阳春砂萜类合酶AvTPS1启动子的克隆及其活性分析

目的获得药用植物阳春砂Amomumvillousm的萜类合酶基因Av TPS1的启动子并进行活性分析。方法从阳春砂叶片基因组DNA(g DNA)中克隆获得Av TPS1基因,再通过FPNI-PCR的方法从阳春砂叶片g DNA中克隆Av TPS1的启动子并进行序列分析,构建由该启动子驱动β-葡萄糖苷酸酶基因(GUS)的重组表达载体p CAM-Av TPS1p,利用农杆菌介导法注射侵染烟草Nicotianabenthamiana叶片进行瞬时表达来验证Av TPS1启动子的活性。结果获得Av TPS1的g DNA序列长度为2444 bp,经过序列比对发现Av TPS1含有7个外显子和6个内含子;通过FPNI-PCR成功获得568bp的Av TPS1启动子序列,其含有10种顺式作用元件,包括保守元件TATA-box和CAAT-box,以及可被转录因子MYC结合的G-box等;通过GUS染色发现Av TPS1启动子启动了GUS基因的表达,使转基因烟草叶片呈现蓝色。结论 Av TPS1启动子被成功克隆,且通过实验验证其具有启动基因表达的功能,为进一步研究Av TPS1在萜类合成途径的功能及其受转录因子调节的机制奠定了基础。     

阳春砂龙脑基二磷酸合酶关键氨基酸位点筛选及突变体的构建

目的 对阳春砂萜类合成关键酶龙脑基二磷酸合酶(bornyl diphosphate synthase,BPPS)催化生成龙脑基二磷酸(bornyl diphosphate,BPP)的关键氨基酸位点解析,为阳春砂BPPS的功能优化并且促进其在代谢工程中的应用奠定基础.方法 比较阳春砂、海南砂的BPPS (AvBPPS、A...     

茉莉酸甲酯影响阳春砂挥发性萜类代谢和基因转录

目的：研究茉莉酸甲酯对阳春砂挥发性萜类合成的影响,深入了解挥发性萜类生物合成的分子调控机制。方法：用不同浓度茉莉酸甲酯溶液喷施阳春砂的叶片和果实,用微波法提取果实中的挥发性萜类成分,应用气相色谱-质谱（GC-MS）联用技术检测挥发性萜类成分的变化,通过转录组测序构建cD－NA 文库并进行生物信息学分析。结果：果皮和种子团中分别检测到20 种和33 种挥发性萜类成分,600μmol?L-1 MeJA 喷果24 h 后果皮和种子团中大部分挥发性萜类成分的积累量明显增加,如乙酸龙脑酯、樟脑和龙脑等;而200μmol?L-1 MeJA 喷施叶片或果实对果皮及种子团中不同挥发性萜类含量的影响存在差异,且200μmol?L-1 MeJA 喷施果实比喷施叶片更能提高种子团中挥发性萜类成分的积累量。此外,转 录组测序共获得68 168 个Unigene,通过与公共数据库比对,共有48 627 个Unigene 获得注释。对KEGG代谢通路的注释结果进行初步分析,发现挥发性萜类代谢密切相关的Unigene 有208 个,MYC2 类转录因子（JA 信号转导的重要调控因子）相关的Unigene 有22 个。结论：MeJA 能有效调控阳春砂中挥发性萜类成分的代谢,转录组测序获得了多个与挥发性萜类合成相关的候选基因,为深入开展阳春砂挥发性萜类生物合成相关功能基因的发掘及调控研究提供了丰富的数据资源。     

刺五加MDD基因启动子的克隆与生物信息学分析

目的克隆并分析刺五加甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶(mevalonate diphosphate decarboxylase,MDD)基因的启动子序列。方法根据刺五加MDD基因的c DNA序列,采用PCR扩增和热不对称交错PCR(TAIL-PCR)技术,克隆MDD基因5’端的DNA序列及启动子序列。利用Plant CARE等软件对其进行生物信息学分析。结果克隆得到长1 423 bp的刺五加MDD基因启动子序列及长1 024 bp的5’端DNA序列。该启动子序列含有49个TATA-box、25个CAAT-box。还含有脱落酸响应元件、茉莉酸甲酯响应元件、胚乳表达必须顺式作用元件、干旱胁迫响应元件、光响应元件等多种顺式作用元件,以及2个MYBHv1与2个MBY结合位点。结论首次克隆并分析了刺五加MDD基因的启动子序列,为该基因的表达调控奠定了基础。     

艾bZIP基因家族全基因组鉴定及萜类合成调控基因筛选北大核心CSCD

艾是我国重要的药用植物和经济作物,具有温经散寒、止痛、抗炎、抗过敏等功效。艾叶精油富含挥发性萜类化合物,广泛应用于艾灸及保健品中,市场开发潜力巨大。bZIP转录因子家族在植物中数量众多,广泛参与植物生长发育、胁迫应答和萜类等次生代谢产物合成调控,但艾bZIP家族及其功能鲜有报道。该研究基于艾基因组系统鉴定bZIP家族转录因子,分析其蛋白理化性质、进化关系、保守基序和启动子顺式作用元件等特性,并筛选可能参与萜类合成调控的候选基因。结果显示:从基因组水平共鉴定到156个AarbZIP转录因子,其编码氨基酸为99~618 aa,相对分子质量为11.7~67.8 kDa,理论等电点为4.56~10.16。根据拟南芥bZIP家族分类,AarbZIP蛋白分为12个亚族,同一亚族蛋白具有相似的保守基序。启动子顺式作用元件分析表明AarbZIP家族与光和激素响应密切相关。同源性比对和系统发育分析共筛选出5个可能参与萜类合成调控的AarbZIP基因。qRT-PCR结果表明5个候选AarbZIP基因在艾不同组织中表达存在显著差异,其中AarbZIP29和AarbZIP55在叶片中表达量最高,AarbZIP81、AarbZIP130、AarbZIP150在花蕾中表达量最高。该研究为艾bZIP家族基因的功能研究及其在艾萜类合成中的调控作用解析奠定基础。     

MicroRNA调控药用植物萜类生物合成研究进展

萜类化合物是药用植物中一类重要的次生代谢产物,对癌症、心血管疾病、疟疾和阿尔茨海默病等多种疾病有效。微RNA (microRNA,miRNA)是一种非编码单链小分子RNA,在转录后水平通过降解目标mRNA或阻断翻译发挥作用。miRNA可以通过作用于萜类生物合成途径的结构基因或转录因子调控药用植物萜类的生物合成。目前,萜类生物合成途径的上游部分研究比较清楚,很多关键酶的编码基因已经被克隆,有的酶分子的空间结构也已被解析,针对参与基因表达调控的转录因子也有一些研究,但对非编码RNA,特别是miRNA参与萜类生物合成的研究较少。对国内外近10年有关miRNA参与萜类生物合成的研究进行综述,以期为高效获取萜类活性成分和阐明萜类药效物质的生物合成提供参考。     

阳春砂与海南砂BPPS启动子比较及GCN4-motif正调控作用的鉴定

目的 龙脑基二磷酸合酶(bornyl diphosphate synthase,BPPS)是砂仁药效萜类合成途径中的关键酶,获得海南砂AlBPPS的启动子并与阳春砂AvBPPS启动子进行调控元件和瞬时表达的比较,以期解析AvBPPS在种子中高表达的分子机制。方法 通过FPNI-PCR的方法从海南砂gDNA中克隆AlBPPS的启动子,并与阳春砂AvBPPS启动子进行序列比较,对启动子相似区域进行截短,获得其相应的截短片段;对AvBPPS启动子截短片段中的GCN4-motif进行突变;构建由上述启动子驱动β-葡萄糖苷酸酶基因(β-glucuro-nidase gene,GUS)的重组表达载体,利用农杆菌介导法注射侵染本氏烟草叶片进行瞬时表达,验证启动子的活性和GCN4-motif的功能。结果 克隆获得365 bp的AlBPPS启动子序列,3''端约300 bp的序列与AvBPPS启动子的相应序列相似度高达93%,但AlBPPS启动子不含有AvBPPS启动子的GCN4-motif。构建成功与GUS报告基因融合的系列启动子重组载体——VBP∷GUS(AvBPPS启动子全长)、VBPT∷GUS(AvBPPS启动子截短至320 bp)、VBPT-GM∷GUS(截短AvBPPS启动子且突变GCN4-motif)和LBP∷GUS(AlBPPS启动子全长)、LBPT∷GUS(AlBPPS启动子截短至305 bp)。通过GUS染色发现虽然上述启动子均具有驱动GUS基因转录的活性,然而,含有GCN4-motif的启动子,包括全长或截短的AvBPPS启动子(VBP∷GUS和VBPT∷GUS)的活性均高于GCN4-motif突变(VBPT-GM∷GUS)或无GCN4-motif的启动子(LBP∷GUS和LBPT∷GUS)。结论 GCN4-motif对基因转录具有正调控作用,为进一步探究AvBPPS启动子的调控机制奠定了基础。     

铁皮石斛DcCDPK8基因启动子克隆及功能分析

铁皮石斛钙依赖性蛋白激酶基因DcCDPK8参与低温激素ABA和MeJA的信号转导过程,但转录调控尚不明确,为了研究铁皮石斛DcCDPK8基因的核心启动子区域,并对其转录调控机制进行探讨,采用PCR技术克隆铁皮石斛DcCDPK8基因启动子序列,并利用5'端缺失和GUS基因的融合表达研究启动子序列功能。结果表明DcCDPK8基因启动子序列含有1个低温响应元件LTR(-1 749～-614 bp),2个茉莉酸甲酯响应元件(-1 749～-230 bp)和1个ABA响应元件(-614～-230 bp),构建3个5'端不同缺失片段融合GUS报告基因的p BI121真核表达载体,瞬时转化烟草叶片,经低温胁迫后GUS活性强弱为DcCDPK8-p1DcCDPK8-p2 DcCDPK8-p3,经外源ABA诱导后GUS活性DcCDPK8-p1 DcCDPK8-p2 DcCDPK8-p3,而经外源MeJA诱导后GUS活性DcCDPK8-p1DcCDPK8-p2DcCDPK8-p3,推测DcCDPK8基因启动子序列中ABA响应元件(ARE)对外源ABA的响应起正调控作用,而MeJA顺式作用元件对外源茉莉酸甲酯响应起抑制作用。     

樟树化学型形成关键萜类合酶的系统鉴定

樟树Cinnamomum camphora为我国重要的经济树种。根据叶片挥发油中主要成分的种类和含量,樟树通常被分为龙脑型、樟脑型、芳樟醇型、桉叶油型和橙花叔醇型5种化学型,萜类合酶(terpene synthase, TPS)是形成这些化合物的关键酶。虽然多个关键酶基因已得到鉴定,但最具经济价值的(+)-龙脑的生物合成途径未见报道。该研究通过对4种化学型叶片的转录组分析,克隆了9个萜类合酶基因CcTPS1～CcTPS9。经过大肠杆菌诱导表达重组蛋白后分别以香叶基焦磷酸(GPP)和法尼基焦磷酸(FPP)为底物进行酶促反应,结果CcTPS1和CcTPS9均可催化GPP生成冰片基焦磷酸,并在磷酸水解酶的作用下得到(+)-龙脑,产物占比分别为0.4%、89.3%。CcTPS3和CcTPS6均可催化GPP生成单一产物芳樟醇,CcTPS6还可与FPP反应生成橙花叔醇。CcTPS8与GPP反应生成1,8-桉叶油(30.71%)。9个萜类合酶共计产生9个单萜和6个倍半萜类化合物。该研究首次确定樟树中负责(+)-龙脑生物合成的关键酶基因,为进一步阐明化学型形成的分子机制及利用生物工程技术培育高产龙脑新...     

辐射诱变对阳春砂果实挥发性萜类成分合成的影响

目的:分析辐射诱变对阳春砂果实中挥发性萜类成分的影响,为阳春砂辐射诱变育种提供实验依据.方法:提取辐射诱变株系和对照株系果实鲜品中果皮和种子团的挥发性萜类成分,采用GC-MS法分析挥发性萜类成分的种类和含量.结果:辐射诱变可提高阳春砂种子团中α-蒎烯、β-蒎烯、异松油烯、y-萜品烯、β-石竹烯、檀香烯的含量,挥发性萜类...     

丹参NAC基因家族全基因组鉴定及表达研究

目的 基于基因组数据鉴定丹参NAC家族转录因子（SmNACs）基因,并对其进行生物信息学与表达模式分析,为进一步深入阐明其基因功能提供依据。方法 从丹参基因组数据库中鉴定出SmNACs基因,运用生物信息学方法及在线工具分析其结构特征,启动子顺式作用元件,编码蛋白的理化性质、亚细胞定位等,采用实时荧光定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）测定SmNACs基因在丹参受到茉莉酸甲酯（MeJA）胁迫时的表达模式。结果 从丹参的基因组中共确定了84个SmNACs基因（SmNAC01~SmNAC84）,不均等分布于8条染色体上,编码蛋白的氨基酸长度为120~794 aa,等电点为4.27~10.28;基因结构显示SmNACs基因基本都含有1~10个内含子;上游启动子含有与激素、逆境胁迫应激相关的ABRE、MBS、ARE、LTR、CGTCA-motif、TGACG-motif等顺式作用元件;构建丹参、南丹参与拟南芥的NAC家族成员的系统发育树,将84个SmNACs基因分为23个亚族。转录组数据显示SmNACs基因在丹参不同组织中差异表达,其中7个SmNACs基因在根中的表达水平较高;MeJA处理后,17个SmNACs基因表达水平明显上调,20个SmNACs基因表达水平明显下调。qRT-PCR表达分析发现,MeJA处理后,12个SmNACs基因的表达模式随着激素处理时间的增加呈现上调或下调的趋势,SmNAC09、SmNAC15、SmNAC16受MeJA诱导后48 h表达水平显著上调,SmNAC20、SmNAC77、SmNAC78受MeJA诱导表达水平下调。结论 研究结果为进一步解析SmNACs基因在丹参逆境响应及次生代谢产物生物合成中的调控机制提供了参考。     

菊花脑芳樟醇合酶基因CnTPS1的克隆与原核表达分析＊

目的 克隆菊花脑芳樟醇合酶基因CnTPS1的全长编码序列，利用原核系统表达融合蛋白，为进一步研究该基因在菊花脑萜类合成中的功能提供理论依据。方法 以菊花脑基因组数据为基础，设计特异性引物，PCR扩增CnTPS1的全长编码序列，利用生物信息学分析软件分析序列特征。利用qRT-PCR技术分析CnTPS1基因在不同组织中的基因表达量。构建原核表达载体，体外诱导目的蛋白表达。结果 CnTPS1编码序列全长1749bp，编码582个氨基酸；基因表达模式分析表明该基因在茎和管状花中表达量较高；原核表达系统能诱导出67.58kDa大小的蛋白。结论 首次从菊花脑中克隆得到一个芳樟醇合酶基因CnTPS1，运用生物信息学方法对其编码蛋白的理化性质、结构特征等进行了分析预测，分析了该基因的组织表达模式，并在原核表达系统中成功诱导表达出目标蛋白，这些结果将为菊花脑萜类合酶基因的功能以及萜类物质生物合成途径的解析提供理论依据。     

雷公藤贝壳杉烯酸氧化酶基因的全长cDNA克隆与表达分析

贝壳杉烯酸氧化酶(kaurenoic acid oxidase)是二萜赤霉素生物合成途径上的关键酶,参与植物生长发育等重要生物学过程。该文根据雷公藤转录组数据设计特异性引物,采用PCR技术克隆得到贝壳杉烯酸氧化酶全长c DNA序列,并进行生物信息学分析;使用实时定量PCR(qRT-PCR)研究基因的诱导表达水平。克隆得到Tw KAO长度为1 874 bp,编码487个氨基酸,蛋白相对分子质量56.02 k Da,理论等电点8.89;经茉莉酸甲酯(Me JA)诱导后,Tw KAO基因相对表达量在12 h达到峰值;经植株组织表达分析证实,Tw KAO基因在雷公藤的叶中表达量最高,根中最低。该研究首次克隆得到雷公藤KAO基因,并分析其mRNA表达特征,为深入研究雷公藤生长发育以及萜类活性成分次生代谢研究奠定基础。     

濒危南药白木香萜类合成酶的逆境表达模式分析

目的 通过分析各萜类合成酶的表达,预测各种环境因素和逆境处理对白木香萜类合成的影响.方法 对二年生白木香植株和愈伤组织分别进行多种逆境处理,采用荧光定量PCR分析组织中萜类合成酶基因的表达模式.结果 伤害和火烙均可诱导茎干萜类合成酶转录水平的表达,火烙法诱导效果更明显;低温抑制各类萜类合成酶的转录;愈伤组织的处理中,茉莉酸甲酯(MeJA)对萜类合成酶转录的诱导效果最显著.结论 伤害和火烙均可诱导茎干中萜类的合成,但火烙效果更好,低温不利于白木香结香,多种处理均可诱导愈伤组织萜类合成,其中MeJA诱导效果最佳.     

牛樟芝鲨烯环氧酶基因的克隆、生物信息学及表达分析

目的克隆牛樟芝三萜合成途径中鲨烯环氧酶基因(AcSE),并进行生物信息学和表达差异分析。方法以牛樟芝菌丝体cDNA为模板,利用快速末端扩增(RACE)进行AcSE序列扩增,利用生物信息学分析AcSE基因的理化性质并预测其蛋白二级结构、三级结构及其功能;同时利用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)测定不同培养时间的液体牛樟芝菌丝体及子实体中AcSE基因的表达情况。结果 AcSE的cDNA全长1 446 bp(Gen Bank编号:KT070558),编码481个氨基酸,相对分子质量为53 300,等电点为6.36。结构域分析表明AcSE内含3个跨膜的结构域,无卷曲螺旋结构,且疏水区和亲水区交替存在。AcSE的g DNA全长为1 607 bp,含4个外显子和3个内含子。AcSE在液体培养7 d的牛樟芝菌丝体中表达量最高,为子实体的7.89倍,且随着培养时间的延长逐渐下降。结论首次从牛樟芝中克隆了AcSE基因,为进一步阐明该基因在牛樟芝三萜合成途径中的作用奠定基础。     

三七香叶基香叶基焦磷酸合酶基因的克隆及表达分析

基于三七转录组测序结果,选择萜类代谢骨架上香叶基香叶基焦磷酸合酶基因(GGPPS),结合RACE技术,克隆得到全长1 203 bp的cDNA序列,最长开放阅读框为1 035 bp,命名为PnGGPPS,GeneBank登录号为KM486564,PnGGPPS基因全长2 370 bp,包含1个内含子和2个外显子,该基因编码344个氨基酸,与蓖麻Ricinus communis、丹参Salvia miltiorrhiza等植物GGPPS的同源性达到73%以上,具有富天冬氨酸区等多个结构域,属于类异戊二烯合成酶超家族。实时荧光定量PCR结果显示,PnGGPPS在一至三年生三七的根、茎、叶和三年生的花等不同器官组织中均有表达,但以三年生叶中具有显著水平的高表达量,暗示其既具有调节三七生长发育的基本功能,也与三七叶绿素和类胡萝卜素的合成、叶绿体的发育、阴生适应性,以及品质的形成有关。     

马蓝BcASB基因的克隆、生物信息学及表达分析

目的克隆马蓝邻氨基苯甲酸合成酶(anthranilate synthase,AS)BcASB基因(GenBank登录号QCF61930.1),并对其进行生物信息学分析、时空表达分析以及检测马蓝有效成分靛蓝、靛玉红积累量随时间的变化。方法通过RT-PCR和RACE技术,克隆BcASB基因全长,应用生物信息学的方法对该基因编码的蛋白进行各种理化性质测定,二级结构和三级结构预测分析以及对核苷酸和氨基酸序列进行比对;利用qRT-PCR技术检测BcASB基因在马蓝不同器官(根、茎、叶)中的表达模式以及在外源诱导子茉莉酸甲酯(methyl-jasmonate,MeJA)、脱落酸(abscisic acid,ABA)、水杨酸(salicylic acid,SA)和乙烯利(ethylene,ETH)诱导下的表达情况;同时运用HPLC测定吲哚类生物碱靛蓝、靛玉红含量的变化情况。结果克隆获得BcASB基因,开放阅读框(open reading frame,ORF)长度为765 bp,编码256个氨基酸,生物信息学表明,该蛋白不含信号肽且无跨膜区,亚细胞结构定位于叶绿体;qRT-PCR检测结果表明,BcASB基因在马蓝叶和茎中的表达量较高,在根中表达较低;BcASB基因可响应不同外源诱导处理,而影响其转录;HPLC检测结果显示靛蓝、靛玉红含量有着明显的变化。结论成功克隆马蓝邻氨基苯甲酸合成酶BcASB基因,为进一步阐释该基因在马蓝吲哚类生物碱合成途径的作用及表达调控研究奠定基础。