S1P/S1PR对人卵巢癌SKOV3细胞的促血管生成作用的研究

目的:探究鞘氨醇-1-磷酸/鞘氨醇-1-磷酸受体(S1P/S1PR)对人卵巢癌SKOV3细胞促血管生成作用的影响和机制。方法:管腔形成实验探究S1P对人卵巢癌SKOV3细胞的促血管生成作用的影响;实时定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)检测S1P处理后的人卵巢癌SKOV3细胞中血管生成因子白细胞介素8(IL-8)、IL-6、血管内皮生长因子(VEGF)的变化情况;设计合成小干扰RNA(siRNA)干扰序列基因沉默SKOV3细胞中S1PR1、S1PR2和S1PR3的表达,蛋白质印迹(Western-blot)和qRT-PCR检测SKOV3细胞中S1PR的下调结果;qRT-PCR检测S1PR对SKOV3细胞IL-8、IL-6、VEGF表达的影响。结果:管腔形成实验结果显示,S1P处理后的SKOV3细胞培养上清液重悬人脐静脉内皮细胞融合细胞(EA.hy926),其管腔形成的数量多于对照组(t=3.667,P=0.021),表明S1P促进了人卵巢癌细胞SKOV3的促血管形成能力。S1P处理后的SKOV3细胞中血管生成因子IL-8、IL-6、VEGF mRNA的表达水平较对照组升高,差异有统计学意义(均P0.05)。S1PR1和S1PR3基因沉默可显著降低SKOV3细胞中IL-8、IL-6、VEGF的mRNA表达水平,差异有统计学意义(均P0.05),而S1PR2基因沉默后IL-8、IL-6、VEGF的mRNA变化不明显。结论:S1P通过S1PR1/3上调人卵巢癌SKOV3细胞中IL-8、IL-6、VEGF的表达,从而增强了SKOV3细胞的促血管生成作用,S1P/S1PR通路有望成为抑制卵巢癌生长的治疗新靶点。     

S1PR1/3在卵巢癌组织中的表达及其与微血管密度的关系

目的:研究鞘氨醇-1-磷酸受体1/3(S1PR1/3)在卵巢癌组织中的表达,探讨S1PR1/3与卵巢癌微血管密度(MVD)的关系及临床意义。方法:选取2012~2015年于上海交通大学医学院附属仁济医院行手术治疗的患者的卵巢肿瘤石蜡标本,其中上皮性卵巢癌51例,良性卵巢肿瘤16例。免疫组化法检测卵巢肿瘤组织中S1PR1、S1PR3、CD34蛋白表达,根据CD34染色计算卵巢癌组织微血管密度(MVD)。采用Pearson相关性分析卵巢癌S1PR1/3表达与MVD的相关性。结果:卵巢癌组织中S1PR1、S1PR3表达和MVD均显著高于良性卵巢肿瘤组织,差异均有统计学意义(P=0.032,P=0.014,P=0.000)。卵巢癌组织中S1PR1表达与FIGO分期、病理级别、有无淋巴结转移及有无远处转移有关(P0.05);S1PR3表达与FIGO分期、病理级别有关(P0.01)。卵巢癌组织中,S1PR1和S1PR3高表达组的MVD均显著升高,差异有统计学意义(P=0.005,P=0.012)。MVD与S1PR1和S1PR3表达分别呈显著正相关(r=0.473,P=0.000;r=0.358,P=0.010)。结论:卵巢癌组织中S1PR1/3高表达,并且与肿瘤微血管形成具有重要联系,S1PR1/3有望成为判断卵巢癌预后的新指标,并为抗肿瘤治疗提供了新方向。     

鞘氨醇-1-磷酸与卵巢癌的研究进展

鞘氨醇-1-磷酸（S1P）是鞘磷脂代谢产生的一种生物活性脂类,在多种癌症中对肿瘤具有促进作用。细胞内S1P生成由鞘氨醇激酶（SphKs）等调控,与相应受体（S1PR）结合发挥生物学效应。近年来涉及S1P与卵巢癌相关的研究提示卵巢癌患者中S1P呈高表达状态,其可以通过参与促进卵巢癌细胞的增殖和转移、抑制肿瘤细胞凋亡、诱导新生血管形成以及改变肿瘤免疫微环境状态等多种方式调节肿瘤细胞生物学行为,促进卵巢癌的发生和发展。阻断S1P信号传导途径中关键蛋白（包括S1P、SphK1、S1PR等）的相关药物能够抑制卵巢癌细胞生长及诱导细胞凋亡。因此,S1P相关途径可能成为卵巢癌治疗的潜在分子目标。本文简要综述了S1P信号通路在卵巢癌中的生理功能及相关药物研究进展。     

慢病毒介导的EZH2靶向RNA干扰对人卵巢癌SKOV3细胞增殖的影响

目的:通过慢病毒介导的EZH2-shRNA干扰载体,沉默人卵巢癌SKOV3细胞中果蝇zeste基因的人类同源物(EZH2)的表达,探讨靶基因EZH2对卵巢癌细胞增殖的影响。方法:设计含EZH2基因序列的shRNA慢病毒干扰载体,转染人卵巢癌SKOV3细胞株;利用CCK-8比色法检测EZH2基因沉默后对SKOV3细胞增殖的影响;利用RT-PCR、Western blot分别检测EZH2、PCNA mRNA及蛋白的表达情况。结果:EZH2-shRNA载体感染SKOV3细胞后,可显著抑制SKOV3细胞生长(P<0.05),并下调EZH2、PCNA mRNA和蛋白的表达(P均<0.05),而在空白对照组和空载体转染组中,无抑制作用。结论:沉默EZH2基因可抑制人卵巢癌SKOV3细胞增殖,可能是一种新的基因治疗方法。     

VEGF和SDF-1/CXCR4在促进卵巢癌细胞侵袭与增殖中的相关作用

目的:研究血管内皮生长因子(VEGF)和趋化因子受体(Cys-X-Cysreceptor4,CXCR4)/配体基质细胞衍生因子-1(stromalcell-derivedfactor1,SDF-1)在卵巢上皮性癌细胞中的表达及其在促进卵巢癌细胞侵袭和增殖中的相关作用,进而探讨SDF-1/CX-CR4信号参与卵巢癌发生发展的相关机制。方法:(1)用Real-timeRT-PCR检测卵巢癌细胞株SKOV3中VEGF及其单克隆抗体anti-VEGF作用前后SDF-1/CXCR4mRNA表达水平的变化;(2)通过transwell小室体外侵袭实验检测VEGF和SDF-1以及anti-VEGF和CXCR4特异性抗体(AMD3100)对SKOV3细胞趋化活性的影响;(3)用MTT法测定VEGF和SDF-1以及anti-VEGF和AMD3100作用前后SKOV3细胞增殖率的变化。结果:(1)VEGF可以上调SDF-1和CXCR4的表达且有明显的剂量依赖性。(2)VEGF和SDF-1均有促进卵巢癌细胞侵袭的作用。VEGF的促侵袭作用具有一定的剂量依赖性且可以被40μg/mlanti-VEGF阻断,SDF-1的作用没有明显剂量依赖性;CXCR4的特异性受体抑制剂AMD3100有阻断VEGF和SDF-1的促侵袭作用。(3)VEGF和SDF-1均有促进卵巢癌细胞增殖的作用。VEGF的作用具有剂量依赖性,其效应可被anti-VEGF阻断,但不被AMD3100阻断,SDF-1的促增殖作用无明显剂量依赖性,其效应可被AMD3100阻断。结论:VEGF和SDF-1对卵巢癌细胞的侵袭和增殖有直接促进作用,并且VEGF可以上调SDF-1/CXCR4的表达。两者与卵巢癌的发生和生物学行为关系密切并协同促进卵巢癌细胞的转移。     

脱氧寡核苷酸对卵巢癌细胞核转录因子-κB活性和下游细胞分子表达的影响

目的 探讨核转录因子(NF)-κB诱捕物脱氧寡核苷酸(ODN)对人卵巢癌细胞株SKOV3细胞NF-κB活性和下游细胞分子如细胞间黏附分子1(ICAM-1)、血管内皮生长因子(VEGF)、尿激酶型纤溶酶原激活剂(uPA)表达的影响。方法 SKOV3细胞转染NF-κB诱捕物ODN后,用白细胞介素113(IL-1β)刺激6、12、24、48 h,采用凝胶电泳滞后实验测定NF-κB DNA结合活性,采用RT-PCR技术检测ICAM-1、VEGF、uPA mRNA表达水平,采用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测VEGF蛋白表达水平。结果 (1)SKOV3细胞表达NF—κB DNA结合活性,IL-1β刺激后其活性上升,在转染NF—κB诱捕物ODN后SKOV3细胞NF-κB DNA结合活性被显著抑制,刺激6、12、24、48 h的抑制率分别为99.6％、86.4％、80.1％、21.6％。各时间点间比较,差异均有显著性(P<0.05～0.01)。(2)SKOV3细胞表达ICAM-1、VEGF、uPA mRNA和VEGF蛋白,IL-1β刺激后其表达率上升,转染NF-κB诱捕物ODN后其表达率下降。结论NF—κB诱捕物ODN转染SKOV3细胞后可能通过抑制NF-κB活性,从而抑制ICAM-1、VEGF、uPA的表达。NF—κB诱捕物ODN有望应用于卵巢癌的基因治疗。     

人重组IFN-γ对STAT-1在卵巢癌细胞中表达调控的研究

目的:研究IFN-γ对卵巢癌耐药细胞株SKOV3TS及敏感细胞株SKOV3中STAT-1表达的调控。方法:应用RT-PCR方法、细胞免疫荧光法检测SKOV3TS与SKOV3在IFN-γ作用前后STAT-1 mRNA及蛋白的表达。用MTT法检测不同浓度IFN-γ作用卵巢癌细胞株不同时间后对细胞增殖率的影响。结果:卵巢癌SKOV3TS、SKOV3细胞株均有STAT-1表达,且主要集中于胞浆。并且随着IFN-γ作用时间延长,STAT-1蛋白表达增强。IFN-γ作用两种细胞株24h及48h后STAT-1 mRNA表达均增加,且差异有统计学意义(P0.01),但不同浓度IFN-γ作用相同时间后STAT-1 mRNA表达差异无统计学意义(P0.05)。IFN-γ可显著抑制SKOV3TS和SKOV3细胞增殖,也呈时间依赖性(P0.01)。IFN-γ对SKOV3组的抑制率较SKOV3TS组高(P0.05)。结论:IFN-γ能够促进STAT-1表达,抑制卵巢癌细胞增殖。     

脂质体转染白介素-12基因至卵巢癌SKOV3细胞检测VEGF表达及抗肿瘤作用探讨

目的:观察含mIL-12基因的质粒转染至SKOV3卵巢癌细胞,效应细胞存在情况下对卵巢癌细胞株血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响。方法:用脂质体转染技术将基因质粒及空质粒转染至SKOV3卵巢癌细胞(SKOV3/IL-12)及SKOV3/neo;用ELISA法检测IL-12及INF-γ的表达;用逆转录聚合酶联反应(RT-PCR)半定量法测定SKOV3/IL-12+S(脾细胞)0,12,24,36,48,60hVEGFmRNA含量;用ELISA法测定细胞培养上清液中VEGF蛋白含量及其抑制率。结果:基因转染至SKOV3可检测到IL-12蛋白表达;分泌的IL-12蛋白具有活性,使脾细胞产生INF-γ,12h时迅速出现,作用后24h表达量最高;SKOV3/IL-12细胞与脾细胞作用12h后即出现VEGFmRNA表达抑制,24h达到高峰,与对照组有显著差异(P0.05);培养24h后上清中VEGF蛋白含量减少,与对照组有显著差异(P0.05)。结论:将IL-12基因转染至SKOV3卵巢癌细胞并表达IL-12;分泌的IL-12蛋白具有活性,使脾细胞产生INF-γ;SKOV3/IL-12与效应细胞脾细胞作用后产生INF-γ能在核酸水平下调VEGF并能抑制VEGF蛋白的表达。     

丹参酮ⅡA诱导人卵巢癌SKOV3细胞凋亡及机制的研究

目的：观察中药丹参有效提取成分之一丹参酮ⅡA（TanⅡA）对人卵巢癌细胞株SKOV3的增殖和凋亡的诱导作用,及对基质金属蛋白酶-2（MMP-2）和血管内皮生长因子（VEGF）表达的影响,探讨其可能的抗肿瘤作用机制。方法：体外培养卵巢癌SKOV3细胞,随机分组,实验组给予不同浓度TanⅡA处理细胞,倒置显微镜及四甲基偶氮唑盐（MTT）比色法观察实验组与对照组细胞增殖抑制情况;流式细胞术检测凋亡率及细胞周期变化;免疫荧光细胞化学法检测细胞MMP-2、VEGF蛋白表达改变;实时荧光定量聚合酶链反应（RT-PCR）检测MMP-2、VEGFmRNA表达水平。结果：TanⅡA对人卵巢癌SKOV3细胞的增殖具有抑制作用,呈时间-剂量依赖性;实验组较对照组G0/G1期细胞数量增多,而S期细胞数量减少;MMP-2、VEGF蛋白表达及基因表达明显下调,与对照组相比差异有统计学意义（P〈0.05）。结论：TanⅡA对卵巢癌SKOV3细胞有明显的增殖抑制及诱导凋亡作用;TanⅡA可下调细胞MMP-2、VEGF的表达,这可能是其抗肿瘤作用机制之一。     

ERCC1基因与卵巢上皮癌细胞铂类耐药相关性探讨

目的 检测切除修复交叉互补1（ERCC1）基因在人卵巢上皮癌顺铂(DDP)耐药细胞株SKOV3／DDP及其亲本细胞株SKOV3中的表达,探讨ERCC1基因在卵巢上皮癌顺铂耐药中的意义以及有效沉默ERCC1基因能否有效逆转SKOV3／DDP细胞对DDP耐药。方法 于2013-2014年在南方医科大学采用实时荧光定量PCR(RT-PCR)和Western印迹法检测 ERCC1 mRNA和蛋白在SKOV3／DDP及SKOV3细胞中的表达。人工构建3个靶向沉默ERCC1基因的短发夹状RNA(shRNA)质粒表达载体,慢病毒载体法转染至SKOV3／DDP细胞,RT-PCR和Western印迹法检测ERCC1基因水平并挑选沉默效果最佳的表达载体。RT-PCR和Western印迹法检测稳定转染后SKOV3／DDP细胞中ERCC1基因的表达,CCK-8法检测转染细胞对DDP的耐药性。结果 SKOV3／DDP细胞中ERCC1 mRNA和蛋白的表达量明显高于SKOV3,差异有统计学意义(P<0.01)。稳定转染ERCC1 shRNA后的SKOV3／DDP细胞,ERCC1的mRNA及蛋白的表达量明显下降,差异有统计学意义(P<0.01)。细胞活性检测提示特异性沉默ERCC1基因能增加SKOV3/DDP 细胞对顺铂的敏感性(P<0.05)。结论 ERCC1基因在SKOV3／DDP细胞中的表达明显升高,有效沉默ERCC1 基因能有效逆转SKOV3/DDP细胞对DDP耐药,增加卵巢上皮癌DDP耐药细胞对DDP的敏感性,为卵巢上皮癌耐药的治疗提供新靶点。     

肿瘤相关成纤维细胞高表达Twist1增强卵巢癌侵袭能力

目的:检测肿瘤相关成纤维细胞Twist1基因表达,探讨肿瘤相关成纤维细胞高表达Twist1对卵巢癌侵袭能力的影响。方法:CSIOVDB数据库检索Twist1基因在卵巢各种组织类型中的表达水平。分离原代正常成纤维细胞(NOF),以及卵巢癌患者的原代肿瘤相关成纤维细胞(CAF),免疫荧光实验验证Twist1基因在NOF和卵巢癌CAF细胞中的表达差异。TCGA数据库489例卵巢癌中从mRNA水平验证Twist1与CAF经典活化指标FAP的相关性,以及炎症因子IL-6的相关性。GSEA(Gene Set Enrichment Analysis)软件探究CAF高表达Twist1与IL-6通路富集的关系。Western blot法验证下调Twist1基因对IL-6表达的影响。Transwell实验探究卵巢癌CAF-肿瘤细胞共培养体系中IL-6对卵巢癌细胞系SKOV3侵袭能力的影响。结果:Twist1基因在卵巢癌CAF中的表达水平明显高于肿瘤细胞和正常成纤维细胞。TCGA数据库中Twist1基因和FAP及IL-6基因呈显著正相关(P0.0001)。GSEA软件分析结果示,卵巢癌患者中CAF高表达Twist1的同时,肿瘤上皮表现为IL-6通路明显富集(P0.05,FDR25%)。Western blot法结果表明,Twist1基因下调后,IL-6基因表达量明显降低。在共培养体系中加IL-6中和抗体,卵巢癌细胞侵袭力明显下降。结论:肿瘤相关成纤维细胞高表达Twist1,可能通过提高IL-6水平增强卵巢癌侵袭能力。     

Lysophospholipids increase interleukin-8 expression in ovarian cancer cells

OBJECTIVES: We have previously described that bioactive lysophospholipids-lysophosphatidic acid (LPA), sphingosine 1-phosphate (S1P), and sphingosylphosphorylcholine (SPC)-are present in ascitic fluids from patients with ovarian cancer. To understand the role of these lipids in ovarian cancer, we investigated the effects of these lipids on interleukin-8 (IL-8) production in ovarian cancer cells. IL-8 is a proinflammatory and proangiogenic factor, which is potentially involved in ovarian cancer development. METHODS: The Clontech PCR-Select cDNA subtraction method (Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, CA) was used to identify genes potentially regulated by LPA in HEY and OCC1 ovarian cancer cell lines. Northern blot analysis was used to confirm and examine IL-8 mRNA regulation by lysolipids. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was used for detecting secreted IL-8. RESULTS: We describe here that LPA, S1P, and SPC increased mRNA levels (2- to 7-fold) and protein secretion (2- to 12-fold) of IL-8 from ovarian cancer cells (HEY, OCC1, and SKOV3) in vitro. These regulations were both dose- and time-dependent. All three lipids increased the stability IL-8 mRNA in HEY cells. In contrast to malignant ovarian cancer cells, immortalized human ovarian epithelial cells did not respond to any of these lipids to increase the secretion of IL-8, although these cells secreted similar basal levels of IL-8 (310 pg/ml/10,000 cells). Two breast cancer cell lines (MCF7 and T47D) secreted lower basal levels of IL-8 (48-80 pg/ml/10,000 cells), compared with ovarian cancer cells (200-500 pg/ml/10,000 cells). MCF7 cells responded to LPA, but not S1P and SPC, by increasing the secretion of IL-8. T47D and MCF10A, an immortalized breast cell line, did not respond to LPA, S1P, or SPC to increase IL-8 secretion. CONCLUSIONS: LPA, S1P, and SPC regulate the mRNA and protein levels of the proinflammatory and proangiogenic factor IL-8 in ovarian cancer cells. The pathological significance of these regulations in ovarian cancer remains to be further investigated.     

微小RNA-3619-5p通过靶向作用于p21基因对卵巢癌细胞生长的影响

目的:探讨微小RNA-3619-5p(miR-3619-5p)过表达对卵巢癌细胞系A2780和SKOV3中p21基因的上调作用及对卵巢癌细胞生长的影响。方法:使用Lipofectamine 3000分别向卵巢癌细胞系A2780和SKOV3瞬时转染miR-3619-5p(实验组)或者dsControl(对照组)。通过实时荧光定量聚合酶链反应(q RT-PCR)检测p21、细胞周期依赖性激酶4(CDK4)和细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)mRNA的表达情况。蛋白质印迹(Western blotting)检测p21、CDK4和Cyclin D1蛋白的表达情况。流式细胞术检测对照组和实验组细胞周期分布差异和细胞凋亡情况。EdU增殖实验和集落形成实验检测细胞增殖能力。结果:与对照组相比,转染miR-3619-5p后2种细胞系中p21 mRNA均显著升高(P0.01),而CDK4和Cyclin D1 mRNA的表达均明显降低(P0.01)。Western blotting实验结果与qRT-PCR结果一致。与对照组相比,转染miR-3619-5p后,位于S期和G_2/M期的细胞比例明显下降,位于G_0/G_1期的细胞比例明显增大,细胞凋亡率明显升高。EdU增殖实验和集落形成实验均显示,与对照组相比,转染miR-3619-5p的卵巢癌细胞的增殖能力明显下降(P0.05)。结论:miR-3619-5p可通过激活卵巢癌细胞中p21蛋白的表达抑制卵巢癌细胞的生长。     

抗血管内皮生长因子发夹状核酶基因抑制卵巢癌移植瘤生长的实验研究

目的 采用抗血管内皮生长因子（VEGF）发夹状核酶基因,阻断卵巢癌中VEGF的自分泌和（或）旁分泌通路,以检测抗VEGF发夹状核酶基因对卵巢癌细胞VEGF表达及其肿瘤生长的影响。方法 采用脂质体介导的方法,将自行设计和构建的抗VEGF发夹状核酶基因真核表达载体转染人卵巢癌细胞SKOV3,采用氨基糖甙庆大霉素（G418）筛选获得阳性克隆;RNA斑点杂交检测核酶基因在卵巢癌细胞中的表达;逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）技术检测转染前后卵巢癌细胞中VEGF的表达;透射电子显微镜观察卵巢癌细胞超微结构改变;观察裸鼠皮下成瘤实验检测转染前后细胞的致瘤能力的变化。结果 转染核酶基因后的卵巢癌细胞VEGFmRNA表达明显降低;透射电子显微镜观察出现凋亡细胞;裸鼠致瘤能力减弱,肿瘤组织中VEGF表达及血管形成减少。结论 抗VEGF发夹状核酶基因可显著抑制卵巢癌细胞VEGF表达,通过减少血管形成抑制肿瘤生长,为进一步开展肿瘤血管靶向基因治疗,提供了实验依据。     

罗格列酮对人卵巢癌SKOV3细胞中PPARγ和β-catenin表达的影响

目的：研究过氧化物酶体增殖物激活受体γ（peroxisome proliferators activated re-ceptorgamma，PPARγ）的特异性配体罗格列酮对人卵巢癌SKOV3细胞中PPAγ和β-catenin表达的影响，并探讨其机制。方法：设立对照组和实验组，采用荧光定量RT-PCR技术和免疫细胞化学方法检测干预前后细胞中PPARγ、β-catenin mRNA和蛋白水平的变化。结果：免疫细胞化学和荧光定量RT-PCR结果显示：SKOV3细胞表达PPARγ，罗格列酮作用于SKOV3细胞24h后PPARγ mRNA和蛋白表达水平上调，而β-cateninmRNA和蛋白表达水平下调。结论：罗格列酮通过活化PPARγ，下调β-catenin mRNA和蛋白表达水平，从分子水平上揭示PPARγ可能是基因治疗卵巢癌的理想靶点。