HLA-G短干扰RNA真核表达载体的构建及其在JEG-3细胞株中抑制HLA-G表达的研究

目的:构建HLA-G短干扰RNA表达质粒及探讨HLA-G的功能。方法:根据siRNA设计的原则,结合pSilencer2.1-U6-neo质粒的特点,针对HLA-G基因设计并合成两对寡聚DNA片段,退火后将其克隆入pSilencer2.1-U6-neo,将重组真核表达质粒pSi-lencer2.1-U6-neo-HLA-G采用脂质体法转染JEG-3绒癌细胞株。应用RT-PCR、W estern-blot等方法检测转染的JEG-3细胞中HLA-G基因的表达水平;MTT法检测转染后JEG-3细胞增殖的变化。结果:RT-PCR和W estern-blot结果均表明瞬时转染重组pSilencer2.1-U6-neo-HLA-G质粒明显抑制了JEG-3细胞中HLA-G基因的表达。实验组JEG-3细胞生长较对照组明显受到抑制。结论:pSilencer2.1-U6-neo-HLA-G质粒构建成功,可下调JEG-3细胞中HLG的表达,抑制绒癌细胞生长。     

UHRF1基因在人卵巢癌细胞株OVCAR-3中的表达及意义

目的:探讨针对UHRF1基因的小干扰RNA(siRNA)转染人卵巢癌细胞株OVCAR-3后UHRF1表达的变化及细胞的增殖和凋亡,为UHRF1基因作为新的靶点治疗卵巢癌提供依据。方法:用siRNA基因沉默技术,将体外化学合成的针对UHRF1基因的siRNA转染至OVCAR-3细胞(转染组),并以转染阴性对照siRNA序列的细胞作为阴性对照组,未经转染的细胞作为空白组;实时荧光定量PCR和Western blot分别检测转染前后细胞UHRF1 mRNA和蛋白表达水平的变化;CCK-8实验和流式细胞术分别检测沉默UHRF1基因后对细胞增殖和凋亡的影响。结果:实时荧光定量PCR结果显示,siRNA转染后UHRF1基因在卵巢癌细胞株OVCAR-3中表达显著降低(P<0.01)。Western blot结果显示,转染组、阴性对照组和空白组细胞UHRF1蛋白相对表达量分别为0.16±0.04、0.33±0.03、0.35±0.07;转染组细胞UHRF1蛋白表达水平显著低于阴性对照组和空白组(P<0.05),而阴性对照组和空白组之间无显著差异(P>0.05)。CCK-8实验结果显示,转染后48,72,96h,转染组细胞增殖率均显著低于空白组(P<0.01)。流式细胞术结果显示,转染组、阴性对照组细胞凋亡率分别为(15.83±2.22)%、(7.46±2.93)%,差异显著(P<0.01)。结论:UHRF1基因沉默后可显著抑制卵巢癌OVCAR-3细胞UHRF1的表达,并抑制细胞增殖,促进细胞凋亡。     

加热对SKOV-3细胞HSP70表达、细胞增殖及热耐受的影响

目的:观察42℃温热对人卵巢癌SKOV-3细胞热耐受和热耐受预测因子(HSP70)表达的影响。方法:(1)四氮唑蓝(MTT)快速比色法测细胞增殖率;(2)免疫细胞化学法测定HSP70的表达。结果:(1)42℃首次加热对人卵巢癌细胞SKOV-3有抑制和杀伤作用,短时间内(48h内)重复加热细胞,细胞会出现生长加快,以间隔8h重复加热组细胞生长加快尤为明显;(2)42℃加热SKOV-3细胞100min后48h内测HSP70表达,有不同程度的增加,以加热后8h细胞内HSP70的表达最强,有时间依赖性。结论:42℃加热100min可诱导人卵巢癌SKOV-3细胞内HSP70高表达,使细胞产生热耐受性,其出现与消退有时间依赖性。     

HLA-G在卵巢癌异位表达的临床和生物学意义

人类白细胞抗原-G(human leukocyte antigen-G,HLA-G)由非经典HLA-I类基因编码,最初于母胎界面的绒毛膜外滋养层细胞上发现,并证实在胎儿免疫耐受中起重要作用。现研究发现,HLA-G在生理、病理情况下有组织特异性表达,在肿瘤免疫逃逸中HLA-G可能具有重要作用。HLA-G在卵巢肿瘤的表达对卵巢癌高危险患者的早期诊断、鉴别诊断、预后分析、治疗都具有潜在价值。     

紫杉醇耐药人卵巢癌细胞株中线粒体DNA基因突变的研究

目的:研究紫杉醇耐药的人卵巢癌细胞株SKOV3/Tax和OC3/Tax中线粒体DNA(mtDNA)突变。方法:提取细胞DNA,分析mtDNA突变,比较SKOV3/Tax和OC3/Tax与亲本敏感细胞SKOV3及OC3之间mtDNA突变数量和突变类型的差异。结果:紫杉醇耐药及敏感细胞mtDNA的突变热点依次是ND5基因、Cytb基因、ND4基因、CoⅡ基因及ND1基因;与敏感细胞株相比,耐药细胞株中mtDNA测序中发现更多的基因突变频率,主要表现为A→C,A→G,T→C,A→T,缺失A、C,插入T、C等,其中以缺失A最为明显。结论:人卵巢癌细胞株OC3及SKOV3中mtDNA编码区的ND5基因、Cytb基因、ND4基因和CoⅡ基因是具有高度突变性的区域,其与卵巢癌的发生、发展有重要关系。耐药细胞株中的突变明显高于敏感细胞株,推测突变的增加可能与卵巢癌耐药有关。     

HLA-G蛋白在人类着床前胚胎的表达

目的:探讨HLA-G在人类胚胎早期发育和免疫耐受中的作用和意义。方法:以体外受精-胚胎移植技术助孕过程中剩余的、自愿捐赠的人类早期胚胎作为研究对象,采用免疫荧光染色技术,检测人类着床前胚胎HLA-G蛋白的表达。结果:采用MEM-G/9单抗进行了HLA-G免疫荧光染色,20个2-8-细胞期的人类早期胚胎中15个胚胎HLA-G蛋白检测阳性;3个桑椹胚和5个囊胚均为阳性。结论:着床前人类早期胚胎表达HLA-G蛋白。     

绒毛膜癌细胞株JEG-3细胞中DLX4基因的表达

同源异型盒基因(homeobox genes，Hbx基因)是控制细胞分化和发育的一系列转录因子。DLX4基因是Hbx基因家族的成员之一，同其他Hbx基因功能类似，调节上皮和间充质细胞的相互作用，在胚胎发育中起重要的作用。近年来的研究发现，DLX4基因的表达异常与乳腺癌、结肠癌以及白血病的发生有关。本研究检测了DLX4基因在绒毛膜癌(绒癌)细胞株JEG-3细胞中的表达，以探讨其与绒癌发生的关系。     

顺铂与姜黄素联用抑制人卵巢癌细胞株3AO增殖作用的研究

目的:研究顺铂（cDDP）对姜黄素抑制人卵巢癌细胞株3AO增殖的影响。方法:采用MTT法计算细胞存活率,Giemsa染色观察细胞形态变化及细胞凋亡情况,用流式细胞术检测细胞周期变化及细胞凋亡率。结果:姜黄素可明显抑制3AO细胞的生长,其半数生长抑制率（IC_50）约为27.8μmol/L;姜黄素将肿瘤细胞聚集在S期和G2/M期并可诱导细胞凋亡。cDDP与各种浓度姜黄素联合可显著抑制3AO细胞增殖（P<0.01）。姜黄素和cDDP均可在一定程度上诱导细胞凋亡,两种药物联用后,诱导细胞凋亡作用显著增强。结论:姜黄素可与cDDP协同抑制人卵巢癌细胞株3AO的增殖。其协同作用的机制可能与诱导细胞凋亡有关。     

HLA-G蛋白在早孕绒毛及葡萄胎中的表达及意义

目的:探讨人类白细胞抗原G(HLA-G)蛋白在早孕绒毛和葡萄胎中的表达及意义。方法:应用免疫组化法检测30例早孕绒毛、20例葡萄胎和11例侵蚀性葡萄胎中HLA-G蛋白的表达情况。结果:①在早孕绒毛,HLA-G蛋白仅表达于绒毛外滋养层细胞,而在其他滋养层细胞则未见表达;②HLA-G蛋白在早孕绒毛、葡萄胎和侵蚀性葡萄胎中表达依次增强,三者比较,差异非常显著(P<0.001)。结论:HLA-G蛋白的表达可能与滋养细胞的侵袭行为有关,在滋养细胞肿瘤的侵袭中有一定作用。     

溶血磷脂酸受体在卵巢癌细胞系3AO、OVCAR3、SKOV3及卵巢癌组织中的表达

目的:研究溶血磷脂酸受体在人卵巢癌细胞系和人卵巢癌组织中蛋白的表达。方法:用免疫细胞化学和免疫组织化学法检测LPA1,LPA2和LPA3蛋白在人卵巢癌细胞系3AO、OVCAR3、SKOV3和人卵巢癌组织中的表达水平。结果:免疫细胞化学显示LPA1,LPA2和LPA3蛋白在人卵巢癌细胞系中均有表达;免疫组织化学显示LPA1蛋白在正常卵巢上皮和卵巢良性肿瘤中高表达,LPA2和LPA3蛋白在人卵巢癌组织中高表达。结论:LPA1,LPA2和LPA3在人卵巢癌细胞系和人卵巢癌组织中均有广泛表达;LPA2,LPA可能与卵巢癌的发生发展密切相关。     

hCG 促进绒癌细胞系中HLA-G的表达

目的 探讨hCG对绒癌细胞系中HLA-G的调节作用。方法 选用表达HLA-G的绒癌细胞系JEG-3，应用hCG(5IU／ml)连续处理此细胞系12、24、48、72h，用Real-time RT-PCR方法检测HLA-G的mRNA水平；通过Western杂交及流式细胞学测定HLA-G的蛋白水平。结果 hCG作用48和72h后可以显著上调HLA-G的mRNA及蛋白的表达。结论hCG在HLA-G的表达调节上具有重要的作用，高表达的hCG可能在绒癌中通过上调HLA-G参与免疫逃逸方面具有重要意义。     

卵巢癌拓扑替康耐药细胞株的建立及其生物学特性

目的 :建立卵巢癌拓扑替康 (TPT)耐药细胞株 ,研究其生物学特性。方法 :用浓度梯度递增法建立卵巢癌TPT耐药细胞株。用四甲基偶氮唑蓝 (MTT)比色法检测此耐药株对多种化疗药物的耐药指数 ;用细胞计数法描绘两株细胞的生长曲线并计算群体倍增时间 ;用流式细胞仪检测两株细胞的凋亡率及周期分布 ;荧光显微镜及透射电镜下观察亲本细胞、敏感细胞及耐药细胞的超微结构。结果 :历时 6个月建立了卵巢癌TPT耐药细胞株A2 780 /TPT。此细胞株对TPT及米托蒽醌 (MX)耐药 ,耐药指数分别为 2 5及 19,对喜树碱 (CPT)轻微耐药 ,耐药指数为 3,对其他多种化疗药物不交叉耐药。耐药细胞的生长速度比亲本细胞慢 (P <0 .0 5 ) ,且细胞凋亡率及G2 M期细胞比例较亲本细胞高 (P <0 .0 5 )。敏感细胞呈典型的凋亡形态特征 ,而耐药细胞凋亡核的数量明显减少 ,凋亡程度明显减轻 ,且仍有较多的细胞核形态正常。结论 :所建立的卵巢癌TPT耐药株具有耐药细胞的基本生物学特征 ,且该耐药模型稳定。     

RNA干扰技术沉默survivin基因逆转卵巢癌细胞株SKOV3/ADM耐药性的研究

目的检测survivin基因在卵巢上皮性癌(卵巢癌)耐药细胞株SKOV3/ADM及其亲本细胞株SKOV3中的表达水平,探讨以survivin基因为靶向的RNA干扰(RNA i)能否有效沉默survivin基因在SKOV3/ADM细胞中的表达,并能否有效逆转SKOV3/ADM细胞对化疗药物的耐药性。方法半定量RT-PCR、免疫荧光法检测survivin mRNA、蛋白在SKOV3/ADM及SKOV3细胞中的表达。以survivin基因为靶向的重组质粒pshRNA-survivin及紫杉醇作用于SKOV3/ADM细胞,将SKOV3/ADM细胞分为4组,即对照组、RNA i组、紫杉醇组、RNA i+紫杉醇组,RT-PCR技术检测各组细胞的survivinmRNA表达水平,吖啶橙/溴乙锭(AO/EB)荧光染色法及末端脱氧核苷酸转移酶介导的脱氧尿苷三磷酸标记法(TUNEL)检测各组细胞的凋亡情况。结果survivin mRNA在SKOV3/ADM、SKOV3细胞中的表达水平分别为99.1%、75.3%,SKOV3/ADM、SKOV3细胞的荧光细胞数分别为(59±5)、(42±3)个,两种细胞间比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。RNA i后SKOV3/ADM细胞中mRNA的表达水平由99.1%降低至7.9%。AO/EB荧光染色法、TUNEL法检测各组细胞凋亡数,紫杉醇组为(10.2±1.0)、(9.8±0.8)个,RNA i组为(48.5±4.9)、(49.5±4.3)个,RNA i+紫杉醇组为(71.5±6.8)、(68.3±5.7)个,RNA i+紫杉醇组与RNA i组比较,差异有统计学意义(P<0.05),RNA i+紫杉醇组与紫杉醇组比较,差异也有统计学意义(P<0.05)。结论survivin基因在SKOV3/ADM细胞中的表达显著高于SKOV3细胞。以survivin基因为靶向的RNA i可有效抑制SKOV3/ADM细胞中survivin基因的表达,有效增加了SKOV3/ADM细胞对化疗药物紫杉醇的敏感性,显著上调了SKOV3/ADM细胞的凋亡活性。     

顺铂诱导卵巢癌SKOV3细胞自噬和凋亡的研究

目的:研究顺铂诱导卵巢癌SKOV3细胞自噬和凋亡的发生情况,并探讨可能的发生机制。方法:顺铂干预卵巢癌SKOV3细胞后,用MDC染色荧光显微镜观察自噬囊泡及流式细胞仪检测自噬率;AnnexinV-FITC/PI双染色流式细胞仪检测凋亡率及TUNEL法检测凋亡指数;Western blot检测自噬蛋白Beclin1,LC3-Ⅱ和凋亡蛋白caspase9,caspase3的表达。结果:顺铂干预SKOV3细胞后,MDC阳性细胞数明显增多;自噬率提高(P<0.05);凋亡率提高(P<0.05);凋亡指数提高(P<0.05);自噬蛋白Beclin1,LC3-Ⅱ和凋亡蛋白caspase9,caspase3表达均增强(P<0.05)。结论:顺铂不仅可诱导卵巢癌SK-OV3细胞凋亡,而且可诱导卵巢癌SKOV3细胞自噬性死亡。     

纳秒级陡脉冲对人卵巢癌细胞SKOV3凋亡及细胞内Ca~(2+)浓度的影响

目的:观察纳秒级陡脉冲诱导人卵巢癌细胞SKOV3凋亡的作用及其对细胞内钙离子浓度[Ca2+]i的影响。方法:纳秒级陡脉冲场强10kV/cm,脉宽100ns,频率1Hz,作用5min。SKOV3细胞经纳秒级陡脉冲作用后4h,用透射电子显微镜,流式细胞术检测细胞凋亡。以Fluo-3/AM为细胞内钙离子的荧光指示剂,用激光扫描共聚焦显微镜检测纳秒级陡脉冲对SKOV3细胞[Ca2+]i的影响及[Ca2+]i变化时Ca2+的来源。结果:透射电子显微镜观察到典型的凋亡细胞形态。流式细胞术结果显示,纳秒级陡脉冲主要诱导细胞早期凋亡,早期凋亡率为(22.21±2.71)%,明显高于对照组的(3.04±0.44)%(P<0.01)。纳秒级陡脉冲可明显升高细胞[Ca2+]i(P<0.01),而与细胞外钙离子浓度无关(P>0.05)。结论:纳秒级陡脉冲能够诱导SKOV3细胞凋亡。细胞内钙释放引起钙离子升高,可能是纳秒级陡脉冲诱导肿瘤细胞凋亡的机制之一。     

CO_2对人卵巢癌细胞SKOV3转移因子表达的影响

目的:探讨二氧化碳(CO_2)对卵巢恶性肿瘤细胞转移能力的影响。方法:体外培养人卵巢浆液性乳头状腺癌SKOV3细胞株,分为CO_2组、N_2组和对照组,分别在CO_2及N_2处理后2h,置于常规条件下培养12、24、48h通过RT-PCR和Western Blot检测不同时相血管内皮生长因子C(VEGF-C)和基质金属蛋白酶9(MMP9)的表达。结果:CO_2处理后,SKOV3细胞VEGF-C和MMP9的mRNA和蛋白质表达显著增加(P＜0．05);N_2处理后,SKOV3细胞VEGF-C和MMP9的mRNA和蛋白质表达较对照组增加(P＜0．05)。结论:CO_2促进了SKOV3 VEGF-C和MMP9的表达,对SKOV3的转移能力有增强作用。     

重组人肿瘤坏死因子对卵巢癌AO细胞C－erbB－2表达和形态学的影响

用流式细胞仪和电镜技术检测了用重组人肿瘤坏死因子（ｒｈＴＮＦ）处理前后人卵巢癌ＡＯ细胞Ｃ－ｅｒｂＢ－２的表达和形态学改变。结果表明，经ｒｈＴＮＦ处理的ＡＯ细胞培养４８ｈ后，细胞Ｃ－ｅｒｂＢ－２表达强度下降，形态发生变化。提示ｒｈＴＮＦ具有低调节人卵巢癌ＡＯ细胞ｃ－ｅｒｂＢ－２表达的作用。     

人卵巢上皮性癌顺铂耐药细胞系3AO/cDDP模型的建立及耐药机理的实验研究

目的：模拟临床卵巢上皮性癌化疗的用药特点建立顺铂耐药细胞系3AO／CDDP,检测LRP、MRP、P－gp、GSTπ和TopeⅡ表达。方法：以临床卵巢上皮性癌化疗用药的最低剂量换算终浓度,采用大剂量顺铂（10μg／ml）反复间歇24h暴露法建立顺铂耐药细胞系;用FCM法检测LRP、MRP、P－gp、GSTπ和TopoⅡ表达。结果：历时4．5个月建成顺铂耐药株3AO／cDDP,耐药性稳定,耐药指数1．62,与临床耐药倍数相近。3AO／cDDP细胞MRP、P－gp表达与3AO相比无明显变化（P＞0．05）,LPR、GSTπ表达明显升高（P＜0．005及P＜0．05）,Tope-Ⅱ含量明显降低（P＜0．05）。结论：3A0／cDDP是模拟临床用药特点建立的、研究顺铂耐药的理想模型;顺铂耐药与LRP、GSTπ表达升高及TopoⅡ含量降低有关,与MRP、P-gp无关。