为实验组(n=6)和对照组(n=6),将标记细胞经尾静脉移植入实验组大鼠,未标记细胞移植入对照组大鼠。分别于移植前3h、移植后3h、3天、5天、7天应用MR T2*W、T2*map对大鼠活体成像,获得肝脏R2*值。并与肝脏组织切片普鲁士蓝染色和CM-Dil荧光表达情况对照。结果双标细胞的SPIO-PLL标记率接近100%,流式细胞仪检测CM-Dil标记阳性率达99.97%。实验组细胞移植后3天、5天肝脏R2*值均较移植前明显升高(t=7.282、7.608,P均0.01),对照组细胞移植后各时间点与移植前比较,R2*值差异均无统计学意义(F=0.99,P0.05)。普鲁士蓝阳性细胞主要分布于肝小叶中央静脉周围病变区,荧光显微镜下观察红色荧光阳性细胞与普鲁士蓝阳性细胞分布基本一致。结论 SPIO和CM-Dil可有效标记人永生化骨髓间充质干细胞(UE7T-13),不影响细胞增殖能力,临床应用型1.5T MR可对磁粒子标记的UE7T-13进行肝归巢活体示踪,CM-Dil有助于证实存活干细胞的肝内定植。     

磁标记猪骨髓间充质干细胞自体肝内移植后MR活体示踪研究

目的探讨利用磁共振成像对移植肝脏的磁标记猪骨髓间充质干细胞进行活体示踪的可行性。方法获取猪自体骨髓间充质干细胞,分离、培养、扩增。应用菲立磁（Feridex）标记细胞,普鲁士蓝染色鉴定,标记细胞组（n=6）和未标记细胞组（n=4）行经门静脉行肝内移植,分别于移植前,移植后6h、3d、7d行磁共振T1WI,T2WI,GRE序列成像,7d后行组织切片普鲁士蓝染色。结果：普鲁士蓝染色表明MSCs的标记率达接近100％,磁标记MSCs肝内移植后行磁共振T2＊WI序列呈明显低信号改变,并持续至细胞移植后7d,组织切片普鲁士蓝染色显示7d后肝内仍有移植的磁标记细胞存在于肝实质及肝窦中。结论利用SPIO可以在体外成功标记猪骨髓间充质干细胞,磁共振成像可以对经门静脉移植到肝内的磁标记MSCs进行活体示踪。     

磁共振技术行移植细胞在体示踪

目的寻找一种能够对移植细胞进行在体示踪方法,为细胞的迁移、分布及心功能改善机制的研究提供更多的信息。方法将超顺磁性氧化铁(SPIO)和骨髓间充质干细胞(MSCs)共同孵育培养36h。普鲁士蓝染色评价细胞的标记效率;MTT比色实验评价SPIO对细胞生长能力的影响;台盼蓝染色检验标记后细胞的活性;应用Costar Transwell方法评价铁离子对细胞迁移能力的影响;用细胞分化诱导液培养标记后的细胞评价其分化能力。将标记的细胞移植到中华小型猪心肌内。通过心脏MRI进行连续的在体示踪观察。细胞移植后不同时期取动物心脏切片进行普鲁士蓝染色观察移植细胞。结果MSCs经铁离子标记后,普鲁士蓝染色标记效率>95%,此试剂不影响细胞增殖,标记后98%的细胞保持活性,可继续培养、传代,迁移能力和分化能力未受影响。动态观察显示SPIO标记细胞在MRI影像上表现为低密度灶影或信号缺失,并且在移植后4周仍可显影。病理学检查可以看到移植细胞呈普鲁士蓝染色阳性,与影像学有很好的一致性。结论磁共振对比剂SPIO可以安全、有效的标记骨髓间充质细胞,并可通过心脏MRI进行持续的在体示踪。     

新型MRI磁标记技术对兔骨髓基质干细胞自体皮下移植进行活体示踪的研究

目的 利用超顺磁性氧化铁(SPIO)粒子标记骨髓基质干细胞(BMSCs),探讨用0.2T MRI活体示踪自体皮下移植磁化标记BMSCs的分布和迁移的可行性. 方法 从兔骨髓中分离培养BMSCs,实验组经体外采用SPIO和BrdU双重标记后,与壳聚糖复合植入兔自体大腿皮下.设立自体皮下移植未标记BMSCs组和皮下单纯注射SPIO组为对照组,每组6只.于术后1、5 d及2、4、8周连续行MRI梯度回波T2加权(GRE T2* WI)扫描序列对磁标记细胞成像示踪,并行组织学检查. 结果 磁标记细胞普鲁士蓝染色和电镜检查显示细胞胞浆内含致密铁颗粒.磁标记后自体皮下移植的兔BMSCs在GRE T2* WI序列成像时产生特征性的低信号改变至少维持8周,并观察到从移植部位发出低信号线进入宿主组织.组织学检查显示宿主组织中发现普鲁士蓝阳性细胞和BrdU阳性细胞.结论 体外SPIO能有效地标记BMSCs,利用0.2T MRI活体示踪体自体皮下移植的磁标记兔BMSCs分布和迁移是可行的.     

急性肝损伤后猪自体骨髓间充质干细胞肝内移植的MR活体示踪实验研究

目的 探讨应用临床型1.5T磁共振活体示踪磁标记猪骨髓间充质干细胞(MSCs)自体移植肝脏的可行性.方法 获取、分离、培养、扩增猪骨髓MSCs.应用菲立磁标记细胞,普鲁士蓝染色鉴定,建立急性肝损伤模型,分为标记细胞组(n=6)和未标记细胞组(n=4)经门静脉行肝内移植,分别于移植前,移植后6 h、3 d、7 d、14 d行磁共振FFE(T_2WI)序列成像,14 d后行组织切片普鲁士蓝染色.结果 普鲁士蓝染色表明MSCs的标记率达100%,磁标记MSCs肝内移植后行磁共振T_2WI序列呈明显低信号改变,并持续至细胞移植后14 d,组织切片普鲁士蓝染色显示14 d后仍有磁标记细胞存在于肝实质及肝窦中.结论 利用菲立磁可以在体外成功标记猪骨髓间充质干细胞,磁共振成像可以对经门静脉移植到肝内的磁标记MSCs进行活体示踪.     

尿嘧啶脱氧核苷及超顺磁性氧化铁双标记的神经干细胞活体移植后细胞迁徙及功能性分化的实验研究

目的观察尿嘧啶脱氧核苷(Brdu)及超顺磁性氧化铁(SPIO)双标记的神经干细胞活体移植后存活细胞的迁徙及分化。方法SPIO和Brdu对神经干细胞进行双标记,移植至大脑中动脉梗死模型的对侧脑组织,术后采用MRI监测。第6周MRI检查后取组织切片行免疫组织化学染色,观察神经干细胞的迁徙及分化。结果双标神经干细胞活体移植后第3周MRI开始显示细胞沿胼胝体迁徙,第6周脑组织免疫组织化学染色亦显示干细胞沿胼胝体向对侧迁徙,免疫组织化学荧光双标染色显示移植的神经干细胞可以分化为星形胶质细胞及神经元。结论移植存活的神经干细胞在迁徙过程中能够进行功能性分化。     

大鼠骨髓内皮祖细胞SPIO体外标记的实验研究

目的探索体外超顺磁性氧化铁(superparamagnetic iron oxide,SPIO)标记大鼠骨髓内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)及其条件优化,为下一步EPCs活体示踪实验奠定基础。方法采用密度梯度离心法分离培养大鼠骨髓EPCs,不同浓度的SPIO体外标记EPCs,普鲁士蓝染色测定细胞标记率,MTT法检测细胞增殖力,台盼蓝染色检测细胞活力。结果 EPCs培养约7 d逐渐生长呈单层排列,SPIO浓度为50μg/m L时普鲁士蓝染色显示标记率达到90%,标记后的EPCs生长状态良好,能正常贴壁生长并传代,台盼蓝染色及MTT法显示此时细胞活力及增殖能力最强。结论 SPIO浓度为50μg/mL时标记EPCs其标记率高,不影响细胞的活力及增殖能力,可为下一步EPCs活体示踪实验奠定基础。     

新型超顺磁性氧化铁标记血管内皮祖细胞的实验研究

目的 研究新型超顺磁性氧化铁(SPIO)标记骨髓源血管内皮祖细胞(EPCs)对其生物学影响,提高其标记效率及安全性.方法 采用梯度离心结合贴壁法分离纯化SD大鼠骨髓源EPCs并鉴定,以3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTS)修饰Fe2O3配制成SPIO,用六种不同浓度SPIO(0 μg/ml、6.25 μg/ml、12.5 μg/ml、25 μg/ml、50 μg/ml、100 μg/ml)分别转染标记EPCs,对标记后的EPCs行普鲁士蓝染色、台盼蓝染色、透射电镜、噻唑蓝(MTT)检测、流式细胞仪检测细胞凋亡与细胞周期,探讨不同SPIO浓度对EPCs标记效率、细胞活性及增殖的影响.结果 普鲁士蓝染色显示EPCs呈浓度依赖性摄取SPIO,培养基中Fe3+浓度为25 μg/ml时,标记效率最高,可见95％以上EPCs普鲁士蓝染色阳性;当Fe3+浓度小于12.5 μg/ml时,染色阳性细胞数小于50％;当Fe3+浓度为100μg/ml时活细胞数目小于40％,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05).台盼蓝染色显示随着标记浓度的升高,细胞活力逐渐升高.当SPIO浓度超过50 μg/ml,细胞活性逐渐降低.透射电镜可见EPCs超微结构保存良好,大量的高密度SPIO颗粒,主要位于溶酶体内、滑面内质网、线粒体等细胞器的膜结构上.MTT测试及细胞凋亡与周期检测表明SPIO标记对EPCs存活、增殖的能力无明显影响,标记后的EPCs可用于进一步干细胞示踪研究.结论 梯密度离心结合贴壁法可分离出血管内皮祖细胞进行体外增殖分化.APTS修饰Fe2O3配制而成的新型SPIO可简便标记EPCs,并且在适当浓度下对MSCs的生物学活性没有影响,为后期的活体MRI示踪于细胞移植实验奠定基础.     

超顺磁氧化铁、绿色荧光蛋白双标胶质细胞源性神经营养因子基因修饰中脑神经前体细胞的建立

目的 建立超顺磁氧化铁(SPIO)、绿色荧光蛋白(EGFP)双标胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)基因修饰中脑神经干细胞.方法 以质粒pEGFPNl-GDNF转染大鼠胚胎中脑神经干细胞,SPIO标记细胞.荧光显微镜、免疫细胞化学和Western blot鉴定EGFP、GDNF表达;普鲁士蓝染色、透射电镜鉴定SPIO标记率;诱导分化后免疫细胞化学鉴定其分化能力.结果 基因转染12 h后EGFP开始表达;免疫细胞化学、Western blot表明GDNF能正确表达;普鲁士蓝染色示SPIO标记率达100%,透射电镜示SHO颗粒位于吞饮小泡和胞质内;体外诱导分化研究表明SPIO、EG-FP双标记不影响其分化.结论 成功建立SPIO、EGFP双标GDNF基因修饰中脑神经干细胞.     

磁共振成像监测大鼠肝脏内经超顺磁铁氧化物标记的胰岛移植物

目的 探讨磁共振成像(MRI)监测胰岛移植物的可行性.方法 在体外利用超顺磁铁氧化物(SPIO)标记大鼠胰岛,然后移植至用链佐星诱导的糖尿病大鼠肝脏内,同系移植标记组供、受者均为Wistar大鼠,同种移植标记组供者为Lewis大鼠,受者为Wistar大鼠.并设同系移植对照组(供、受者均为Wistar大鼠)和同种移植对照组(供者为Lewis大鼠,受者为Wistar大鼠),胰岛移植物未经SPIO标记.术后定期利用MRI监测肝内胰岛移植物,监测受者的血糖,并抽取动物,对其肝脏进行病理检查.结果 只有SPIO标记的胰岛移植物能被MRI检测到.经MRI检测,同系移植标记组术后第1、2、3周胰岛移植物的相对数量分别为(89.6±2.2)%、(87.5±14.4)%和(74.5±19.5)%,同种移植标记组术后第1、2、3周的相对数量分别为(43.2±17.2)%,(36.5±13.0)%和(26.5±17.4)%,组间相同时间点两两比较,差异有统计学意义(P<0.05).同系移植标记组血糖始终维持在正常水平,肝脏中能检测到胰岛素免疫组化和普鲁士蓝染色双阳性细胞;而同种移植标记组移植1周后的血糖水平超过16.8 mmol/L,肝脏中无法找到形态完整的胰岛.结论 MRI监测结果与血糖监测和病理检查结果一致,但它可直观、无创、连续地监测胰岛移植物在体内分布和存活情况.     

In vivo tracing of superparamagnetic iron oxide-labeled bone marrow mesenchymal stem cells transplanted for traumatic brain injury by susceptibility weighted imaging in a rat model

Objective：To label rat bone marrow mesenchymal stem cells （BMSCs） with superparamagnetic iron oxide （SPIO） in vitro, and to monitor the survival and location of these labeled BMSCs in a rat model of traumatic brain injury （TBI） by susceptibility weighted imaging （SWI）sequence.Methods：BMSCs were cultured in vitro and then labeled with SPIO. Totally 24 male Sprague Dawley （SD） rats weighing 200-250 g were randomly divided into 4 groups： Groups A-D （n=6 for each group）. Moderate TBI models of all the rats were developed in the left hemisphere following Feeney＇s method. Group A was the experimental group and stereotaxic transplantation of BMSCs labeled with SPIO into the region nearby the contusion was conducted in this group 24 hours after TBI modeling. The other three groups were control groups with transplantation of SPIO, unlabeled BMSCs and injection of nutrient solution respectively conducted in Groups B, C and D at the same time. Monitoring of these SPIO-labeled BMSCs by SWI was performed one day,one week and three weeks after implantation.Results： Numerous BMSCs were successfully labeled with SPIO. They were positive for Prussian blue staining and intracytoplasm positive blue stained particles were found under a microscope （×200）. Scattered little iron particles were observed in the vesicles by electron microscopy （×5000）. MRI of the transplantation sites of the left hemisphere demonstrated a low signal intensity on magnitude images,phase images and SWI images for all the test rats in Group A, and the lesion in the left parietal cortex demonstrated a semicircular low intensity on SWI images, which clearly showed the distribution and migration of BMSCs in the first and third weeks. For Group B, a low signal intensity by MRI was only observed on the first day but undetected during the following examination. No signals were observed in Groups C and D at any time points.Conclusion：SWI sequence in vivo can consecutively and noninvasively trace and demonstrate the status and distribution of BMSCs labeled with SPIO in the brain of TBI model rats.     

PEI/SPIO对骨髓间充质干细胞生物学特性的影响

目的探讨应用新型聚乙烯酰胺（PEI）包覆的超顺磁性氧化铁（SPIO）标记骨髓间充质干细胞（bMSCs）对其生物学特性的影响。方法分离、培养贵州小香猪bMSCs,选取第3代bMSCs,用含铁浓度为4、6、8、10、12μg/ml的DMEM/F12培养液孵育24h,未标记组为对照。通过普鲁士蓝染色、透射电镜检查、胎盼蓝染色、MTT检测及成骨、成软骨、成脂诱导分化实验,探讨不同PEI/SPIO浓度对bMSCs标记效率、细胞活性、增殖及分化的影响。结果铁浓度为8μg/ml以上的SPIO标记bMSCs后,普鲁士蓝染色标记效率均接近100%。与对照组相比,Fe浓度为4、6、8μg/ml的PEI/SPIO标记的bMSCs活细胞比率均在95%以上,差异无统计学意义（P〉0.05）;而Fe浓度为10μg/ml时,活细胞比率约为（80.24±1.34）%,Fe浓度为12μg/ml时,活细胞比率约为（75.44±2.33）%,两者对细胞的活性有明显的抑制作用（P〈0.05）。4、6、8g/ml的PEI/SPIO标记的bMSCs成骨、成软骨及成脂分化与正常对照组相比无明显差异,而10、12ug/ml组在诱导培养过程中大部分细胞死亡。结论含铁浓度8μg/ml是PEI/SPIO标记干细胞的适宜浓度,既能高效地标记bMSCs,又不影响bMSCs的细胞活性及增殖分化能力等生物学特性。     

超顺磁性纳米铁颗粒标记许旺细胞及体外磁共振示踪的实验研究

目的 研究超顺磁性纳米铁颗粒(SPIO)体外标记小鼠许旺细胞(SCs)及MRI成像示踪的可行性.方法 分离、纯化新生C57BL/6小鼠(5～7 d)的许旺细胞,取已分别用25.0 μg/ml、50.0 μg/ml浓度SPIO标记的0.5×106、1.0×106、5.0×106个许旺细胞,普鲁士蓝染色和透射电镜观察标记细胞内铁颗粒的分布情况,并用不同MRI扫描序列,测定标记的细胞群信号.结果 0.5×106、1.0×106、5.0×106小鼠许旺细胞与不同浓度的SPIO共同培养24 h后,普鲁士蓝染色见细胞内有许多蓝染的铁颗粒;透射电镜检查显示致密的铁颗粒位于细胞的吞噬泡或溶酶体中.体外MRI呈明显的低信号改变,以T2WI和GRE/30°序列改变最为明显.结论 SPIO可以标记小鼠许旺细胞,应用MRI可以对其进行体外示踪和监测.     

In vivo MR imaging tracking of magnetic iron oxide nanoparticle labeled, engineered, autologous bone marrow mesenchymal stem cells following intra-articular injection

ObjectiveTo track superparamagnetic iron oxide nanoparticle (SPIO)-labeled, bone-derived mesenchymal stem cells (MSCs) by in vivo magnetic resonance imaging (MRI) with a 1.5 T-system following injection of engineered autologous MSCs into the knee joint cavity in rabbit articular cartilage defect models.MethodsRabbit MSCs were labeled with SPIO and a transfection agent. Cell viability, proliferation and differentiation capacity were assessed in vitro using appropriate functional assays. Cells underwent GRE T2*-weighted MRI in vitro. The autologous MSCs seeded in chitosan and glycerophosphate (C-GP) gel were injected into the knee joint cavity of rabbit models for cartilage defects. All rabbits underwent GRE T2*-weighted MRI 1, 4, 8 and 12 weeks post-injection. MR imaging findings were compared histologically.ResultsNanoparticles were stained with Prussian blue and observed by transmission electron microscopy inside the cells. Cell viability, proliferation, and differentiation were comparable between labeled and non-labeled cells. After intra-articular injection of labeled autologous MSCs, marked hypointense signal void areas representing the injected MSCs can be observed for at least 12 weeks on GRE T2*-weighted images. At 12 weeks post-injection, labeled MSCs migrated into the synovial fluid at the suprapatellar bursa, the popliteal space site and subchondral bone of the femur but no MSCs were detected in the defect. Histochemical staining confirmed the presence of Prussian blue-positive cells and BrdU-positive cells.ConclusionsMRI would be an efficient noninvasive technique to visually track SPIO-labeled seed cells in vivo; the engineered autologous MSCs do not actively participate in the repair of articular cartilage defects following intra-articular injection.