人IL—3cDNA探针刺备及应用

采用多连反应扩增人ＩＬ－３ｃＤＮＡ片段,以地高辛为标记物,随机引物法标记ＩＬ－３ｃＤＮＡ探针。探针经斑点杂交和核酸原位杂交证明：用制备ＩＬ－３ｃＤＡＮ探针检测细胞ＩＬ－３ｍＲＮＡ表达具有特异性强,灵敏度高,使用简便,杂交结果直观,探针可较长时间保存和无放射性污染等优点。     

RT－PCR制备人IL－3 cDNA的改进

ＲＴ－ＰＣＲ制备人ＩＬ－３ｃＤＮＡ的改进Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔｉｎｔｈｅｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｏｆｈ－ＩＬ－３ｃＤＮＡｂｙＲＴ－ＰＣＲ￥／／陈鸿书，曹廷兵，姚家慧，陈嵩（重庆第三军医大学基础部基因工程实验室）重庆，６３００３８人白细胞介素－３（ｈ－Ｉ...     

白细胞介素－12 mRNA在移植物中的变化

应用反转多聚酶链式反应（ＲＴ－ＰＣＲ）及萤光标记ＤＮＡ探针技术检测ＩＬ－１２ｍＲＮＡ在纯系小鼠心移植物及宿主脾脏中的变化。结果表明：①移植的心脏在移植后（７．０±０．７）ｄ被排斥。②ＩＬ－１２ｍＲＮＡ在正常Ｂａｌｂ／ｃ（Ｈ－２￣ｄ）小鼠心脏中为阴性，在正常Ｃ＿３Ｈ／ＨｅＪ（Ｈ－２￣ｋ）小鼠脾脏中为弱阳性。③移植后第５ｄ，移植于Ｃ＿３Ｈ／ＨｅＪ的Ｂａｌｂ／ｃ心脏中和宿主Ｃ＿３Ｈ／ＨｅＪ的脾脏中ＩＬ－１２ｍＲＮＡ呈强阳性。提示ＩＬ－１２在排斥反应中起重要作用。     

人白细胞介素—15cDNA真核表达载体的构建及其在肺癌细胞？…

目的 观察人ＩＬ－１５ｃＤＮＡ在腺癌细胞内的表达,方法将人ＩＬ－１５ｃＤＮＡ于ＥｃｏＲⅠ、ＢａｍＨＩ位点正向克隆到逆转录病毒载体ｐＬＸＳＮ构建ＰＬ－ＩＬ－１５－ＳＭ的重组质粒。以Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ介导将该重组质粒转染到人肺鳞癌细胞（ＰＧ细胞系）和小鼠肺腺癌细胞（ＬＡ７９５细胞系）。经Ｇ４１８条件培养筛选,获得阳性细胞克隆。再经ＣＴＬＬ－２细胞增殖法阳性细胞ＩＬ－１５的表达活性。结果 获得３个ＰＧ     

人白细胞介素-15cDNA真核表达载体的构建及其在肺癌细胞中的表达

目的观察人ＩＬ－１５ｃＤＮＡ在腺癌细胞内的表达。方法将人ＩＬ－１５ｃＤＮＡ于ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ位点正向克隆到逆转录病毒载体ｐＬＸＳＮ,构建ｐＬ－ＩＬ－１５－ＳＮ的重组质粒。以Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ介导将该重组质粒转染到人肺鳞癌细胞（ＰＧ细胞系）和小鼠肺腺癌细胞（ＬＡ７９５细胞系）。经Ｇ４１８条件培养筛选,获得阳性细胞克隆。再经ＣＴＬＬ－２细胞增殖法测阳性细胞ＩＬ－１５的表达活性。结果获得３个ＰＧ细胞和４个ＬＡ７９５细胞阳性克隆,ＩＬ－１５活性测定显示其表达水平在２４ｈ内分别在１４２～２０１或１３８～１７８Ｕ／（ｍｌ·１０６细胞）。结论ＩＬ－１５ｃＤＮＡ转导的人和小鼠肺癌细胞可表达有生物学活性的ＩＬ－１５。     

重组人单链白细胞介素12融合基因（rhscIL—12）的构建和真？…

目的 克隆人ＩＬ－１２（ｈＩＬ－１２）ｐ４０和ｐ３５亚单位ｃＤＮＡ，构建人单链ＩＬ－２（ｒｈｓｃＩＬ－２）融合基因，并在哺乳动物细胞中进行表达。方法从经ＰＤＢｕ刺激的ＥＢＶ转化的人Ｂ淋巴细胞株ＮＣ３７中提取ｍＲＮＡ，经ＲＴ－ＰＣＲ分别获得ｈＩＬ－１２ｐ４０和ｐ３５亚单位编码序列的ｃＤＮＡ，运用重组ＰＣＲ技术将两段基因通过一疏水性多肽接头（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３ＤＮＡ序列进行体外基因重组，构建ｒｈｓｃＩ     

逆转录病毒转染的小鼠IL－3基因在NIH／3T3细胞中的表达

将小鼠白细胞介素３（ＩＬ－３）ｃＤＮＡ重组到逆转录病毒载体ｐＮ２Ａ质粒上，用电穿孔法将此重组子转染包装细胞系（ＰＡ３１７），经用Ｇ４１８（ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ）选择培养基筛选，得到产病毒效价为每ｍｌ５×１０４～２×１０５ＣＦＵ（ｃｏｌｏｎｙ－ｆｏｒｍｉｎｇｕｎｉｔ）的Ｇ４１８抗性细胞克隆。然后取其培养上清液转染ＮＩＨ／３Ｔ３细胞。通过检测被病毒转染的ＮＩＨ／３Ｔ３细胞培养上清液对小鼠骨髓细胞的增殖反应（ＭＴＴ法）和促分化作用（ＣＦＵ培养法），表明转染的ＮＩＨ／３Ｔ３细胞克隆能分泌ＩＬ－３。此结果为进行ＩＬ－３转基因治疗研究奠定了实验基础。     

人白细胞介素—2基因真核表达载体pDORIL—2的构建

构建逆转录病毒载体介导的人白细胞介素－２（ＩＬ－２）基因真核细胞表达载体。方法：合成带有和表达载体克隆位点相匹配酶切位点的聚合酶链式反应（ＰＣＲ）引物，用ＰＣＲ方法从质粒ｐＨＩＧ５３中扩增出人的ＩＬ－２ｃＤＮＡ，将其定向克隆入表达载体ｐＤＯＲ－ｎｅｏ。结果：ＰＣＲ扩增出的ＩＬ－２ｃＤＮＡ片段约４７５ｂｐ，酶切鉴定该片段已被克隆入ｐＤＯＲ－ｎｅｏ的多克隆位点，构建成人ＩＬ－２基因真核表达载体ｐＤＯＲ     

用原位杂交技术检测血单个核细胞白细胞介素2mRNA

用地高辛素（ＤＩＧ）标记人白细胞介素２（ＩＬ－２）ｍＲＮＡ的ｃＤＮＡ探针，在外周血单个核细胞（ＰＢＭＣｓ）涂片上进行原位杂交，并用鼠抗人ＩＬ－２单克隆抗体检测ＩＬ－２分泌细胞。结果显示，终末期肾衰（ＥＳＲＤ）接受血液透析（ＨＤ）治疗患者的ＩＬ－２ｍＲＮＡ及ＩＬ－２阳性单个核细胞数与正常对照组、原发性肾小球疾病（简称肾病）组和ＥＳＲＤ未接受透析治疗组相似，但是，ＨＤ后ＩＬ－２基因表达显著增加（Ｐ＜０．０５）。     

人白细胞介素—2cDNA导入对卵巢癌耐药细胞株耐药性的逆转

为了构建ｐｃＤＮＡ－ＩＬ－２真核表达质粒，并探讨白细胞介素－２（ＩＬ＿２）ｃＤＮＡ导入对顺铂诱民的卵巢癌耐药细胞株耐药性的影响。我们采用ＰＣＲ技术扩增人ＩＬ－２ｃＤＮＡ片段，构建ｐｃＤＮＡ－ＩＬ－２真核表达质粒。导入顺铂诱导的人卵巢癌耐药细胞株，观察其耐药性的改变。结果成功构建了ｐｃＤＮＡ－ＩＬ－２真核表达质粒，并在Ｃｏｓ－７细胞高效表达，导入卵巢癌耐药细胞后其对顺铂的敏感性显著升高。说明转导ｐｃ     

人白细胞介素-10 cDNA的克隆

目的：克隆人白细胞介素10(hIL-10)cDNA的全长序列，为其分子生物学利用奠定基础。方法：无菌条件抽取正常成人外周血15ml，分离单核细胞，用刀豆素A(ConA)刺激培养24h；离心得到一定量细胞，加入变性液，一步法提取细胞总RNA；反转录合成IL-10的第1条链，用自己设计的特异性上下游引物进行PCR扩增，得到期望分子量的PCR产物；酶切后插入PcDNA3载体，转染感受态细胞进行筛选制备，并行酶切鉴定和测序。结果：外周血单核细胞经ConA刺激后IL-10转录水平增加，从提取的RNA反转录产物中容易扩增出期望分子量的PCR产物，酶切鉴定证明得到的IL-10cDNA分子量与基因库报告的相近，测序结果表明得到的IL-10cDNA序列与基因库报告的序列完全一致。结论：人的IL-10cDNA全长序列被成功克隆。     

人白细胞介素－6受体cDNA的克隆

应用ＲＴ－ＰＣＲ技术，从人的外周血单个核细胞中扩增出人ＩＬ－６受体的特异性ｃＤＮＡ片段，经琼脂糖电泳证实扩增片段大约为１４００碱基对。运用ＤＮＡ重组技术，将获得的片段连接到ＰＵＣ１８质粒中，经转化、筛选、酶切鉴定构建出重组质粒ｐＵＣＩＬ－６受体；经序列分析证实为编码人ＩＬ－６受体的ｃＤＮＡ片段。     

中药复方药物血清对FADD和MCL-1基因在人卵巢癌细胞株SKOV3中表达的影响

目的研究FADD和MCL-1基因在中药复方理冲生髓饮诱导人卵巢癌细胞株SKOV3细胞凋亡中的作用。方法 Wistar大鼠随机分组,灌胃给药,采血制备含药血清。提取生理盐水组及理冲生髓饮组肿瘤细胞mRNA,制备DNA探针并分别用Cy3和Cy5两种荧光染料标记,与人细胞凋亡寡核苷酸微阵列芯片进行杂交,经扫描、分析,得出药物作用后表达有差异的基因。结果共筛选出显著表达差异基因66种,其中20种基因表达水平上调,46种基因表达水平下调。结论理冲生髓饮能够抑制细胞增殖并诱导其凋亡,其细胞凋亡机制与上调FADD基因和下调MCL-1基因有关。     

人白细胞介素-16真核表达载体的构建及其对Th2型肿瘤细胞的促逆转作用

构建人IL-16真核表达载体,分析其对Th2型肿瘤细胞的逆转作用。方法用RT- PCR技术从人外周血单个核细胞中获取IL-16cDNA,插入PUC-18T载体并测序,构建并鉴定真核表达载体PcDNA3-IL-16,转染KarpasT淋巴瘤细胞,分析阳性克隆中IFNγ,IL-2,IL-4,IL-6,IL-13,TNFα和IL-16等细胞因子的表达状况。结果序列测定显示所克隆的人IL-16cDNA与基因库中所登录的序列完全一致,EcoRI和BamHI双酶切及PCR鉴定显示所构建的真核表达载体PcDNA3-IL-16完全正确,RT-PCR显示转染PcDNA3-IL-16的KarpasT淋巴瘤细胞高表达IL-16mRNA,同时,Th1类细胞因子IFNγ表达明显增高,Th2类细胞因子IL-4,IL-6,IL-13表达降低,MTT法显示KarpasT淋巴瘤细胞的增殖受到明显抑制。结论成功构建了真核表达载体PcDNA3-IL16,转染KarpasT淋巴瘤细胞后使其细胞因子类型由Th2型向Th0型逆转,且生长受到明显抑制,表明向肿瘤细胞转染人IL-16是一种有用的肿瘤生物治疗方法。     

脂多糖对人单个核细胞白细胞介素-6基因表达的影响

目的：探讨脂多糖(LPS)对人单个核细胞表达白细胞介素-6(IL-6)mRNA的影响。方法：抽取人外周静脉血，经EDTA抗凝，LPS刺激培养，分离单个核细胞并提取总RNA，将总RNA逆转录为cDNA，然后用IL-6引物进行热启动PCR扩增。扩增产物热变性后与IL-6检测探针、捕获探针进行夹心杂交，最后加入亲和素-辣根过氧化物酶及其底物，显色检测杂交信号。IL-6引物及探针用Primer Premier 5．0软件设计。结果：LPS可在转录水平上诱导IL-6 mRNA表达，其作用强度与LPS剂量呈正相关；IL-6 mRNA表达丰度有时间效应，刺激4h后，IL-6 mRNA的表达最高。结论：LPS能显著增强人单个核细胞表达IL-6 mRNA。     

Interleukin 1 beta gene expression by mouse glomerular mesangial cells]

Interleukin 1 beta (IL-1 beta) plasmid DNA was isolated and purified with alkaline lysis method and equilibrium centrifugation in cesium chloride. IL-1 beta plasmid RNA was cut by restriction endonucleases EcoRI and XbaI, and after that it was 1 loaded in 0.75% low-melting-temperature agarose and underwent electrophoresis. 1.2 Kb DNA fragments were extracted from gel and for further purification it was used as IL-1 beta cDNA probe. RNA from mouse glomerular mesangial cells, tubular epithelial cells and P388D, cells was cut with EcoRI separately and then hybridized in dot blots with alpha 32P labeled IL-1 cDNA probe. The dot blot autoradiograph showed expression of the IL-1 beta gene in mesangial cell and P388D1 cell but showed no expression in epithelium. These results not only identified the specificity of IL-1 beta probe but also suggested that the local production of IL-1 beta may be important in the pathogenesis of glomerulonephritis.     

白细胞介素18在人白血病细胞系J6-1的表达及其意义

目的阐明白细胞介素18(IL-18)在人白血病细胞系J6-1的表达与调控,探讨IL-18在白血病发生中的意义.方法应用逆转录浆合酶链反应检测IL-18mRNA的表达,酶切鉴定其特异性;构建IL-18的重组质粒,测序分析其cDNA序列的同源性;应用反义核酸技术,观察不同浓度的IL-18反义寡脱氧核苷酸(ASODN)对J6-1细胞增殖的影响.结果J6-1细胞组成性高表达IL-18mRNA,测序结果表明,其cDNA序列与文献报道IL-18的同源性为99%,仅有一处同义点突变(35UCA→UCC).正常人外周血单个核细胞(PBMC)IL-18mRNA的表达水平很低(0.13±0.05),CpG寡脱氧核苷酸(CpG-ODN)显著上调IL-18在PBMC的表达(0.82±0.24),但对J6-1细胞无类似上调作用.IL-18在J6-1细胞的表达水平(0.98±0.29)明显高于在K562、HL-60、U937和LCL细胞系的表达.IL-18ASODN能显著抑制J6-1细胞的增殖(抑制率43.3%),而对HL-60的抑制作用不明显(抑制率16.7%).结论J6-1细胞组成性高表达IL-18;IL-18基因的编码区在J6-1细胞不存在有意义的突变;IL-18可能通过自分泌途径正向调节J6-1细胞的增殖.     

人白细胞介素-15 cDNA在中国仓鼠卵巢细胞中的高效稳定表达

目的　在中国仓鼠卵巢细胞（ＣＨＯ）中表达人白细胞介素１５（ＩＬ１５）,为ＩＬ１５ 的功能研究提供有利条件。方法　采用ＰＣＲ技术扩增人ＩＬ１５ 编码区ｃＤＮＡ片段,构建重组真核表达载体,再以脂质体法转染至ＣＨＯ 细胞进行表达,鉴定表达产物的生物学活性。结果　共获得８ 株高效表达ＩＬ１５ 的阳性克隆,其平均活性为（３１８５４±３２７２）Ｕ／（１０６ ｃｅｌｌｓ·ｄ）,稳定传代６ 个月后仍保持其表达活性。结论　人ＩＬ１５ ｃＤＮＡ在ＣＨＯ细胞中获得高效稳定表达     

大鼠白细胞介素—10cDNA的克隆

目的：克隆大鼠白细胞介素－10（IL－10)cDNA的全长序列，为其分子生物学利用奠定基础，方法：无菌条件下切取大鼠的脾脏，收集脾细胞，用脂多糖（LPS）刺激培养4h离心得到一定量细胞，加入变性液，一步法提取细胞总RNA；逆转录合成IL－10的第1条链，用自己设计的特异性上下游引物进行PCR扩增，得到期望相对分子质量的PCR产物；酶切后插入pcDNA3载体，转染感受态细胞进行筛选制备，并行PCR、酶切鉴定和测序。结果：脾细胞经LPS刺激后IL－10转录水平增加，从提取的RNA转录产物中容易扩增出期望相对分子质量的PCR产物，酶切和PCR鉴定证明所得IL－10cDNA相对分子质量与其因库报告的相近，测序表明得到的IL－10cDNA充阢与基因库报告的序列完全一致，结论，大鼠的IL－10cDNA全长序被成功克隆。     

Cytokine-induced killer cells showing multidrug resistance and remaining cytotoxic activity to tumor cells after transfected with mdr1 cDNA

Background Routine treatment of cancer such as surgery, radiation or chemotherapy is sometimes unable to erdiacate metastatic malignant cells. So we tried a new method and increased the adoptive immunotherapy of Cytokine-induced killer (CIK) cells in tumor patients and the multidrug resistance (mdrl) cDNA was transfected into CIK cells. Methods CIK cells were obtained from peripheral blood and induced by IFN-γ, anti-CD3 monoclonal antibody, IL-2 and IL-1. CIK cells were transfected with plasmid PHaMDR containing human mdrl cDNA by electroporation. RT-PCR was used to detect mdrl mRNA in transfected CIK cells. P-glycoprotein (P-gp) expressed on surface of CIK cells was assayed by FITC-conjugated anti-P-gp monoclonal antibody and flow cytometry. Multidrug resistance to doxorubicin and colchicine and cytotoxic activity to human breast cancer cell line MCF7 were performed using MTT method. Results mdrl mRNA was detected in transfected CIK cells. P-gp was expressed on the surface of the transfected CIK cells, and the P-gp positive cells reached 21%-37% of the total CIK cells after transfection. The IC50 to doxorubicin increased to 22.3-45.8 times, and that to colchicines to 6.7-11.35 times, as compared to those of untransfected CIK cells. However, the cytotoxic activity to MCF7 cell line remained unaltered. Conclusions CIK cells were successfully transfected with mdrl cDNA by using electroporation. The transfected CIK cells had the characteristics of multidrug resistance without change in their cytotoxic activity to tumor cells.