转化生长因子-β1促进失神经骨骼肌肌源性干细胞表达胶原纤维的研究

目的 探讨转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)对体外失神经骨骼肌肌源性干细胞(MDSCs)表达和合成细胞外基质的影响.方法 采用差速贴壁法分离出大鼠失神经骨骼肌MDSCs,培养基中加入TGF-β1.将体外培养的细胞分为2组:A组,对照组;B组,10μg/L TGF-β1.在相差显微镜下观察细胞生长情况,利用免疫细胞化学方法和RT-PCR检测MDSCs中COL-Ⅰ和COL-Ⅲ的表达和合成.结果 在体外,失神经骨骼肌MDSCs低表达和合成COL-Ⅰ和COL-Ⅲ.TGF-β1作用24h后,失神经骨骼肌MDSCs中COL-Ⅰ和COL-ⅢmRNA的表达开始增高,48h时COL-ⅠmRNA表达达峰值,之后一直持续高表达,COL-ⅢmRNA表达缓慢增高,在5d时达最高峰;3d时COL-Ⅰ的合成升高最显著,5d时COL-Ⅲ的合成增加最明显.结论 TGF-β1能加强失神经骨骼肌MDSCs合成和分泌细胞外基质,促进失神经骨骼肌纤维化.     

丹参抑制转化生长因子-β1诱导的肌源性干细胞向肌成纤维母细胞分化

目的 观察丹参对失神经骨骼肌肌源性干细胞(MDSCs)向肌成纤维母细胞分化的抑制作用.方法 采用差速贴壁法分离出大鼠失神经骨骼肌MDSCs,加入转化生长因子-β1(TGF-β1)和丹参进行干预,将细胞分为3组:A:对照组;B:10 μg/L TGF-β1组;C:10 μg/L TGF-β1+ 150 mg/L丹参组.荧光实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)和Western blot检测各组细胞在干预后5个时间点α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和波形蛋白(Vimentin) mRNA和蛋白表达.结果 与A组比较,B组和C组细胞α-SMA、Vimentin的mRNA在干预后第2、3、5、7天均明显升高(P＜0.05),其蛋白表达在干预后第3、4、6、8天亦显著升高(P＜0.05);与B组比较,C组细胞α-SMA、Vimentin的mRNA和蛋白在对应时间点均明显降低(P＜0.05).结论 丹参能抑制TGF-β1诱导的失神经骨骼肌MDSCs向肌成纤维母细胞的分化.     

丹参抑制骨骼肌肌源性干细胞合成胶原蛋白的机制研究

目的 研究丹参抑制体外骨骼肌肌源性干细胞(MDSCs)合成胶原纤维的机制.方法 采用差速贴壁法分离大鼠骨骼肌MDSCs,利用TGF-β1诱导MDSCs表达胶原纤维,观察丹参对细胞的作用.将体外培养的细胞分为四组,A组:对照组；B组:150 mg/L丹参组；C组:10 μg/L TGF-β1组；D组:10μg/LTGF-β1+ 150 mg/L丹参组.利用免疫细胞化学方法,RT-PCR及Western Blot检测MDSCs中Smad3和COLⅠ表达.结果 在体外,TGF-β1能加强Smad3表达,诱导MDSCs表达胶原蛋白,丹参能拮抗TGF-β1的作用,降低细胞Smad3和COL Ⅰ的表达和合成水平.结论 丹参可以抑制MDSCs表达和合成细胞外基质,其机制是通过干预TGF-β1-Smad3信号通路,抑制MDSCs分化,从而降低细胞合成和分泌胶原纤维.     

丹参抑制骨骼肌肌源性干细胞成纤维样分化作用的研究

目的 研究丹参对体外培养的骨骼肌肌源性干细胞(MDSCs)纤维样分化的作用.方法 采用差速贴壁法分离出大鼠MDSCs,利用TGF-β1诱导MDSC向成纤维样细胞分化,观察丹参对细胞成纤维样分化的影响.将体外培养的细胞分为3组:A组,对照组;B组,10 ng/ml TGF-β1组;C组,10 ng/ml TGF-β1+150 mg/L丹参组.在放大400倍相差显微镜下观察细胞生长情况,利用免疫细胞化学方法、RT-PCR、Western Blot检测MDSCs表达CTGF、COLⅠ、COL Ⅲ的情况.结果 在体外,TGF-β1能加强MDSCs表达结缔组织生长因子(CTGF)和胶原蛋白,丹参拮抗TGF-β1的作用,降低细胞CTGF、COLⅠ、COL Ⅲ mRNA的表达水平,降低CTGF、COLⅠ、COL Ⅲ蛋白的水平.结论 丹参可以抑制TGF-β1诱导MDSCs成纤维样分化作用.其机制可能是抑制CTGF表达,从而降低细胞合成和分泌胶原纤维,抑制细胞成纤维样分化.

Abstract：

Objective To investigate the effect of Salvia miltiorrhiza on fibroblastic differentiation of skeletal muscle-derived stem cells (MDSCs) in vitro. Methods MDSCs in rats were isolated by the method of adhering to culture plastic at different time points. Fibroblastic differentiation of MDSCs was induced by TGF-β1 administration and the effects of Salvia miltiorrhiza on fibroblastic differentiation were observed. The cells cultivated in vitro were divided into three groups according the supplement of TGF-β1 and Salvia miltiorrhiza in culture media: group A (control group) had no TGF-β1 and Salvia miltiorrhiza;group B had 10 ng/ml TGF-β1;group C had 10 ng/ml TGF-β1 and 150 mg/L Salvia miltiorrhiza. Cell growth was observed using phase contrast microscope. The expressions of CTGF,COLⅠand COL Ⅲ in each group were detected by immunocytochemistry,RT-PCR and Western Blot. Results In vitro,TGF-β1 promoted the expression of CTGF and collagens of MDSCs. However,the effect of TGF-β1 could be inhibited by Salvia miltiorrhiza,resulting in decreased mRNA and protein expression of CTGF,COLⅠand COL Ⅲ. Conclusion Salvia miltiorrhiza could inhibit fibroblastic differentiation of MDSCs induced by TGF-β1. The mechanism might be that inhibition of CTGF expression reduces the synthesis and secretion of collagen fibers and in turn inhibits the fibroblastic differentiation.     

CTGF shRNA表达质粒的构建及对大鼠肌源性干细胞CTGF表达的影响

目的 观察针对结缔组织生长因子(CTGF)所构建的短发卡RNA(shRNA)对转化生长因子β1(TGF-β1)诱导大鼠肌源性干细胞(MDSCs)表达CTGF的影响.方法 针对CTGF mRNA上的序列,体外合成表达shRNA的DNA质粒载体pGenesil-3-shRNA并行测序鉴定;从新生SD大鼠骨骼肌中分离培养MDSCs并鉴定.实验分成对照组(MDSCs+TGF-β1培养),实验组(MDSCs+ TGF-β1+pGenesil-3-shRNA培养).观察shRNA质粒转染结果.利用Real-Time PCR及Western Blot检测CTGF mRNA和CTGF蛋白表达.结果 正确构建了靶向CTG,F基因的质粒载体pCenesil-3-shCTGF;大鼠MDSCs 48 h、72h和96h时实验组的CTGF mRNA及蛋白质水平均低于对照组(P＜0.05).结论 针对CTGF构建的pGenesil-3-shCTGF能够转染MDSCs,并在48h、72h和96h时能明显降低TGF-β1刺激MDSCs所产生CTGF的表达.     

NADPH氧化酶在转化生长因子β1诱导大鼠肾小管上皮细胞转分化中的作用

目的探讨NADPH氧化酶在转化生长因子β1（TGF-β1）诱导大鼠肾小管上皮细胞（NRK-52E）转分化中的作用。方法用TGF-β1（10μg/L）刺激NRK-52E细胞不同时间,观察α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、E-钙黏蛋白（E-cadherin）、纤溶酶原激活物抑制剂1（PAI- 1）及Ⅰ型胶原（Col-Ⅰ）的表达。部分实验中细胞在TGF-β1刺激前用NADPH氧化酶抑制剂DPI预处理1 h。用激光共聚焦显微镜观察细胞内活性氧（ROS）的产生。用RT-PCR方法检测NADPH氧化酶p22phox、gp91phox、p47phox和p67phox亚单位mRNA的表达。α-SMA、E-cadherin、PAI-1及Col-ⅠmRNA及蛋白的表达分别采用RT-PCR、Western印迹和细胞免疫化学检测。结果TGF-β1可显著上调NADPH氧化酶p67phox亚单位mRNA的表达,8 h及24 h时分别为对照组的2.43倍及3.59倍（P〈0.01）。TGF-β1可显著促进细胞ROS的产生,5 min时已是对照组的2.5倍（P〈0.05）。DPI预处理同时可显著逆转TGF-β1诱导NRK-52E细胞ROS的产生（P〈0.05）、α-SMA的表达上调、E-cadherin的表达下调以及PAI-1和Col-Ⅰ的表达上调。结论TGF-β1可促进NRK-52E细胞增加ROS的产生。ROS介导了TGF-β1诱导NRK-52E细胞的转分化,促进肾脏纤维化。     

RhoA-Rock信号通路在转化生长因子β1诱导大鼠腹膜间皮细胞转分化中的作用

目的　探讨RhoA-Rock信号通路在转化生长因子β1（TGF-β1）诱导大鼠腹膜间皮细胞（RPMC）转分化中的作用。 方法　体外培养SD大鼠原代腹膜间皮细胞,静止24 h后,采用随机数字表法随机分为以下4组：正常对照组、TGF-β1（10 μg/L）刺激组、TGF-β1（10 μg/L）＋Y-27632（Rock特异性抑制剂,10 μmol/L）组（Y-27632预处理2 h）、Y-27632（10 μmol/L）组。用TGF-β1（10 μg/L）刺激RPMC不同时间,观察α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）,E钙黏素（E-cadherin）、Ⅰ型胶原（ColⅠ）的表达。RT-PCR法检测E-cadherin、α-SMA 和ColⅠmRNA表达。Western印迹法检测RhoA（包括总RhoA及活化的RhoA）、E-cadherin、α-SMA、ColⅠ和波形蛋白（vimentin）表达。活化的RhoA由膜蛋白提取试剂盒提取。 结果 （1）TGF-β1（10 μg/L）刺激RPMC能诱导RhoA活化,于10 min开始出现活性升高,为对照组的（2.57±0.52）倍（P < 0.05）;1 h达高峰,为对照组的（4.35±0.41）倍（P < 0.05）。（2）TGF-β1（10 μg/L）刺激RPMC能导致E-cadherin mRNA和蛋白表达下调,α-SMA、ColⅠmRNA和蛋白表达上调,呈时间依赖性。（3）Rock特异性抑制剂Y-27632能显著下调α-SMA、ColⅠmRNA的表达,较TGF-β1刺激组各降低了53.8%和55.7%（均P < 0.05）,并且能下调α-SMA、ColⅠ和vimentin蛋白的表达,较TGF-β1刺激组分别降低了42.6%、60.1%和58.1%（均P < 0.05）,但不能上调E-cadherin mRNA和蛋白的表达。 结论　TGF-β1可通过RhoA-Rock信号通路介导大鼠腹膜间皮细胞转分化,抑制该通路可作为防治腹膜纤维化的潜在靶点。     

Wnt/β连环蛋白信号在人真皮成纤维细胞表型转化中的作用及机制

目的 了解Wnt/β连环蛋白信号在人正常真皮Fb向肌成纤维细胞(MFb)表型转化中的作用及机制.方法 采用酶消化法分离培养人正常皮肤真皮Fb.(1)实验1.按随机数字表法将细胞分为4组:对照组,采用无血清DMEM培养液(以下简称培养液)培养;TGF-β1组,用含10 ng/mL重组人TGF-β1(浓度下同)的培养液培养;Wnt3a组,用含150 ng/mL重组人Wnt3a(浓度下同)的培养液培养;TGF-β1+Wnt3a组,用含重组人TGF-β1和重组人Wnt3a的培养液培养.48 h后,分别采用实时荧光定量PCR法和蛋白质印迹法,检测Fb β连环蛋白和α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的mRNA及蛋白表达水平.(2)实验2.按照随机数字表法将细胞分为4组:对照组、TGF-β1组,处理方法均同实验1;SB415286(糖原合酶激酶3β阻断剂)组,用含10 μmol/L SB415286(浓度下同)的培养液培养;TGF-β1+ SB415286组,用含重组人TGF-β1和SB415286的培养液培养.48 h后,分别采用实时荧光定量PCR法和蛋白质印迹法检测Fb α-SMA的mRNA和蛋白表达水平;用免疫荧光细胞化学法检测α-SMA阳性表达情况.各项检测重复3次,对数据进行方差分析及LSD-t检验.结果 (1)实验1.①β连环蛋白的mRNA表达水平:对照组、TGF-β1组、Wnt3a组和TGF-β1+Wnt3a组Fb组间比较,差异无统计学意义(F=0.302,P=0.823).②β连环蛋白的蛋白表达水平:4组比较,差异有统计学意义(F=16.713,P=0.001).与对照组表达水平(0.34±0.11)相比,TGF-β1组、Wnt3a组均显著上调(0.73±0.12、0.82±0.17,t值分别为3.028、3.727,P＜0.05或P＜0.01).TGF-β1+Wnt3a组(1.23±0.21)显著高于其余3组(t值分别为6.911、3.883、3.184,P值均小于0.01).③α-SMA mRNA表达水平:4组比较,差异有统计学意义(F=31.830,P=0.001);与对照组相比,TGF-β1组显著上调,Wnt3a组下调(t值分别为6.759、2.535,P＜0.05或P＜0.01);TGF-β1+Wnt3a组低于TGF-β1组(t=4.532,P＜0.01).④α-SMA蛋白表达水平:对照组、TGF-β1组、Wnt3a组、TGF-β1+ Wnt3a组分别为0.83±0.17、1.43±0.20、0.53±0.12、0.89±0.14(F=16.597,P=0.001).与对照组相比,TGF-β1组显著上调,Wnt3a组下调(t值分别为4.582、2.291,P＜0.05或P ＜0.01);TGF-β1 +Wnt3a组低于TGF-β1组(t =4.123,P＜0.01).(2)实验2.①α-SMA mRNA表达水平:4组比较,差异有统计学意义(F=34.101,P=0.001).SB415286组明显低于对照组(t =2.511,P＜0.05),TGF-β1+SB415286组明显低于TGF-β1组(t=3.587,P＜0.01).②α-SMA蛋白表达水平:4组细胞比较,差异有统计学意义(F =11.381,P=0.003).SB415286组显著低于对照组(t=2.364,P＜0.05),TGF-β1+ SB415286组低于TGF-β1组(t=2.556,P＜0.05).③免疫荧光细胞化学法检测显示,对照组Fb α-SMA表达微弱;TGF-β1组α-SMA表达较对照组显著增强(t =11.198,P＜0.01);SB415286组表达较对照组减少,TGF-β1+ SB415286组表达较TGF-β1组显著减少(t=5.902,P＜0.01).结论 Wnt/β连环蛋白信号可能参与Fb细胞表型转化,并且对TGF-β1所介导的促转化效应起负性调控作用.     

姜黄素对TGF-β1诱导人肾小管上皮细胞转分化及分泌细胞外基质成分的影响

目的：通过研究姜黄素（curcumin,Cur）对转化生长因子-β1（TGF-β1）诱导人肾小管上皮细胞（HK-2）转分化及分泌细胞外基质（ECM）成分的影响,探讨姜黄素在防治肾小管-间质纤维化方面可能的作用机制。方法：应用不同浓度Cur处理经TGF-β1诱导活化的HK-2细胞,通过显微镜观察细胞形态改变,免疫组化技术检测α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）和E-钙黏蛋白（E-cadherin）的表达;应用酶联免疫吸附法（ELISA）检测细胞培养上清Ⅰ型胶原（ColⅠ）、Ⅲ型胶原（ColⅢ）和纤连蛋白（FN）的分泌。结果：（1）正常HK-2细胞表达E-cadherin,不表达α-SMA,经TGF-β1刺激后细胞表型发生转变,E-cadherin的表达明显减弱,α-SMA表达明显增强;（2）不同浓度Cur组与单纯TGF-β1刺激组相比α-SMA的表达有所减弱,而E-cadherin的表达增强;（3）不同浓度Cur抑制了ColⅠ、ColⅢ和FN的分泌,与单纯TGF-β1刺激组相比有统计学差异（P〈0.05）。结论：姜黄素能抑制TGF-β1诱导人肾小管上皮细胞转分化及细胞外基质成分ColⅠ、ColⅢ和FN的合成,在一定程度上具有防治肾小管-间质纤维化的作用。     

骨成形蛋白7对人肾小管上皮细胞增殖和转分化的影响

目的观察骨成形蛋白7(BMP-7)对TGF-β1诱导的人肾小管上皮细胞转分化的影响,以探讨其延缓小管间质纤维化病变的作用及其可能机制。方法将体外培养的人肾小管上皮细胞分为空白对照组、TGF-β1组、TGF-β1 50ng/mlBMP-7组、TGF-β1 100ng/mlBMP-7组。应用MTT比色法测定BMP-7对人肾小管上皮细胞增殖的作用;间接免疫荧光法测定人肾小管上皮细胞α-SMA、角蛋白、波形蛋白的表达;流式细胞仪检测表达α-SMA阳性的HK-2细胞百分率;RT-PCR检测细胞中α-SMAmRNA的表达。结果与空白对照组相比,不同浓度的BMP-7处理HK-2细胞24、48h后,HK-2细胞均明显增殖(P<0.05)。免疫荧光检测结果显示,经TGF-β1刺激后,角蛋白表达减弱,α-SMA和波形蛋白表达增强;加入50ng/mlBMP-7处理24、48h后,细胞中α-SMA和波形蛋白表达减弱。流式细胞仪检测发现,加入50ng/mlBMP-7处理24、48h后,表达α-SMA的HK-2细胞阳性率逐渐下降,与TGF-β1处理组相比差异有显著性意义(P<0.05)。RT-PCR结果显示,空白对照组无α-SMAmRNA表达,5ng/mlTGF-β1组与空白对照组相比,α-SMAmRNA表达明显上调(P<0.05),而TGF-β1 50ng/mlBMP-7组、TGF-β1 100ng/mlBMP-7组与TGF-β1组相比,α-SMAmRNA表达有下降趋势,但无显著性差异(P>0.05)。结论TGF-β1促进肾小管上皮细     

周围神经慢性卡压损伤过程中转化生长因子β1和Ⅰ、Ⅲ型胶原的含量及相关性分析

目的 探讨转化生长因子β1(TGF-β1)和Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白(COL-Ⅰ、COL-Ⅲ)在周围神经慢性卡压中的作用及二者的相关性.方法 将50只成年雄性SD大鼠随机分成2组:对照组,仅分离暴露坐骨神经;卡压组,对大鼠右侧后腿坐骨神经行硅胶管卡压术.于卡压术后2、4、6、8、10周随机取2组大鼠各5只,切取卡压段神经行组织形态学、免疫组织化学观察及RT-PCR、Western Blot定量测定TGF-β1及COL-Ⅰ、COL-Ⅲ含量.结果 坐骨神经慢性卡压损伤后,神经内胶原纤维增生;卡压组大鼠坐骨神经TGF-β1及COL-Ⅰ、COL-Ⅲ含量明显高于对照组,两者差异有统计学意义(P＜0.05);TGF-β1与COL-Ⅰ、COL-Ⅲ含量在一定时期内呈正相关.结论 慢性卡压损伤可致周围神经发生纤维化病变,COL-Ⅰ、COL-Ⅲ含量显著增加,TGF-β1参与了这一病理生理改变过程,提示TGF-β1在周围神经纤维化过程中具有一定的作用.     

结缔组织生长因子介导转化生长因子β1促进瘢痕成纤维细胞转分化的研究

目的 了解结缔组织生长因子(CTGF)介导TGF-β1发挥促人增生性瘢痕Fb(HSFb)转分化的作用.方法 体外培养人HSFb,取5份细胞标本分别加入不同浓度TGF-β1(0、2.5、5.0、7.5、10.0 ng/mL),作用48 h后待测.余下标本分为:空白对照组;CTGF刺激组,培养液中加入终浓度10.0 ng/mL重组人CTGF;TGF-β1刺激组,培养液中加入终浓度10.0 ng/mL重组人TGF-β1;CTGF反义寡脱氧核苷酸(ASODN)转染组,细胞转染CTGF ASODN后,加入培养液;CTGF ASODN转染+TGF-β1刺激组,细胞转染CTGF ASODN后2 h,加人含终浓度10.0 ng/mL重组人TGF-β1的培养液.蛋白质印迹法分析不同浓度TGF-β1刺激对细胞CTGF表达的影响,比较各组α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达变化;流式细胞仪检测α-SMA阳性细胞百分率.结果 TGF-β1浓度为10.0 ng/mL时,CTGF的表达明显高于未受刺激的细胞(P<0.05).CTGF刺激组与TGF-β1刺激组α-SMA表达明显高于空白对照组(P<0.01).CTGF ASODN转染组以及CTGF ASODN转染+TGF-β1刺激组α-SMA表达与空白对照组接近(P>0.05).上述各组细胞α-SMA阳性细胞百分率依次为(10.8±2.8)%、(29.1±4.0)%、(28.7±4.8)%、(10.7±2.3)%、(14.3±2.9)%,统计学分析结果类似于α-SMA表达.结论 CTGF是TGF-β1发挥促人HSFb转分化的重要下游效应分子之一.     

高糖通过转化生长因子β信号诱导肾小球内皮细胞向肌成纤维细胞转分化

目的 探讨高糖(HG)能否通过转化生长因子β(TGF-β)途径诱导大鼠肾小球内皮细胞向肌成纤维细胞转分化(EndMT).方法 体外培养大鼠肾小球内皮细胞(GEnC),分为正常对照组(NG,5.5 mmol/L)、高糖组(HG,15、30 mmol/L)、TGF-β抑制剂组(HG+LY36,30 mmol/L葡萄糖+10 μmol/L LY364947)以及高渗对照组(M,5.5 mmol/L葡萄糖+25.5 mmol/L甘露醇)和溶剂对照组(D,5.5 mmol/L葡萄糖+1 ml/LDMSO).采用Western印迹法检测各组细胞内皮细胞标志物claudin5和肌成纤维细胞标志物α-SMA表达变化;实时定量PCR法检测细胞TGF-β1和TGF-β2 mRNA表达改变;免疫荧光法观察细胞形态学变化以及血管内皮细胞标志物VE-cadherin和肌成纤维细胞标志物α-SMA的表达.结果 与NG组比较,HG组claudin5蛋白的表达量随葡萄糖浓度增加而降低(P＜0.05),α-SMA蛋白表达量随葡萄糖浓度增加而升高(P＜0.05),TGF-β1和TGF-β2 mRNA表达均升高(P＜0.05).与HG组比较,TGF-β抑制剂组claudin5蛋白表达量升高(P＜0.05),α-SMA蛋白表达降低(P＜0.05).高渗对照组和溶剂对照组改变差异无统计学意义.激光共聚焦免疫荧光结果显示,高糖处理可引起细胞形态由卵圆形向梭形改变,VE-cadherin表达减少,α-SMA表达增加;TGF-β抑制剂组细胞形态无明显改变.与HG组比较,TGF-β抑制剂组VE-cadherin表达增加,α-SMA表达降低(P＜0.05).结论 高糖诱导大鼠肾小球内皮细胞TGF-β表达增加及内皮细胞-肌成纤维细胞转分化.抑制TGF-β可抑制高糖引起的转分化,提示TGF-β参与了高糖引起的肾小球内皮细胞转分化过程.     

HGF拮抗TGF-β1诱导腱鞘成纤维细胞α-SMA及细胞外基质合成

目的 研究HGF能否阻抑TGF-β1诱导的腱鞘成纤维细胞α-SMA及细胞外基质过度合成.方法 选取成年新西兰大白兔7只,体重3.75～4.00 kg,无菌切取前肢中趾趾深屈肌腱,进行腱鞘成纤维细胞的分离和培养,待细胞生长成单层后,以胰蛋白酶消化传代.取第3代成纤维细胞用于实验,当细胞达到70%融合时,培养液中加入TGF-β1(5 ng/ml)及HGF(10～40 ng/ml).培养72 h后,利用Westernblot检测α-SMA表达;ELISA测定细胞Ⅰ型胶原及纤维结合素的表达.结果 TGF-β1能显著诱导α-SMA表达,半定量分析提示,TGF-β1作用后的成纤维细胞α-SMA表达量是对照组的1.8倍.随HGF的同时加入,α-SMA的表达则明显受抑制(P＜0.05),且随HGF浓度的升高其阻抑作用呈逐渐增强趋势.TGF-β1同样能诱导Ⅰ型胶原及纤维结合素的表达(P＜0.01),而HGF则可以有效地阻抑其表达,其效应呈剂量依赖性(P＜0.05).结论 HGF可以有效阻抑TGF-β1诱导的腱鞘成纤维细胞α-SMA、Ⅰ型胶原及纤维结合素的表达,这为利用HGF预防和治疗屈指肌腱损伤后粘连及瘢痕在细胞和分子水平提供了依据.     

大鼠阴茎海绵体肌源性干细胞的分离与表型鉴定

目的 探讨阴茎海绵体中肌源性干细胞(MDSCs)的分离与表型鉴定的方法.方法 取2个月龄SD大鼠阴茎海绵体组织,用0.5％Ⅰ型胶原酶、0.1％胰蛋白酶进行酶消化初步分离.应用改良的Preplate差速贴壁法进一步行细胞纯化,细胞培养1h,贴壁细胞为PP1;未贴壁细胞转瓶培养2h,贴壁细胞为PP2;未贴壁细胞再次转瓶培养18h,贴壁细胞为PP3;此后,每次间隔24h转瓶培养依次获得的贴壁细胞为PP4、PP5、PP6,观察细胞形态变化.流式细胞仪检测PP3、PP6细胞中干细胞抗原l (Sca-l)和结蛋白(Desmin)的阳性表达量;Western blot检测PP1 ～ PP6细胞中Sca-1和Desmin的阳性表达;免疫荧光细胞化学法检测Sca-1、Desmin、Sca-1/Desmin在PP6细胞中的表达.结果 PP1～ PP6细胞贴壁能力逐渐减慢,PP6细胞贴壁最慢,2～3d后才开始贴壁成圆形或短梭形.流式细胞仪检测结果显示,PP3细胞中Sca-1阳性表达量为(0.3±0.2)％,与同型对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05),Desmin阳性表达量为(15.3±1.5)％,与同型对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05);PP6细胞中Sca-1、Desmin阳性表达量分别为(5.7±0.7)％、(41.1±1.6)％,与PP3比较差异均有统计学意义(P＜0.05).Western blot显示PP1 ～ PP5细胞中未检测到Sca-1蛋白明显表达,但在PP6细胞中则检测到Sca-1蛋白的表达,Desmin蛋白在PP1 ～ PP6细胞中表达逐渐增强.免疫荧光细胞化学显示在PP6细胞中有少量细胞表达Sca-1、散在分布、以胞质表达为主;表达Desmin细胞聚集、数量较多、主要表达于胞质;亦发现有极少量双阳性标记细胞(Sca-1/Desmin),共同表达于同一细胞的胞质.结论 在大鼠阴茎海绵体中分离出既有于细胞表型又有肌源性表型的细胞,提示此类细胞为MDSCs.     

己酮可可碱对肾小管上皮细胞转分化抑制作用的实验研究

目的:探讨己酮可可碱(PTX)对单侧输尿管梗阻(UUO)模型大鼠肾间质平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达的影响,并在体外研究其对肾小管上皮细胞转分化及其对Smad 7表达的作用.方法:将实验大鼠分为假手术组、UUO对照组和UUO PTX治疗组.用免疫组化法测定各组动物肾组织α-SMA表达.体外培养的人肾小管上皮细胞(HK-2),经TGF-β1及PTX干预后,用蛋白印迹检测α-SMA和Smad 7表达,用ELISA检测培养上清中Ⅰ型胶原含量.结果:假手术组大鼠肾组织仅血管壁α-SMA免疫染色阳性.UUO对照组第3 d、第7 d、第14 d,α-SMA表达程度分别为(2.90±0.71)%、(8.50±0.97)%、(17.9±2.70)%,PTX治疗组则分别为(2.70±0.62)%、(6.90±0.83)%、(13.8±1.9)%,术后第7 d(P<0.05)、第14 d(P<0.01)两组有统计学差异.TGF-β1(8 ng/ml)刺激HK-2细胞72 h后,α-SMA表达强度为(87.7±7.0)%,培养上清中Ⅰ型胶原浓度为(2 560.49±95.03) ng/ml;而加入PTX 10、50、100、300、500 μg/ml干预72 h后,α-SMA表达强度(F＝174.998,P<0.001)和培养上清中的Ⅰ型胶原(F＝460.883,P<0.001)呈浓度依赖性减少.在TGF-β1刺激前24 h、TGF-β1刺激后0 h、12 h、24 h、36 h或48 h后分别加入PTX(500 μg/ml),α-SMA表达强度(F＝144.131,P<0.001)和培养上清中的Ⅰ型胶原(F＝444.557,P<0.001)则呈时间依赖性减少.TGF-β1刺激的同时,分别加入PTX 10、50、100、300、500 μg/ml干预72 h后,Smad 7表达强度分别为(50.6±3.1)%、(49.4±2.9)%、(48.9±2.5)%、(51.4±1.8)%、(49.5±3.0)%,与阳性对照组(46.9±3.5)%比较无统计学差异(P＞0.05).结论:(1)PTX可减少UUO大鼠肾间质α-SMA表达;(2)在体外,PTX可抑制TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞转分化,该作用与Smad 7表达无关,其机制有待于进一步研究.     

JNK对转化生长因子β1所致大鼠腹膜间皮细胞转分化的调控作用

目的 探讨c-Jun 氨基末端激酶(JNK)在转化生长因子β1(TGF-β1)诱导大鼠腹膜间皮细胞（RPMC）转分化中的调控作用。 方法 采用腹腔注射胰蛋白酶法分离培养RPMC，取第2代腹腔间皮细胞用于实验研究。观察TGF-β1对α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、Ⅰ型胶原(ColⅠ)、E钙黏蛋白(E-cadherin)以及磷酸化(p)JNK表达的影响；应用JNK特异性抑制剂SP600125预处理细胞后，观察其对TGF-β1所致上述作用的影响。RT-PCR法检测α-SMA、ColⅠ及E-cadherin mRNA表达；Western印迹法检测α-SMA、ColⅠ、E-cadherin及p-JNK蛋白表达；间接免疫荧光检测α-SMA在细胞内的表达和分布。 结果 TGF-β1刺激RPMC能导致α-SMA、ColⅠ蛋白表达上调，E-cadherin蛋白表达下调，呈时间依赖性。TGF-β1刺激RPMC 5 min出现p-JNK表达上调，10 min达高峰(P < 0.01)。SP600125能够抑制JNK的磷酸化(P < 0.05)，也能抑制TGF-β1诱导的α-SMA、ColⅠmRNA和蛋白的高表达以及E-cadherin表达的下调 (均P < 0.05)。间接免疫荧光结果显示，TGF-β1刺激RPMC 48 h，胞内α-SMA表达明显增多，SP600125能有效抑制其高表达。 结论 JNK在TGF-β1诱导大鼠腹膜间皮细胞转分化中具有重要的调控作用，JNK特异性抑制剂的应用可能为临床防治腹膜纤维化提供新的途径。     

TGF-β1诱导胃癌细胞上皮间质转化及促进干细胞特性获得的研究

目的 观察TGF-β1能否诱导胃癌KATO-Ⅲ细胞上皮间质转化及促进胃癌细胞干细胞特性的获得.方法 5 ng/mL TGF-β1处理胃癌KATO-Ⅲ细胞72 h后,置于倒置显微镜下观察其形态学变化,CCK-8法检测TGF-β1对KATO-Ⅲ细胞增生的影响,RT-PCR与Western blotting法检测上皮间质转化相关因子Snail、E-cadherin、N-cadherin,胚胎干细胞相关因子Sox2、OCT4、Nanog、EGFR及肿瘤起始细胞相关标志物CD44、CD133表达的变化.单克隆形成实验研究TGF-β1对KATO-Ⅲ细胞克隆形成能力的影响.结果 TGF-β1处理KATO-Ⅲ细胞后,细胞形态由上皮细胞形态向间质细胞样形态转变;TGF-β1处理组KATO-Ⅲ细胞Snail、N-cadherin mRNA表达相对灰度值为(0.5219±0.0147)、(0.6640±0.0124),显著高于对照组(0.2049±0.0214,P=0.004;0.2722±0.0098,P=0.001),TGF-β1处理组Snail、N-cadherin蛋白表达相对灰度值为(0.4769±0.0234)、(0.5014±0.0216),显著高于对照组(0.2534±0.0345,P=0.02;0.2026±0.0268,P=0.009),TGF-β1处理组中E-cadherin mRNA及蛋白表达相对灰度值分别为(0.4701±0.0215)、(0.1349±0.0258),显著低于对照组(0.6792±0.0157,P=0.01;0.6055±0.0227,P=0.004);TGF-β1处理后KATO-Ⅲ细胞增生能力明显降低(P＜0.05).与对照组相比(0.143±0.013、0.156±0.025、0.325±0.046),胚胎干细胞相关因子Sox2、OCT4、Nanog mRNA表达相对灰度值显著增加(0.594±0.039,P=0.001; 0.438±0.033,P=0.001;0.489±0.037,P=0.03),TGF-β1处理组CD44与CD133 mRNA表达相对灰度值分别为(0.437±0.037)与(0.543±0.028),显著高于对照组(0.247±0.024,P=0.000;0.139±0.016,P=0.000);TGF-β1处理组CD44与CD133蛋白表达相对灰度值分别为(0.429±0.034)与(0.316±0.027),显著高于对照组(0.152±0.014,P =0.000;0.110±0.010,P=0.000).TGF-β1处理后,KATO-Ⅲ细胞克隆形成数目及直径均显著高于对照组(P＜0.01).结论 TGF-β1能诱导胃癌KATO-Ⅲ细胞发生上皮间质转化转变,同时促进其干细胞特性获得.     

褪黑素对增生性瘢痕成纤维细胞生物学活性的调控

目的 探讨褪黑素对增生性瘢痕成纤维细胞生物学活性的调控.方法 分离培养增生性瘢痕成纤维细胞,采用四氮唑复合物/硫酸酚嗪甲酯(XTT/PMS)法检测细胞增殖活性,酶联免疫吸附实验(ELISA)检测细胞培养上清液中β1转化生长因子(TGF-β1)含量和荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测细胞α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、胶原Ⅰ和胶原ⅢmRNA表达,评价褪黑素和褪黑素受体拮抗剂(luzindole)对增生性瘢痕成纤维细胞生物学活性的影响.结果 褪黑素抑制增生性瘢痕成纤维细胞的增殖,抑制效果呈浓度依赖性(P＜0.05);高浓度褪黑素(10-3 mmol/L)可降低增生性瘢痕成纤维细胞产生TGF-β1 (P＜0.05)和α-SMA mRNA、胶原Ⅰ mRNA的表达(P＜0.05);褪黑素受体拮抗剂能阻断褪黑素对细胞产生TGF-β1和α-SMA、胶原Ⅰ mRNA表达的抑制作用(P＜0.05);但褪黑素对该细胞胶原ⅢmRNA表达无影响(P＞0.05).结论 褪黑素可通过与受体结合调控增生性瘢痕成纤维细胞的生物学活性.     

黄芪通过c-met调控TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞转分化

AB 目的：探讨黄芪对TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞转分化及细胞外基质分泌的作用及机制。方法：体外培养正常大鼠肾小管上皮细胞（NRK52E）,应用倒置相差显微镜观察NRK52E细胞形态学变化;免疫组织化学染色法及实时荧光定量PCR法检测α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）,肝细胞生长因子HGF受体（c-met）的表达;ELISA法定量检测细胞上清液中胶原Ⅰ（Col-Ⅰ）,胶原Ⅲ（Col-Ⅲ）和纤维黏连蛋白（FN）的水平。结果：TGF-β1可诱导肾小管上皮细胞肌成纤维细胞转分化（TEMT）,TGF-β1诱导组细胞肥大、拉长,呈长梭形,α-SMA表达明显增强,Col-Ⅰ、Col-Ⅲ和FN分泌增加（P〈0.05）。加入不同浓度黄芪后,细胞形态接近正常肾小管上皮细胞形态,α-SMA表达、Col-Ⅰ、Col-Ⅲ和FN分泌均较TGF-β1诱导组明显抑制（P〈0.05）,c-met表达较TGF-β1诱导组增加（P〈0.05）且呈剂量依赖性。结论：TGF-β1可以诱导肾小管上皮细胞肌成纤维细胞转分化,增加细胞外基质成分Col-Ⅰ、Col-Ⅲ和FN的分泌;黄芪能够抑制TGF-β1诱导的NRK52E细胞转分化以及细胞外基质的分泌;黄芪抑制细胞转分化的机制可能与其增强c-met的表达有关。