PTEN抑制人脐静脉内皮细胞ECV304的增殖和VEGF的表达

目的:探讨与张力蛋白同源的10号染色体缺失的磷酸酶基因(phosphatase and tensin hemology deleted on chromo-some ten gene,PTEN)对人脐静脉内皮细胞ECV304细胞增殖、凋亡,及血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)及其受体1(VEGF receptor 1,VEGFR1)的影响。方法:将携带有野生型PTEN及绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)基因的腺病毒Ad-PTEN-GFP及空载体腺病毒Ad-GFP感染ECV304细胞,MTT实验、Hoechst3342染色法及流式细胞术检测ECV304细胞的增殖和凋亡。实时荧光定量PCR法检测Ad-PTEN-GFP感染后ECV304细胞中PTEN、VEGF和VEG-FR1 mRNA表达水平,ELISA检测ECV304细胞培养上清中VEGF的水平。鸡胚尿囊膜(chick chorioallantoic membrane,CAM)血管生长实验检测PTEN对鸡胚血管生长的影响。结果:与Ad-GFP相比,Ad-PTEN-GFP感染能明显抑制ECV304细胞的增殖,诱导细胞凋亡,5 d时增殖抑制率可达(50.38±5.42)%、细胞凋亡率达(73.3±5.3)%。当感染复数为100时,Ad-PTEN-GFP组ECV304细胞的VEGF及VEGFR1 mRNA表达水平分别为未感染组的(13.40±1.32)%及(46.12±5.20)%。同时,Ad-PTEN-GFP感染能够明显抑制CAM体内血管生长[血管指数(57.6±3.37)%vs(92.2±4.37)%,P<0.05]。结论:PTEN能显著抑制人脐静脉内皮细胞ECV304的增殖、促进其凋亡,其机制可能与抑制VEGF和VEGFR1表达,抑制血管新生有关。     

PTEN/PI3K/Akt信号通路对K562细胞凋亡调控的研究

 目的 探讨PTEN/PI3K/Akt信号传导通路对人慢性粒细胞白血病细胞系K562的增殖、凋亡调控的研究及可能的分子作用机制。 方法 将携带有野生型PTEN及绿色荧光蛋白的腺病毒（Ad-PTEN-GFP）及空载体（Ad-GFP）腺病毒,转染人慢性粒细胞白血病细胞系K562。通过MTT检测细胞生长曲线,流式细胞术检测细胞凋亡率和细胞增殖指数,同时用细胞光镜、电镜形态等方法检测细胞凋亡,荧光定量PCR（FQ-PCR）检测PTEN及凋亡相关基因Bcl-2、Bcl-_xL、Bax mRNA水平变化,Western blot检测PTEN及Akt、p-Akt蛋白水平变化。 结果 与Ad-GFP组相比,Ad-PTEN-GFP 转染K562细胞后,细胞增殖受抑,增殖指数降低,凋亡率增加,p-Akt表达降低,抗凋亡相关基因Bcl-2、Bcl-_xL mRNA表达降低,促凋亡基因Bax mRNA表达增加。 结论 过表达PTEN可能通过抑制PI3K/Akt通路抑制K562细胞系增殖,促进细胞凋亡。     

PTEN对K562细胞mTOR调控的研究

目的:探讨肿瘤抑制基因PTEN在人慢性粒细胞白血病细胞株K562中对哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin ,mTOR)的调控作用,以及雷帕霉素(rapamycin,RAPA)对K562细胞增殖抑制的影响.方法:通过实时荧光定量PCR(real-time fluorescent quantification PCR,RFQ-PCR)法检测甲磺酸伊马替尼(imatinib mexylate)干预K562细胞后BCR/ABL、PTEN、mTOR mRNA的表达水平及相互关系;Western 印迹法检测甲磺酸伊马替尼干预和以腺病毒为载体感染野生型PTEN(Ad-PTEN-GFP )后K562细胞PTEN、Akt和p-Akt的蛋白表达水平;用MTT和FCM方法检测RAPA对不同腺病毒感染组K562细胞增殖及凋亡的影响.结果:格列卫干预K562细胞后,BCR/ABL和mTOR mRNA表达下调,PTEN mRNA表达上调;与感染Ad-GFP组相比,感染Ad-PTEN-GFP组的mTOR mRNA表达下调;Ad-PTEN-GFP感染与10 nmol/L RAPA联合作用于K562细胞能够发挥协同作用,对K562细胞的增殖抑制率明显高于单独作用组.结论:PTEN是mTOR的上游调控基因,能够抑制mTOR的表达.RAPA与野生型PTEN一起可以协同抑制K562细胞的增殖.     

转染抗VEGF发夹状核酶基因白血病细胞模型的建立

 目的 建立转染抗血管内皮生长因子（VEGF）发夹状核酶基因的白血病细胞模型,探讨发夹状核酶对白血病细胞系K562 VEGF基因表达的效应。方法 采用脂质体介导的方法将抗VEGF发夹状核酶基因真核表达载体（pcDNA3-RZ）转染入人白血病细胞系K562,G418抗性筛选获得阳性克隆,转染VEGF pcDNA3-RZ和空载体（pcDNA3）的细胞组均有抗性细胞生长,分别命名为K562-RZ和K562-PC;抽提基因组DNA,用PCR方法验证核酶基因已转染入K562细胞,荧光定量PCR和western blot方法分别检测白血病细胞VEGF mRNA和蛋白的表达量;同时测定K562-RZ,K562-PC和 K562三组培养上清刺激内皮细胞生长的情况。结果 抗VEGF pcDNA3-RZ成功转入白血病细胞系K562,G418筛选2周获得阳性克隆,PCR检测证实核酶基因整合入白血病细胞基因组DNA;与K562及K562-PC细胞相比,转染VEGF核酶基因的K562-RZ细胞VEGF mRNA和蛋白的表达量明显降低;K562-RZ组培养上清对内皮细胞的刺激作用明显弱于K562-PC组。结论 建立了转染VEGF发夹状核酶基因的白血病细胞模型,抗VEGF发夹状核酶基因可明显下调白血病细胞VEGF的表达,为抗肿瘤治疗提供了新的线索。     

下调WT1基因对K562细胞血管内皮生长因子表达的影响

 目的　探讨WT1基因沉默对人类白血病细胞血管内皮生长因子（VEGF）表达的影响。方法　将已构建的WT1小发夹RNA（shRNA）质粒载体转染入K562细胞，流式细胞术检测转染效率并对转染细胞进行分选，实时荧光定量PCR检测细胞转染前后WT1及VEGF基因mRNA的表达变化，用ELISA检测转染前后细胞培养液中VEGF浓度的变化。结果　转染48 h，WT1shRNA质粒转入K562细胞，转染效率为（65±4.5）%，通过流式细胞术分选，可以得到纯度达98 %以上的WT1shRNA阳性细胞，转染后的K562细胞WT1及VEGF基因mRNA表达较转染前及对照组均明显降低（P＜0.05），转染后48、72 h细胞培养液中VEGF的含量较对照组明显降低（P＜0.05）。结论　WT1干扰质粒在体外可以抑制白血病细胞株VEGF的表达，提示WT1基因可能通过上调VEGF基因的表达而参与白血病的血管新生。     

姜黄素抑制HeLa细胞诱导的血管内皮细胞增殖作用及其机制研究

目的:研究姜黄素对HeLa细胞诱导的血管内皮细胞增殖的抑制作用及其机制.方法:采用台盼蓝排染法计数人脐静脉内皮细胞系ECV304细胞,MTT法测定不同浓度姜黄素对ECV304细胞和HeLa细胞诱导的ECV304细胞增殖的抑制,采用RT-PCR和Western blot检测40 μmol/L姜黄素作用于HeLa细胞诱导的血管内皮细胞4、8、16和24 h后,血管内皮生长因子(VEGF)及其受体VEGFR2(KDR)基因及蛋白的表达.结果:姜黄素直接作用于ECV304细胞,其细胞计数较对照组显著减少(P<0.05),并呈浓度依赖性.MTT法测得不同浓度姜黄素作用后,可产生显著的细胞增殖抑制作用,48 h体外半数抑制浓度(IC50)值为(38.4±0.031) μmol/L.随着姜黄素浓度的增加,其时ECV304细胞和HeLa细胞诱导的ECV304细胞的增殖有明显的抑制作用,P值分别为0.000 0和0.000 1.姜黄素作用于HeLa细胞诱导的血管内皮细胞4、8、16和24 h后,能明显下调VEGF与KDR的mRNA和蛋白表达.结论:姜黄素能直接抑制血管内皮细胞的增殖,对HeLa细胞诱导的血管内皮细胞的增殖也有抑制作用.此作用可能是通过押制VEGF及其受体KDR的mRNA和蛋白表达来实现的.     

重组反义c-myc腺病毒抑制K562细胞生长、诱导凋亡的作用

目的：研究重组反义cmyc腺病毒（Ad—AS-c-myc）对人慢性粒细胞K562细胞系抑制生长，诱导凋亡作用及分子机制，探讨Ad-As-c—myc用于慢性粒细胞白血病基因治疗的可能性。方法：采用重组腺病毒Lac—Z（Ad—LacZ）及Ad—AS-c—myc联合多聚季胺转染K562细胞，Xgal染色判断转染效率。采用形态学、MTT试验、RT—PCR、DNA凝胶电泳、流式细胞仪及免疫细胞化学等方法进行研究。结果：多聚阳离子可提高腺病毒载体对K562细胞的转染，Ad—LacZ＋多聚季胺转染率达86％。AdAS—c—myc能抑制K562细胞c—myc基因在转录水平的表达，K562细胞生长受抑（抑制率38％）；Ad—AS-c—myc可使K562细胞G2、G2期阻滞，增殖相关基因PCNA表达降低，Apo2．7蛋白阳性细胞率增高，DNA电泳出现DNA梯形条带。结论：Ad—AS-c-myc对K562细胞具有抑制生长及诱导凋亡作用，其生物学作用与K562细胞c-myc及PCNA的表达降低有关。Ad-AS-c-myc在慢性粒细胞白血病基因治疗中具有潜在的临床价值。     

重组人血管内皮生长因子165对K562白血病细胞生物学活性的影响

目的：探讨人重组血管内皮生长的因子165对人K562白血病细胞生物学活性的影响。方法：利用pcDNA3.1（＋）质粒构建人重组含VEGF165的真核表达载体,脂质体转染至K562白血病细胞,并用G418筛选阳性克隆;以RT-PCR测定重组质粒载体VEGF165基因的表达;MTT法测定K562白血病细胞的生长;建立裸鼠皮下移植人K562肿瘤模型,测定肿瘤体积的大小;免疫组化检测肿瘤的微血管密度（MVD）。结果：成功构建pcDNA3.1（＋）-VEGF165表达质粒。K562白血病细胞转染重组质粒后,明显增加K562细胞中VEGF165 mRNA的表达,转染重组质粒的K562细胞增殖明显快于对照组;移植重组pcDNA3.1（＋）-VEGF165质粒转染的K562细胞之后,荷瘤鼠移植瘤生长明显快于对照组;并且移植瘤组织微血管密度明显高于对照组（P〈0.05）。结论：利用pc DNA3.1（＋）真核表达质粒可成功构建含人VEGF165的重组质粒,重组质粒转染K562细胞后,体内外均明显促进K562细胞增殖。     

抗VEGF抗体诱导K562细胞凋亡及其机制的研究

目的 观察抗VEGF抗体对K562细胞凋亡的影响,探讨VEGF抑制白血病细胞凋亡的机理.方法 采用半定量逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测抗VEGF单抗对拓扑异构酶Ⅱ（TOPOⅡ）表达的影响;采用低浓度溴乙啶荧光测定法检测细胞TOPOⅡ的活性;应用琼脂糖凝胶电泳检测K562细胞凋亡的情况.结果 抗VEGF抗体能抑制K562细胞TOPOⅡ的表达,降低TOPOⅡ的活性,促进DNA解旋、断裂;抗VEGF单抗作用于K562细胞后,电泳结果显示有凋亡细胞特有的“梯状”条带.结论 抗VEGF单抗能引起白血病细胞凋亡,其原因可能是抗VEGF单抗抑制了白血病细胞TOPOⅡ基因的表达.     

淫羊藿苷与黄芩苷联合多柔比星对肝癌细胞APRIL表达和血管内皮细胞生长抑制的研究

目的:探讨中药单体淫羊藿苷(ICA)、黄芩苷(BAI)联合化疗药多柔比星(ADM)抑制肝癌HepG2细胞APRIL、VEGF的表达,进而抑制血管内皮细胞生长的作用机制.方法:MTT法检测血管内皮细胞ECV304的增殖活性;RT-PCR法检测HepG2细胞APRIL表达水平和ECV304细胞中APRIL受体HSPG的表达情况;免疫细胞化学检测HepG2细胞VEGF表达水平.结果:HepG2细胞中VEGF蛋白、APRIL和ECV304细胞中APRIL受体HSPG的mRNA均呈高表达状态,且APRIL与VEGF两者高表达呈显著正相关(P＜0.001);HepG2细胞经25 μg/mL ICA、200 μg/mL BAI、2 μg/mL ADM以及12.5 μg/mL ICA+1 μg/mL ADM、100 μg/mL BAI+1 μg/mL ADM 5组药物处理后,与未用药对照组相比,APRIL mRNA表达水平明显下降;HepG2细胞经5组药物处理后的上清液与未用药对照组相比,对ECV304细胞具有明显的增殖抑制作用,抑制率分别为(2.79±5.57)%、(15.20±3.79)%、(12.10±4.50)%、(19.34±8.17)%和(20.27±4.77)%(P均＜0.05);HepG2细胞经5组药物处理后,与未用药对照组相比,VEGF的表达水平明显下降.结论:APRIL具有促进静脉内皮细胞ECV304增殖的作用.ICA、BAI联合ADM能降低HepG2细胞中APRIL与VEGF的表达水平,从而发挥其抑制血管内皮细胞ECV304生长的作用.