人白细胞介素—6基因的克隆表达和纯化的研究

目的：研究人ＩＬ－６基因在大肠杆菌中的高效表达及表达产物的纯化。方法：采用ＲＴ－ＰＣＲ方法克隆了人ＩＬ－６ ｃＤＮＡ,用ｐＢＶ２２０载体对ＩＬ－６基因进行了表达调控研究,用阴离子交换柱和凝胶柱对表达产物进行纯化,用ＭＴＴ法测定ｒｈＩＬ－６的活性。结果：表达调控研究发现,当ＳＤ序列到ＡＴＧ之间的距离为６ｂｐ和１０ｂｐ时在ＳＤＳ－ＰＡＧＥ胶上未见明显表达,而当距离为５ｂｐ、７ｂｐ、８ｂｐ、８ｂｐ时均有     

大肠杆菌表达重组人IL—8分离纯化工艺的建立

目的 建立重组人ＩＬ－８（ｒｈＩＬ－８）大肠杆菌表达后的高效分离纯化工艺,以便获得遍纯度的重组蛋白。方法 将已构建好的表达载体转化大肠杆菌ＨＢ１０１,经ＩＰＴＧ诱导进行高效表达。交墩心收集到的菌体用超离,再经离子交换柱和凝胶层析柱过滤,得到最终纯品。蛋白纯度用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ鉴定,ＥＬＩＳ理组ＩＬ－８含量。检测纯化后重组蛋白的生物活性和热源质。结果 用大肠杆菌ＨＢ１０－１表达重组人ＩＬ－８,具有罚     

GST－IL－1融合基因表达的研究

为研究基因表达的影响因素，将人白细胞介素－１（ＩＬ－１）ｃＤＮＡ的不同片段分别重组入融合蛋白表达载体ｐＧＥＸ－４Ｔ中ＧＳＴ基因３￣’端，形成ＧＳＴ－ＩＬ－１融合基因，经ＩＰＴＧ诱导后，用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ检测表达情况，结果发现ＧＳＴ与全长８１６ｂｐ完整的ＩＬ－１ｃＤＮＡ的融合基因未见有相应蛋白质的表达，且亦未见ＧＳＴ的表达，而ＧＳＴ与５￣’端缺失１８９ｂｐ的ＩＬ－１ｃＤＮＡ的融合基因则看到有相应蛋白质的表达，表达量占细菌蛋白总量的３０％．表明ＩＬ－１ｃＤＮＡ５￣’端１～１８９ｂｐ的序列影响了整个融合基因的表达，即目的基因中远离翻译起始码ＡＵＧ的下游序列也可显著影响该基因的表达．此结果为基因工程中克隆基因表达调控的研究提供了有益的资料     

在大肠杆菌中融合高效表达人MCP-1

目的：利用含强启动子的融合表达载体ｐＧＥＸ－２Ｔ对编码人单核细胞趋化蛋白－１（ＭＣＰ－１）的基因进行高效表达。方法：基因重组技术及蛋白纯化技术。结果：ＳＤＳ－ＰＡＧＥ显示表达产物占菌体蛋白的５０％ 。Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ检测表明,表达产物可与抗ＭＣＰ－１ 抗体特异反应。生物学活性测定结果表明,表达产物具有明显的单核细胞趋化活性。结论：融合蛋白对ＭＣＰ－１ 趋化活性无影响     

pBV-IL-6重组质粒构建及其在E.coli中的高效表达

目的构建人ＩＬ－６重组质粒（ｒｈＩＬ－６），并使其在Ｅ．ｃｏｌｉ中高效表达。②方法经计算机分析设计，人工合成３条寡核苷酸引物，通过定点诱变并优化起始区，应用ＰＣＲ扩增及重组ＤＮＡ技术，构建重组质粒ｐＢＶ－ＩＬ－６，并转化至Ｅ．ｃｏｌｉ宿主菌ＤＨ５α中诱导表达，对产物进行纯化和复性，ＭＴＴ法检测生物活性。③结果获得２种ｒｈＩＬ－６高效表达的Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５α／ｐＢＶ－ＩＬ－６工程菌，一种表达２０．８ｋｕＩＬ－６全蛋白；另一种表达１６．８ｋｕ，Ｎ端缺失２５个氨基酸ＩＬ－６蛋白。薄层密度扫描分析表达产率，前者为２８．３％，后者为３３．４％，且均具有生物学活性。④结论ｒｈＩＬ－６构建成功，并获高效表达     

在大肠杆菌中融合高效表达人MCP—1

目的：利用含强启动子的融合表达载体ｐＧＥＸ－２Ｔ对编码人单核细胞趋化蛋白－１（ＭＣＰ－１）的基因进行高效表达。方法：基因重组技术及蛋白纯化技术。结果：ＳＤＳ－ＰＡＧＥ显示表达产物占菌体蛋白的５０％。Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ检测表明,表达产物可与抗ＭＣＰ－１抗体特异反应。     

重组人白细胞介素6对人肺癌细胞系生长的调控及机制研究

探讨重组人白细胞介素６（ＩＬ－６）对人肺癌生长调控作用及机制。方法以人肺巨细胞癌系ＰＧ和人肺腺癌细胞系ＰＡａ为研究对象，研究ｒｈＩＬ－６对ＰＧ、ＰＡａ细胞体外生长的作用；并应用Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交检测ｒｈＩＬ－６对ＩＬ－６、ＩＬ－６受体（ＩＬ－６Ｒ）、ｃ－ｍｙｃ、ｃ－ｆｏｓ、ｃ－ｊｕｎ等基因表达的影响。结果发现ｒｈＩＬ－６促进ＰＧ、ＰＡａ细胞生长，呈浓度依赖性和时间依赖性。逆转录聚合酶链反应检测证实，ＰＧ、ＰＡａ细胞均表达ＩＬ－６及ＩＬ－６ＲｍＲＮＡ。ｒｈＩＬ－６上调ＩＬ－６、ＩＬ－６Ｒ及ｃ－ｍｙｃ等基因表达，而对ｃ－ｆｏｓ、ｃ－ｊｕｎ基因表达无明显影响。结论ｒｈＩＬ－６促进ＰＧ、ＰＡａ细胞生长；ｒｈＩＬ－６上调ＩＬ－６、ＩＬ－６Ｒ及ｃ－ｍｙｃ等基因表达作用可能与其促进ＰＧ、ＰＡａ细胞生长有关     

血小板生成素突变体融合蛋白表达及纯化研究

目的：用大肠杆菌融合蛋白表达载体ｐＭＡＬ－ｃ２构建人血小板生成素突变体融合蛋白表达质粒ｐＭＡＬ－ＴＯＰＭ，方法：采用基因重组和表达，ＳＤＳ－聚丙烯酰胺胶电泳和蛋白纯化技术。结果：ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析表明，ＩＰＴＧ诱导５ｈ后大肠杆菌ＪＭ１０９表达到最高水平，约占大肠杆菌菌体总体蛋白的３６．６％，除了大肠杆菌ＲＲ１不表达以外，大肠杆菌ＤＨ５αＨ１０１均有较高水平的表达，表达产物血小板生成素突变体融合蛋     

人促红细胞生成素在大肠杆菌中融合高表达：稀有密码子对外源蛋白翻译速率的影响

本实验分别用两种融合表达载体（ｐＧＥＸ－２Ｔ及ｐＤＳ－６Ｈ）在大肠杆菌ＸＬ１－Ｂｌｕｅ中表达人促红细胞生成素（ｈ－ＥＰＯ）。结果发现，虽然ｈ－ＥＰＯ基因中大肠杆菌使用频率为０％或１％的密码子占密码子总量的１４．３％，但实验中却取得了较高的蛋白表达量。ｐＧＥＸ－２Ｔ和ｐＤＳ－６Ｈ中表达的融合蛋白（分子量：４４４００和２３８００）分别占细菌总蛋白的２９．７％和１７．５％。从而提示，一个基因中的密码子使用频率与翻译延长速率之间可能不是一种简单的对应关系。表达载体ｐＧＥＸ－２Ｔ中５＇融合基因长度达１３００ｂｐ，而ｐＤＳ－６Ｈ中仅为３６ｂｐ，而ｐＤＳ－６Ｈ但两者表达水平却无显著差异，因此作为翻译起始限制因素的翻译起始区的ＡＴＧ下游顺序仅需长约３６个核苷酸。     

重组人IL-6在沙门菌x4550中的表达

为在鼠伤寒沙门菌ｘ４５５０中表达重组人白细胞介素６（ＩＬ６），利用定点突变、聚合酶链反应、体外重组ＤＮＡ技术构建出重组表达载体ｐＹＡ３３３３ＩＬ６；利用ＩＬ６依赖性的小鼠杂交瘤细胞株Ｂ９测定重组人ＩＬ６ＨＧＦ的活性。结果：从全菌ＳＤＳＰＡＧＥ考马斯亮蓝染色后薄层扫描分析表达产物产率为１７６％，相对分子质量为２１×１０４；测定重组人ＩＬ６ＨＧＦ活性为２×１０６Ｕ／Ｌ。提示：鼠伤寒沙门菌ｘ４５５０能够表达人ＩＬ６。     

汉族人胶质细胞源性神经营养因子前体cDNA的核苷酸序列分析及其功能研究

目的：对汉族人胶质细胞源性神经营养因子（ＧＤＮＦ）前体ｃＤＮＡ进行核苷酸旬分析及功能研究。方法：通过ＲＴ－ＰＣＲ法扩增汉族人ＧＤＮＦ前体ｃＤＮＡ,利用昆虫杜状病毒表达系统（ＢＥＳ）表达此前体ｃＤＮＡ,原代培养中脑多巴胺能神经元对表达产物进行活性测定。结果：汉族人ＧＤＮＦ前体ｃＤＮＡ为截短的５５５ｂｐ的转录体,其在昆虫细胞中的分泌表达产物能促进多巴胺能神经元的存活和分化。结论：汉族人ＧＤＮＦ前体ｃ尤     

B型钠尿肽基因的克隆和原核表达载体构建及纯化

目的: 克隆人B型钠尿肽(脑钠素,B-type natriuretic peptide,BNP)基因,纯化其表达蛋白并制备多克隆抗体。方法: 用PCR技术从正常成人心脏组织cDNA库中扩增出人BNP基因,将其克隆进pUCm-T中并测定核苷酸序列。构建大肠埃希菌分泌性表达载体pGXE4T-2/BNP,用异丙基β硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,GSH-agarose亲和纯化表达蛋白,用纯化蛋白免疫BALB/c小鼠,制备多克隆抗体。结果: 经PCR扩增成功获得96bp的BNP基因,测序正确,在大肠埃希菌中融合表达后,该蛋白的表达量占菌体总蛋白的19%,用SDS-PAGE和Westernblot鉴定大肠埃希菌中的表达产物,显示其相对分子量29500。经亲和纯化后GST-BNP的纯度可以达到95%,500ml菌液中得到纯化蛋白9.6mg。多克隆抗体的效价为1:32000。结论: BNP基因的克隆、表达和纯化成功以及多抗的获得,为建立BNP检测方法奠定了基础。     

HSA-TP5融合基因表达载体的构建及其真核表达

目的：构建人血清白蛋白（HSA）-胸腺五肽（TP5）融合蛋白表达载体,并在毕赤酵母中表达,阐明其生物学活性。方法：利用基因重组技术构建HSA-TP5融合基因,并转染至毕赤酵母中从而构建其真核表达体系,通过琼脂糖凝胶电泳分离及试剂盒纯化获得PPICZαC-HSA-TP5真核重组表达质粒;采用两步发酵法对HSA-TP5基因工程菌进行高密度发酵,对发酵液上清蛋白沉淀浓缩,通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法、阳离子交换层析及疏水层析等方法分离纯化蛋白;采用MTT法检测该融合蛋白促淋巴细胞增殖活性。结果：PCR法获得HSA目的基因片段长度为1 845 bp。酶切鉴定融合质粒HSA-TP5-pPICZαC得到片段长度为707 bp。测序分析,目的基因HSA和TP5序列与GenBank公布的基因序列完全一致,并正向连接融合。PCR法鉴定PPICZαC-HSA-TP5真核重组质粒与酵母基因组DNA整合,与对照组比较,转化组出现基因片段长度为1 860 bp。SDS-PAGE分析,在甲醇诱导后72 h内,随着诱导时间延长,HSA-TP5融合蛋白表达量逐步升高。利用阳离子交换层析及AKTA多功能蛋白纯化系统纯化得到HSA-TP5融合蛋白。MTT法检测,HSA-TP5融合蛋白与TP5蛋白具有一致的促淋巴细胞增殖活性。结论：通过构建HSA-TP5毕赤酵母真核表达体系可获得HSA-TP5融合蛋白并具有生物学活性。     

Calpain 2调节自噬相关基因ATG7的表达在非酒精性脂肪性肝病中的作用

目的明确Calpain 2及自噬相关基因7(autophagy related gene 7,ATG7)在非酒精性脂肪性肝病中的表达变化及意义。方法应用高脂饮食喂养SD大鼠建立非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)在体模型,并按时相点分为4、8、12周及16周组,同时设立正常饮食组为对照组,每组6只。检测各组大鼠血清ALT、AST、FFA水平,通过HE染色观察肝脏脂肪变情况,利用Real-time PCR及Western blot检测Calpain 2及ATG7的表达变化。结果①HE染色提示肝脏脂肪变程度随高脂饮食喂养时间的延长而加重。NAFLD大鼠模型各时相点血清ALT、AST、FFA水平均较对照组有不同程度的升高,在16周组时分别为(165.95±7.24)U/L、(249.52±4.20)U/L、(0.83±0.05)mmol/L,与对照组比较均有明显的升高(P<0.01)。②以正常饮食组为对照组,肝组织Calpain 2 mRNA相对表达量在高脂饮食喂养后开始上调,在16周时升高最为明显(9.83±0.85,P<0.01);ATG7的mRNA相对表达量在4周组(0.82±0.02)即开始下降,在16周组(0.20±0.03)降至最低,与对照组比较降低显著(P<0.01)。③与对照组比较,Calpain 2蛋白相对表达水平与mRNA表达水平一致,4周组(2.32±0.45)时开始上调,16周组明显上升(9.87±1.20,P<0.01)。而ATG7的蛋白相对表达水平则随肝脏脂肪变性的进展明显下降,16周时降低最为明显(0.18±0.05,P<0.01)。结论脂肪肝发生过程中,Calpain 2的表达上调抑制了自噬相关基因ATG7的表达,进而减弱了自噬对细胞的保护作用,导致肝细胞的损伤加重,自噬可能参与了NAFLD的发生。     

日本血吸虫成虫HO-1编码基因片段的扩增及序列分析

目的 研究日本血吸虫成虫血红素加氧酶-1(HO-1)基因的表达并对部分编码区序列进行测序分析。方法 收集日本血吸虫成虫，提取总RNA；以成虫总RNA为模板，利用HO—1特异性引物一步法RT—PCR进行体外扩增，检测血吸虫成虫是否有HO-1基因的转录表达；纯化PCR扩增产物，DNA测序后进行序列分析。结果 提取较高纯度的血吸虫成虫总RNA后，RT—PCR扩增得到一特异性条带，测序结果显示该特异性片段长度为506bp。结论 本研究用RT-PCR的方法证实了HO—1基因在血吸虫体内的转录表达，为进一步研究血吸虫HO—1基因的全长和基因调控奠定了基础。     

用基因芯片研究异丙酚麻醉大鼠丘脑基因表达谱

目的:运用基因芯片研究异丙酚麻醉大鼠丘脑基因表达谱的变化. 方法:SD大鼠12只,随机分为对照组和异丙酚组,每组6只. 对照组、异丙酚组大鼠分别腹腔注射生理盐水或100 mg/kg异丙酚. 1 h后,取丘脑,抽提RNA,以RNA为模板逆转录合成cDNA,以cDNA为模板转录生物素标记的cRNA,cRNA经提纯、片断化后与大鼠神经生物学表达芯片U34杂交;杂交后的芯片用扫描仪检测信号,收集图像,用Microarray Suite Version 5.0软件分析差异表达基因并对其作初步功能分析. 结果:1323条待测基因中,异丙酚麻醉后221条基因差异表达,上调表达80条,下调表达141条,其中差异表达超过两倍的为53条. 差异性表达的基因功能可分为离子通道、信号转导、转录因子、细胞因子等. 结论:异丙酚麻醉可诱导大鼠丘脑众多基因的差异表达,基因芯片是研究全麻机制的有效方法.     

Beta-galactosidase gene from Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus gets non-fusion expression in Escherichia coli

OBJECTIVE: To construct the food-grade recombinant probiotic strain with high activity beta-galactosidase, the beta-galactosidase gene (lacZ)from Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus was in non-fusion expressed in Escherichia coli. METHODS: From Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus lacZ gene, the DNA sequence containing Shine-Dalgarno (SD) and ATGA sequences between upstream 18 bp and downstream 1 bp at start codon ATG was selected as upstream primer for PCR amplifying lacZ gene. Then lacZ cDNA was inserted into expression plasmid pMG36e to construct recombinant expression plasmid. Recombinant plasmids were introduced into E. coli, and positive clones were screened. To identify the gene recombination, the recombinant plasmid was cut by restriction enzyme and sequenced. To identify the protein expression, the beta-galactosidase activities of recombinant strains were determined. RESULTS: The restriction maps of recombinant plasmids were acceptable. The gene inserted into the recombinant plasmid had more than 99% homology with the lacZ gene of Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus. The enzyme activity and enzyme activity ratio of E. coli DH5 alpha carrying pMG36e-lacZ 1.1480 were 3.074 U/mL and 6.939 U/mg pro respectively. The enzyme activity and enzyme activity ratio of E. coli DH5a carrying pMG36e-lacZ wch9901 were 4.755 U/mL and 8.537 U/mg pro respectively. CONCLUSION: lacZ from Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus have gotten non-fusion expression in E. coli. The SD and ATGA sequences we selected can introduce lacZ non-fusion expression in E. coli.     

氯胺酮诱导大鼠丘脑基因表达谱的改变

目的:用基因芯片研究氯胺酮麻醉大鼠丘脑基因表达谱的变化.方法:SD大鼠4只,分为对照组(n=2)和氯胺酮组(n=2).两组大鼠分别腹腔注射生理盐水或100 mg/kg氯胺酮.1 h后,取丘脑,抽提RNA,以RNA为模板逆转录合成cDNA,以cDNA为模板转录生物素标记的cRNA,cRNA经提纯、片断化后与大鼠神经生物学表达芯片U34杂交.杂交后的芯片用扫描仪检测信号,收集图像,用Microarray Suite Version 5.0软件分析差异表达基因并对其进行功能分析.结果:1323条待测基因中,氯胺酮麻醉后237条基因差异表达,上调表达132条,下调表达105条,其中差异表达超过两倍的为59条.差异性表达的基因功能可分为NMDA受体、离子通道、信号转导、转录因子、细胞因子等.结论:氯胺酮麻醉可以引起大鼠丘脑基因的差异表达.