日本血吸虫成虫培养细胞SDH和LDH细胞化学研究

目的　研究日本血吸虫成虫培养细胞琥珀酸脱氢酶 (SDH)和乳酸脱氢酶 (LDH)含量、分布及变化规律 ,了解日本血吸虫成虫培养细胞的能量代谢类型。方法　将虫龄 2 6d的日本血吸虫成虫细胞接种于小盖玻片上 ,培养于RPMI- 16 4 0含2 0 %小牛血清附加常量抗生素的培养基中 ,定时运用Pearson法进行SDH和LDH染色 ,用Olympus-BH2 显微镜观察并拍照 ,用HPIAS - 2 0 0 0图像分析仪测量其含量 ,并作统计分析。结果　日本血吸虫成虫培养细胞均具有SDH和LDH活性 ,两者均分布在细胞质内。培养 1d细胞的SDH和LDH活性最强 ,随着培养时间延长 ,其活性逐渐减弱 ,其中SDH活性下降较快 ,培养 5d大部分细胞SDH活性已极弱 ;而LDH活性下降则较缓 ,培养 5 6d细胞仍具LDH活性。结论　体外培养的日本血吸虫成虫细胞的能量代谢类型与成虫相似 ,既存在三羧酸循环需氧型呼吸链 ,也具有无氧糖酵解 ,但以无氧糖酵解为主。     

亚精胺对日本血吸虫成虫培养细胞SDH的影响

目的以琥珀酸脱氢酶（SDH）为指标,探讨亚精胺（Spermidine,Spd）对日本血吸虫成虫培养细胞生长代谢的影响. 方法将24 d龄的日本血吸虫成虫用冷消化法制成细胞悬液,联合法将细胞接种于小盖玻片上培养.培养至第4 d,一部分细胞用含Spd终浓度分别为0（对照）、25、50、75、80、90、100、150、200 μmol/L的无血清培养基处理24 h,另一部分细胞用终浓度为75 μmol/L的Spd分别处理0（对照）、12、24、36、48、60、72 h.然后用PBS清洗3次,再换用常规培养基继续培养.至第8 d,对处理过的培养细胞进行SDH细胞化学染色,Olympus-BH2显微镜下观察、拍照,并将结果输入HPIAS-2000图像分析仪进行图像分析. 结果用Spd作用24 h,日本血吸虫培养细胞的SDH活性随Spd浓度的升高逐渐增强,75 μmol/L时达到最高,〉75 μmol/L,SDH活性逐渐减弱.当Spd作用浓度为75 μmol/L时,日本血吸虫培养细胞的SDH活性随着Spd作用时间的延长逐渐增强,48 h时达到最高,然后逐渐减弱.统计学分析显示,Spd处理后的实验组培养细胞,其SDH活性与对照组细胞比较差异具有显著性（P〈0.05）;用终浓度为75 μmol/L的Spd处理培养细胞48 h,培养细胞的SDH活性显著强于其余各组（P〈0.01）. 结论 Spd可显著增强日本血吸虫培养细胞的生长代谢活性;用终浓度为75 μmol/L的Spd处理48 h,培养细胞的SDH活性最强.     

醉鱼草有效组分杀灭钉螺的酶促动力学研究

目的 目的 分析醉鱼草有效组分 （AIBL） 对湖北钉螺的酶促动力学影响。方法 方法 湖北钉螺浸泡于3.55 mg/L AIBL溶 液中， 分别于浸泡后24、 48、 72 h时用赖氏法测定钉螺GPT活性， 用化学抑制乳酸底物法测定LDH活性， 用磷酸苯二钠比 色法测定AKP活性， ELISA法测定AChE和MDH活性， 硫酸甲酯吩嗪反应法测定钉螺SDH活性。结果 结果 浓度为3.55 mg/L 的AIBL溶液在浸泡湖北钉螺24 h后， 钉螺GPT、 LDH、 AKP 活性显著提高， 钉螺头足部及肝脏SDH和MDH活性显著降 低， 但对AChE活力无影响。结论 结论 AIBL 能显著损害湖北钉螺肝脏、 作用于无氧和有氧呼吸作用位点、 影响能量代谢， 并 导致能源供应不足， 最终导致钉螺死亡。     

湖北钉螺细胞原代培养的初步研究

目的研究湖北钉螺组织细胞的原代培养。方法无菌处理并解剖钉螺成螺及螺胚,分别获得软体、肝脏、外套膜及胚胎组织。将软体、肝脏及胚胎组织剪碎,用0.25％胰蛋白酶和0.02％乙二胺四乙酸(EDTA)混合液4℃下消化数小时,所得细胞按三宅的湿润系统固定法接种于钉螺的外套膜组织。培养液为1/2浓度的RPMI1640含20％小牛血清附加常量抗生素(青霉素100IU/ml,链霉素100μg/ml),温度为27℃～28℃,pH7.2～7.4。结果钉螺的胚胎组织冷消化后,获大量游离细胞。接种培养5d,见有贴壁细胞,扁平状,多边或不规则形,大小约为(15～20×12～15)μm。培养细胞以悬浮状为主,直径为8～12μm,少数为30～35μm。生长良好,可传代培养。结论钉螺胚胎细胞可进行原代培养及传代。     

红景天苷对内毒素诱导的RAW264.7细胞损伤拮抗作用的研究

目的:观察不同浓度的红景天苷（SDS）对内毒素（LPS）引起的巨噬细胞RAW264.7损伤的拮抗作用,并初步探讨其作用机制。方法: 将小鼠巨噬细胞RAW264.7随机分为正常对照组（A组）、LPS组(B组)、SDS (5 μg/ml)对照组（C组）、SDS(5 μg/ml)+LPS组（D组）、SDS(10 μg/ml) 对照组（E组）、SDS(10 μg/ml)+LPS组(F组)、SDS(20 μg/ml) 对照组(G组)和SDS(20 μg/ml)+LPS组(H组)。选取对数生长期的细胞,相继用SDS（0~20 μg/ml）预处理1 h及1 μg/ml LPS刺激24 h后,收集细胞,用MTT比色法检测细胞的活力。6 h后收集细胞用Western blot检测细胞中NF-κB的含量,用ELISA法检测细胞上清中TNF-α、IL-6和IL-10的含量,同时用光密度法检测细胞上清中LDH的含量。结果: LPS可显著降低细胞的活力（P<0.05,P<0.01）,增加NF-κB的表达（P<0.01）,并显著增加细胞上清中TNF-α、IL-6、IL-10和LDH的含量（P<0.05,P<0.01）。而SDS则可以浓度依赖的方式对抗LPS所致细胞活力的减低、NF-κB含量的增加,使TNF-α、IL-6和LDH的含量明显减少,IL-10的含量明显增加;但不同浓度的SDS对正常细胞的上述指标没有影响。结论: SDS对LPS引起的细胞损伤具有对抗作用,其作用可能与其抑制炎症介质的释放有关。     

高三酰甘油血症对大鼠胰腺腺泡细胞的影响

目的研究高三酰甘油血症对大鼠胰腺腺泡细胞形态和功能的影响。方法断奶l周雄性SD大鼠（约70g）随机分为2组．每组10只．分别给予高脂饲料和普通饲料喂养4周。检测血清三酰甘油（TG）、胆固醇（TC）及游离脂肪酸（FFA）水平，HE染色和透射电镜观察胰腺腺泡细胞形态。胶原酶消化法分离大鼠胰腺腺泡细胞．台盼蓝染色测定细胞活力。给予不同浓度胆囊刺激素（CCK-8）刺激胰腺腺泡细胞分泌淀粉酶及乳酸脱氢酶（LDH）．测定酶释放率。结果高脂饮食饲喂大鼠4周后，血清TG、FFA较正常饮食组明显升高（P〈0．05）。高脂饮食组大鼠胰腺腺泡细胞出现空泡样改变及内质网扩张。体外培养6h后，高脂饮食组胰腺腺泡细胞活力低于对照组（P〈0．05），且各浓度CCK-8引起的淀粉酶和LDH释放均高于正常饮食组（P〈0．05）。结论饮食诱导的高三酰甘油血症可以引起大鼠胰腺腺泡细胞损伤。     

垦种2年后江滩残存钉螺组织化学与超微结构的变化

本文采用组织化学、酶组织化学及透射电镜技术观察了实行垦种2年的江滩残存钉螺和原始芦滩钉螺的软体组织。结果显示，实行垦种之江滩的残存钉螺糖原含量减少，琥珀酸脱氨酶（SDH）和乳酸脱氨酶（LDH）活性降低（P＜0.05）。肝腺管变化呈散在性分布，以棒状细胞明显；细胞表面微绒毛排列紊乱，萎缩或断裂，胞浆内出现空泡样变或固缩或呈溶解状态。提示垦种改变了江滩钉螺孳生环境，可使钉螺体内代谢发生障碍，能量枯竭，以致生存繁殖能力下降。     

新型植物灭螺剂HL对钉螺作用机制研究

目的通过观察新型植物灭螺剂HL对钉螺体内酶活性的影响,以期阐明HL类植物灭螺药物对钉螺的作用机理。方法将钉螺分别浸泡于25mg/L、50mg/L、100mg/L HL植物灭螺剂和去氯水中48h后,去壳、分离软体、置冰冻切片机切片,用酶组织化学方法显示乳酸脱氢酶(LDH)、琥珀酸脱氢酶(SDH)、乙酰胆碱酯酶(AChE)、细胞色素C氧化酶(CCo)和一氧化氮合酶(NOS),观察其变化,并采用显微图像分析系统,通过比较灰度值定量测定其活性。结果钉螺LDH、SDH、AChE、CCo和NOS定位于肌纤维、口囊、表膜、神经节、消化腺、咽管等部位酶活性随浸泡HL灭螺剂浓度的增大而酶活性减弱越明显,且与对照组有显著差异。结论HL的灭螺作用机制可能是由于破坏钉螺体内神经效应与信息分子传递,以及抑制能量供应,最终引起钉螺死亡。其作用机制与氯硝柳胺相似。     

氯硝柳胺悬浮剂对钉螺影响的酶组织化学观察

目的观察氯硝柳胺悬浮剂对钉螺体内酶活性的影响,以研究其杀螺机制。方法实验钉螺采集于江苏省镇江市丹徒区有螺江滩,分为2组:用药组钉螺采用25%氯硝柳胺悬浮剂,按2.0g/(L·m2)进行喷洒,对照组钉螺采用蒸馏水喷洒。钉螺去壳后分离出软体,置冰冻切片机切片,按常规进行细胞色素C氧化酶(CCO)、乳酸脱氢酶(LDH)、琥珀酸脱氢酶(SDH)、胆碱酯酶(CHE)和一氧化氮合酶(NOS)的酶组织化学染色、制片,显微镜下观察着色反应结果,采用显微图像分析系统定量测定并比较灰度值。结果用药组钉螺CCO、LDH、SDH、CHE和NOS定位口囊、肌纤、表膜、神经节、肝脏、咽管等部位的酶活性明显低于对照组。结论氯硝柳胺影响钉螺体内神经介质传递和能量供应障碍,导致钉螺的各项生理功能紊乱和丧失,是引起钉螺死亡的原因之一。     

基质对日本血吸虫培养细胞SDH和LDH影响的研究

目的　研究细胞外基质 (ECM)对日本血吸虫培养细胞琥珀酸脱氢酶 (SDH)和乳酸脱氢酶 (L DH)代谢活力的影响 ,筛选适合培养细胞存活、生长的生物基质。　方法　将虫龄 2 1d的日本血吸虫细胞接种于预先涂有肝、肺、鼠尾胶等不同生物基质的小盖玻片上常规培养 ,运用酶细胞化学方法 ,在培养第 3d进行 SDH染色 ,第 7d作 L DH染色 ,显微镜观察并拍照 ,图像分析仪测定其含量 ,并作统计分析。　结果　不同 ECM培养的细胞 ,其 SDH、 L DH活性不同 ,着色颗粒颜色按对照组、鼠尾胶组、肺基质组、肝基质组依次加深。定量分析结果显示 ,肝、肺基质组培养细胞 SDH含量与对照组差异显著 (P<0 .0 1) ,而鼠尾胶组与对照组差异不显著 (P>0 .0 5 )。各基质组培养细胞的 L DH含量与对照组比较 ,差异显著 (P<0 .0 1) ;各基质组之间两两比较差异亦具有显著性。肝基质组培养细胞内两种酶含量最高。　结论　肝基质最适合日本血吸虫培养细胞的存活与生长。     

正交试验法筛选日本血吸虫细胞的培养条件

目的　筛选日本血吸虫成虫细胞的培养条件及评价细胞培养条件优劣的指标。方法　以琥珀酸脱氢酶(SDH)、乳酸脱氢酶(L DH)和葡萄糖- 6 -磷酸脱氢酶(G- 6 - PDH )为指标,运用正交试验法进一步研究合成培养基、细胞外基质和血清浓度3个因素在3个不同水平对虫龄为2 1d的日本血吸虫细胞的影响。培养第5天对日本血吸虫培养细胞进行SDH染色;培养第14天分别进行L DH、G- 6 - PDH染色,Olympus- BH2 显微镜观察并拍照,HPIAS- 2 0 0 0图像分析仪测量其含量,用SPSS10 .0作统计分析。结果　不论以SDH或L DH,还是G- 6 - PDH为指标,均显示RPMI- 16 4 0含2 0 %小牛血清组成的培养基培养接种于肝基质上的日本血吸虫细胞,培养细胞的SDH、L DH、G- 6 -PDH活性最强。血清浓度对培养细胞酶活性的影响最大,其次是细胞外基质(ECM) ,影响最小的是合成培养基。其中,血清浓度对3种酶活性的影响差异均显著;基质对SDH、L DH活性的影响差异显著,而对G- 6 - PDH活性的影响差异不显著;合成培养基的影响均无差异。结论　RPMI- 16 4 0含2 0 %小牛血清组成的培养基培养接种于肝基质上的日本血吸虫细胞,培养细胞的SDH、L DH、G- 6 -PDH活性最强。选择3种酶中任一,均可用来评价日本血吸虫细胞培养条件的优劣。     

春季温度变化对钉螺酶活性的影响

目的 了解春季气候变暖影响钉螺活动性及繁殖能力的作用机理。方法 春季采集的钉螺放入不同温度的恒温培养箱,模拟外界气候变暖。用酶组织化学技术观察不同温度下钉螺中枢神经节、雌雄生殖腺中的一氧化氮合酶(NOS)、琥珀酸脱氢酶(SDH)、乳酸脱氢酶(LDH)及乙酰胆碱脂酶(AchE)的变化。结果 各酶的平均灰度值随着温度升高呈下降趋势。在神经节中25℃组NOS、SDH及AchE的平均灰度值明显低于对照组(P<0.01);25℃组卵集及搴丸组织NOS、SDH及LDH的平均灰度值显著低于对照组;各实验组神经节LDH的平均灰度值与对照组相比无显著性差异(P>0.01)。结论 春季温度变化对钉螺的NOS、SDH、LDH及Ache活性均产生明显影响,温度升高使这些酶活性增强,提高了钉螺的活动性及繁殖力,为进一步研究全球气候变化对血吸虫病传播的影响提供了理论基础。     

钉螺组织化学与酶组织化学的研究

采用组织化学和酶组织化学方法,定位观察了钉螺软体内糖原分布及7种酶活性部位。结果显示,糖原、SDH和LDH在各系统分布广泛,含量或活性均高。G-6-Pase仅在卵巢部活性较高;Mg~(++)-ATPase存在于肝、胃、生殖腺等器官;ALP以消化系活性较高;ACP在螺体内活性均较低;CHE主要在中枢神经节与神经干、肝、鳃及头足部软体上皮层处活性高。本文并对上述指标的生理意义进行了讨论。     

条件培养基对日本血吸虫童虫培养细胞LDH及AgNORs的影响

目的以乳酸脱氢酶(LDH)及核仁组织区相关嗜银蛋白(AgNORs)为评价指标,观察条件培养基对日本血吸虫童虫培养细胞的影响。方法灌注法获取21d虫龄的日本血吸虫虫体,冷消化法制备细胞悬液,调细胞为1×106个/ml,联合法接种细胞。将接种于小盖玻片上的血吸虫细胞随机分为对照(0h)组和24、48、72h3个实验组共4组。对照组用常规培养基即RPMI-1640含20%小牛血清附加常量抗生素(青霉素1×105U/L,链霉素100mg/L)培养,实验组培养基为常规培养基分别与培养24、48、72h的鼻咽癌细胞上清液的条件培养基1∶1的混合液。培养第7天,对培养细胞进行LDH及AgNORs染色;每组随机选取300个LDH染色细胞、50个AgNORs染色细胞输入HPIAS-2000图像分析仪测定培养细胞的吸光度(A)值,并作统计分析。结果日本血吸虫童虫细胞在不同条件培养基作用下,其LDH及AgNORs着色均比对照组深,其中72h组细胞着色最深,其次是48h组,再是24h组,对照组细胞着色最浅,条件培养基培养的各组细胞,LDH含量及AgNORsA值显著大于对照组细胞(q24=8.5287,q48=15.4253,q72=27.6207,P均0.01;q24=13.5690,q48=18.7288,q72=27.0356,P均0.01)。72h的条件培养基作用日本血吸虫童虫细胞后,培养细胞的LDH含量及AgNORsA值明显较对照组高(q0/72=27.6207,P0.01;q0/72=27.0356,P0.01),亦高于其他组(q24/72=19.0919,q48/72=11.8426,P均0.01;q24/72=13.5690,q48/72=18.7288,P均0.01)。结论条件培养基可明显增强日本血吸虫童虫培养细胞LDH的活性及增加AgNORs的含量,且72h的条件培养基对童虫培养细胞的影响最大。