重叠PCR法构建宫颈癌相关的EGFR基因G719S和T790M融合重组载体

目的构建包含与宫颈癌相关的EGFR基因G719S和T790M位点重组p MD19-exon18-exon20载体,为制备突变型EGFR基因重组载体提供模板。方法以健康人全血基因组DNA作为模板,设计2对有重叠互补区的特异性引物,对EGFR基因的exon18和exon20两片段分别进行扩增,用重叠PCR技术将exon18和exon20片段进行连接,再将连接产物exon18-exon20片段插入p MD19-T质粒,构建成野生型p MD19-exon18-exon20载体,转入至大肠埃希菌感受态细胞DH5α中进行表达,利用菌液PCR和基因组测序进行鉴定。结果琼脂糖凝胶电泳结果显示,exon18和exon20两位点扩增片段在778 bp和596 bp处有清晰的目的条带,两片段的融合产物exon18-exon20片段可在1 374 bp处见一清晰目的条带;经菌液PCR和基因组测序结果鉴定,EGFR基因融合重组质粒均与预期结果一致。结论利用重叠PCR法将exon18和exon20片段进行融合,且成功构建了EGFR基因重组表达载体。     

重叠PCR法构建PTEN基因3位点的融合重组载体

目的构建包含与子宫内膜癌相关的PTEN基因3位点的重组p MD19-exon 5-exon 8载体。方法以健康人全基因组DNA为模板,设计2对有重叠区的特异性引物分别扩增PTEN基因的exon 5和exon 8片段,利用重叠PCR技术,将exon 5和exon 8片段进行连接,再将连接产物exon 5-exon 8片段插入p MD19-T质粒,构建成重组p MD19-exon 5-exon 8载体,转化入大肠埃希菌感受态细胞DH5α进行表达,利用菌液PCR和基因组测序进行鉴定。结果 exon 5-exon 8片段经凝胶电泳检测,可在1 253 bp处见一清晰的目的条带,PTEN基因融合重组质粒经菌液PCR及测序结果鉴定,均与预期结果一致。结论应用重叠PCR法将exon 5和exon 8片段进行融合,并成功构建了PTEN基因融合重组表达载体。     

两种巢式PCR检测慢性粒细胞白血病患者骨髓移植后微小残留病的比较

目的比较2种巢式聚合酶链反应(PCR)检测骨髓移植后慢性粒细胞白血病(CML)患者微小残留病。方法分别用一步法逆转录-PCR(RT-PCR)和两步法RT-PCR2种巢式PCR检测骨髓移植后CML患者BCR-ABL融合基因，并做2种方法的灵敏度实验。结果2种巢式PCR灵敏度实验中，一步法RT-PCR和两步法RT-PCR的巢式PCR可分别检测出0．1和1PgK562细胞总RNA中的BCR-ABL融合基因；同时对19份来自12例骨髓移植后CML患者标本检测，一步法RT-PCR的巢式PCR检测出阳性的最长移植时间为690d；两步法RT-PCR的巢式PCR为415d。结论一步法RT-PCR的巢式PCR检测骨髓移植后CML微小残留病具有较高灵敏度．操作简便快速．特别适用于临床检测。     

噬菌体宿主谱改变核酸分析研究

目的 探讨一种高效提取RNA噬菌体核酸的新方法，并通过核酸分析从基因水平了解宿主谱改变对噬菌体核酸的影响。方法 采用传统的聚乙二醇（PEG）沉淀-蛋白酶消化-酸性酚提取法、Tripure提取法以及抗体沉淀-盐酸胍一步法3种方法分别提取大肠埃希菌f2噬菌体及其宽宿主谱株的RNA，通过琼脂糖凝胶电泳鉴定其纯度。采用兼并引物逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）及随机引物随机扩增多态性DNA聚合酶链反应（RAPD-PCR）比较分析噬菌体宿主谱改变前后其核酸序列组成的变化。结果 抗体沉淀-盐酸胍一步法提取的噬菌体核酸具纯度高、条带完整等优点；f2噬菌体及其宽噬株均为6000bp左右的单链RNA噬菌体；两噬菌体基因cDNA扩增出的RAPD-DNA片段差异明显，其中26条为可区分的DNA带型；噬菌体f2cDNA在450bp附近出现重复性较好的扩增片段，而其宽噬株cDNA在相同条件下未出现扩增产物。结论 抗体沉淀-盐酸胍一步法较其他两种RNA病毒核酸提取法具有明显的优势，具有应用价值的新的RNA噬菌体核酸的提取方法；宽宿主谱噬菌体的宿主特异性裂解效应已从基因水平发生了变化。     

两种巢式PCR检测慢性粒细胞白血病患者骨髓移植后微小残留病的比较

目的　比较 2种巢式聚合酶链反应 (PCR)检测骨髓移植后慢性粒细胞白血病 (CML)患者微小残留病。方法　分别用一步法逆转录 PCR(RT PCR)和两步法RT PCR 2种巢式PCR检测骨髓移植后CML患者BCR ABL融合基因 ,并做 2种方法的灵敏度实验。结果　 2种巢式PCR灵敏度实验中 ,一步法RT PCR和两步法RT PCR的巢式PCR可分别检测出 0 .1和 1pgK5 6 2细胞总RNA中的BCR ABL融合基因 ;同时对 19份来自 12例骨髓移植后CML患者标本检测 ,一步法RT PCR的巢式PCR检测出阳性的最长移植时间为 6 90d ;两步法RT PCR的巢式PCR为 4 15d。结论　一步法RT PCR的巢式PCR检测骨髓移植后CML微小残留病具有较高灵敏度 ,操作简便快速 ,特别适用于临床检测。     

一步法RT-PCR检测急性早幼粒细胞白血病PML-RARα融合基因

目的 建立一步法RT-PCR检测急性平幼粒细胞白血病(acute promyelocytic leukemia,APL)患者PML-RARα融合基因的实验方法并作相关性能评价.方法 设计两对特异性引物,用一步法RT-PCR法检测APL患者PML-RARα融合基因的三种异构体,并用NB4阳性细胞株做稀释试验,得出该方法 的最低检测限;同时对2006年以来华西医院确诊APL患者的PML-RARα融合基因检测和骨硅细胞形态学检查结果进行比较.结果 一步法RT-PCR法检测PML-RARa 融合基因的灵敏度可迭10-4水平;使用两对引物同时扩增,可检出PML-RARα融合基因全部三种异构体;62例经临床和骨髓形态学确诊为APL的患者,其PML-RARα融合基因阳性率为100%.结论 一步法RT-PCR检测APL患者PML-RARα融合基因有很好的灵敏度,临床符合度较高且操作简便快速,样本交叉污染可能性小,临床实用性较高.     

多发性骨髓瘤患者IgH-MMSET基因的检测及其意义

目的：检测多发性骨髓瘤(MM)患由于t(4；14)所形成的IgH-MMSET融合基因，探讨其在MM中的临床意义。方法：采用RT-PER法在25例MM患骨髓标本和MM细胞系NCI-H929中检测IgH-MMSET融合基因，并且通过巢式PCR法提高反应的灵敏度。PCR产物纯化后克隆到pGEM-T载体，并用引物M13 Forward测序。将PCR产物的序列与GenBank进行对照，进一步证实发生易位的基因。结果：作为阳性对照的MM细胞系NCI-H929扩增出一明显条带，长度为438bp，经测序后证实为IgH基因与MMSET基因的融合产物。14号染色体及4号染色体上的断裂点分别位于IgH基因的Cμ区及MMSET基因的第3内含子中。25例MM患的骨髓标本扩增后有3例(12．O％)呈现阳性，经分别测序后证实为IgH-MMSET融合基因，扩增产物的长度分别为237bp、239bp和239bp，三第4染色体的断裂方式均与NCI-H929相同，其中l例缺失了MMSET基因的第4外显子的第74位碱基(A)和第75位碱基(T)。结论：MM患IgH-MMSET融合基因是由于t(4；14)所形成，其发生率为12．O％。IgH-MMSET融合基因的出现可能是MM患预后不良的指标之一。     

PCR检测病原性真菌及其临床应用

选用多数真菌共有的１８ＳrＤＮＡ基因保守区的一对寡核苷酸序列Ｂ４Ｆ和Ｂ４Ｒ为引物 ，用ＰＣＲ方法对病原性真菌的基因进行扩增。检测常见病原性真菌的５个菌属１５种真菌，其扩增产物经琼脂糖电泳均出现一条６８７bp的持异性条带。其ＤＮＡ检出最低限量为１０pg而毛霉菌、大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌均无此条带，３９份临床标本中，培养法１８例阳性，基因扩增检出阳性２０例，实验结果表明该法应有于临床病原性真     

单引物二次PCR法对重组质粒中HBV前C-C基因进行点突变的研究

目的建立单引物二次PCR法对重组质粒中HBV前C-C基因进行4处点突变，并与传统环状突变法进行对比。方法将变异点合成在一对互补引物中，先加入单条引物行PCR扩增，再以产物为模板，加入另一单条引物行PCR扩增。PCR产物加入DpnⅠ酶，切除其中变异前的模板质粒，转化入大肠埃希菌DH5α，卡那霉素培养基筛选阳性菌落增菌测序。结果对该质粒而言，采用单引物二次PCR法预期位点均发生变异，成功率高于传统环状突变法。4个变异后质粒与模板条带位置基本一致，4个质粒的拟变异位点均如预期变异成功，而其他氨基酸无变异。结论单引物二次PCR法进行重组质粒基因突变较传统环状突变法成功率有所提高。     

双错配碱基ARMS结合RE法快速检测FGFR3基因的突变超热点

目的建立快速简便、特异灵敏的鉴定FGFR3基因c．1138G〉A突变超热点的基因诊断方法,为软骨发育不全（ACH）的产前基因诊断或植入前遗传学诊断（PGD）创造条件。方法针对突变率高达95％以上的FGFR3基因的突变热点c．1138G〉A,设计双错配碱基的ARMS特异引物,对已经临床确诊的先证者家系及正常对照和非c．1138G〉A突变的患者对照,分别用普通引物和特异引物进行PCR扩增和直接鉴定,然后对扩增产物进行DNA序列分析及sfcI酶切鉴定。结果用普通引物扩增,对照组和先证者均扩增阳性。sfcI酶切后,对照组仍为一条513bp的带,而患者切出205bp、308bp和513bp三条带;而用ARMS特异引物扩增,则先证者扩增阳性,而对照组扩增阴性,阳性者酶切后产生27bp和418bp两条带。这一切都与预期的结果完全吻合。结论该法快速、特异、准确性高,结合DNA序列分析和酶切鉴定（RE）,可用于ACH高危胎儿的快速产前诊断。     

两例Ph染色体阳性慢性粒细胞白血病患者具有少见型bcr/abl融合基因

目的　研究 2例Ph染色体阳性慢性粒细胞白血病慢性期 (CML CP)患者异常的bcr/abl融合基因结构。方法　分别采用常规的M 及 μ 型bcr/abl融合转录子特异性引物进行逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR) ,对RT PCR扩增产物测序进行序列同源性分析 ,以确定扩增产物的成分及bcr/abl融合转录子类型 ,其中 1例根据测序结果设计引物并通过PCR研究其DNA水平bcr与abl基因融合方式。结果　 2例患者临床表现均符合典型CML CP特征 ,RT PCR扩增后均未见典型的M 及 μ 型扩增带 ,而分别出现一条异常的条带 ,产物大小分别介于M 及 μ bcr/abl之间及小于M bcr/abl。经序列分析证明RT PCR产物均含有bcr及abl基因序列 ,例 1的bcr基因断裂发生在第 18外显子 (e18)内部 ,abl基因融合位点为常见的外显子 2 (a2 )处 ,它们之间插入了 4 0bp的部分abl基因内含子 1b序列 ,为一种新型的符合阅读框架结构的bcr/abl融合转录子e18 int a2。经PCR证明该融合发生在DNA水平。例 2的融合转录子中缺失典型M bcr/abl(b2a2 )融合基因中abl基因外显子 2 (a2 ) ,为e13a3(b2a3)型。结论　少见型bcr/abl融合基因可见于典型Ph染色体阳性CML患者并产生异常的RT PCR扩增带。     

3种基因分型方法在鲍曼不动杆菌中的应用评价

目的比较3种基因分型方法在鲍曼不动杆菌中的应用。方法采用琼脂稀释法检测重症监护室(ICU)分离的30株鲍曼不动杆菌的最小抑菌浓度(MIC);分别以肠杆菌科基因间重复一致性序列(ERIC)、基因外回文重复序列(REP)及随机多态性核苷酸序列(RAPD)为引物进行PCR扩增,利用电泳指纹图谱进行基因分型,并进行聚类分析。结果 30株鲍曼不动杆菌仅对头孢哌酮/舒巴坦有较低的耐药率;ERIC-PCR基因分型法的扩增条带最为丰富,能扩增出4~7个条带,RAPD和REP-PCR扩增条带较少,分别扩增出1~5和1~4个条带;3种方法分别将30株鲍曼不动杆菌分为4、4、3个群。结论头孢哌酮/舒巴坦对于多重耐药鲍曼不动杆菌依然有较好的敏感性;本试验初步证实3种方法均可作为鲍曼不动杆菌基因分型的可选方法,ERIC-PCR较另外两种方法扩增条带更丰富,分辨率更好。     

人骨形态发生蛋白4成熟肽cDNA的克隆及测序

背景:研究表明骨形态发生蛋白4 的骨诱导能力最强,但在组织中含量甚微.目的:克隆人骨形态发生蛋白4 成熟肽基因.方法:从人胎盘组织中提取信使核糖核酸,根据基因库人骨形态发生蛋白4 基因序列合成两条引物,利用一步法反转录聚合酶链式反应技术扩增出人骨形态发生蛋白4 成熟肽的基因序列,将聚合酶链反应扩增产物基因片段连接克隆载体质粒中转化大肠杆菌DH5a 进行克隆筛选鉴定及测序.结果与结论:琼脂糖凝胶电泳检测反转录聚合酶链式反应产物及阳性克隆质粒经双酶切产物显示一长约370 bp 的条带,脱氧核糖核酸测序结果与基因库中的序列相符.结果证实,利用反转录聚合酶链式反应技术可成功的从人胎盘组织中克隆出人骨形态发生蛋白4 成熟肽基因.     

人骨形态发生蛋白4成熟肽cDNA的克隆及测序

背景：研究表明骨形态发生蛋白4的骨诱导能力最强,但在组织中含量甚微。目的：克隆人骨形态发生蛋白4成熟肽基因。方法：从人胎盘组织中提取信使核糖核酸,根据基因库人骨形态发生蛋白4基因序列合成两条引物,利用一步法反转录聚合酶链式反应技术扩增出人骨形态发生蛋白4成熟肽的基因序列,将聚合酶链反应扩增产物基因片段连接克隆载体质粒中转化大肠杆菌DH5α进行克隆筛选鉴定及测序。结果与结论：琼脂糖凝胶电泳检测反转录聚合酶链式反应产物及阳性克隆质粒经双酶切产物显示一长约370bp的条带,脱氧核糖核酸测序结果与基因库中的序列相符。结果证实,利用反转录聚合酶链式反应技术可成功的从人胎盘组织中克隆出人骨形态发生蛋白4成熟肽基因。     

人早老素15’端390碱基片段的真核表达载体的构建与鉴定

目的：构建表达人早老素1N端部分肽段的基因重组质粒。 方法：实验于2004-12／2005一01在北京老年医学研究所神经生物研究室完成。参照人早老素1mRNA结构设计合成含适当酶切位点的聚合酶链反应引物，从质粒pBS—Presenilins1扩增其5’端390bp的cDNA片段，插人质粒pGEX-4T-1，转化人大肠杆菌BL21（DE3），以异丙基-B-D-硫代半乳糖苷诱导表达，使其在大肠杆菌中表达以谷胱甘肽S转移酶为标签的融合蛋白质。用凝血酶定点分解融合蛋白，并应用亲和层析法纯化早老素1N130肽。 结果：聚合酶链反应扩增产物约400bp，核酸序列分析结果显示，扩增产物为393bp编码130个氨基酸。重组质粒在原核细胞中表达受异丙基-B—D-硫代半乳糖苷诱导呈时间依赖性递增。纯化的目的蛋白在聚丙烯酰胺凝胶电泳上表现为单一条带，其表观相对分子质量为13000。每升菌液可收获目的蛋白4．5mg。 结论：构建人早老素1N端部分肽段的基因重组质粒，制备了基因重组型早老素1N130肽，并确认其亲水特征。     

人抑瘤素M基因重组逆转录病毒载体的构建及鉴定

目的构建携带人Oncostatin M（OSM，抑瘤素M）基因的逆转录病毒载体。方法用DNA重组技术，以pcDNA3．1finyc-his（-）A-hOSM重组质粒为模板PCR扩增人OSM基因，酶切连接到带有GFP标记的逆转录病毒载体pEGZ／MCS．HA上，连接产物转化大肠杆菌DH5a，筛选阳性克隆，抽提质粒，用PCR法、限制性内切酶EeoRI和BamHI双酶切法及测序鉴定。然后以脂质体转染法，将重组的逆转录病毒载体与辅助质粒HIT456、HIT60共同转染入包装细胞系293T以包装病毒。结果构建了重纽人抑瘤素M基因逆转录病毒载体，PCR产物电泳可见约750bp处有特异性条带，EcoRI和BamH，双酶切，电泳出现两个条带，约750bp处亦有相应条带。核酸测序结果与GenBank中所报道的人抑瘤素M基因的CDS序列完全一致。转染293T细胞在倒置荧光显微镜下可见绿色荧光，且细胞有病变。提示构建携带人OSM基因的逆转录载体成功。结论携带人抑瘤素M基因的重组逆转录病毒载体pEGZ／MCS-HA-hOSM成功构建为此基因的临床应用和实验研究奠定了基础。     

东南亚缺失型α地中海贫血的聚合酶链反应快速诊断技术及产前诊断

目的　针对东南亚缺失型α地中海贫血 (- - SEA)建立一种快速、简便的聚合酶链反应(PCR)基因诊断技术 ,并初步应用于高危胎儿的产前诊断。方法　采用跨越断裂点的PCR设计方案 ,其中一对引物用于扩增 - - SEA缺失基因 ,另一对引物设计在 - - SEA、-α3 .7、-α4 .2 的公共缺失区域 ,用于扩增正常的α珠蛋白基因 ,两对引物在单管中反应。用该方法对 8例高风险Bart’s水肿胎进行产前诊断。结果　 - - SEA缺失基因的扩增产物为 740bp ,正常等位基因的扩增产物为 10 5 2bp。进行产前诊断的 8例高风险Bart’s水肿胎 ,检出正常胎儿 3例 ,- - SEA杂合子 3例 ,HbBart’s水肿胎儿 2例。结论　该法快速、准确 ,可作为常规方法用于临床样品的分子筛查及Bart’s水肿胎和缺失型HbH病的产前诊断。     

人早老素1 5''''端390碱基片段的真核表达载体的构建与鉴定

目的:构建表达人早老素1N端部分肽段的基因重组质粒。方法:实验于2004-12/2005-01在北京老年医学研究所神经生物研究室完成。参照人早老素1mRNA结构设计合成含适当酶切位点的聚合酶链反应引物,从质粒pBS-Presenilins1扩增其5’端390bp的cDNA片段,插入质粒pGEX-4T-1,转化入大肠杆菌BL21(DE3),以异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导表达,使其在大肠杆菌中表达以谷胱甘肽S转移酶为标签的融合蛋白质。用凝血酶定点分解融合蛋白,并应用亲和层析法纯化早老素1N130肽。结果:聚合酶链反应扩增产物约400bp,核酸序列分析结果显示,扩增产物为393bp编码130个氨基酸。重组质粒在原核细胞中表达受异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导呈时间依赖性递增。纯化的目的蛋白在聚丙烯酰胺凝胶电泳上表现为单一条带,其表观相对分子质量为13000。每升菌液可收获目的蛋白4.5mg。结论:构建人早老素1N端部分肽段的基因重组质粒,制备了基因重组型早老素1N130肽,并确认其亲水特征。     

人降钙素原的原核表达、纯化和鉴定

目的构建人降钙素原(procalcitonin,PCT)原核表达载体,获得高纯度PCT重组蛋白。方法根据NCBI上PCT基因序列设计引物,利用PCR技术扩增PCT基因,构建PCT/p ET-22b(+)重组表达载体,转化至大肠埃希菌(E.coli)BL21中诱导表达;采用镍柱亲和层析法纯化重组蛋白,用western blot和胶体金法对其进行鉴定。结果琼脂糖凝胶电泳结果显示PCR扩增产物约为350 bp。同源性比对分析结果表明,PCT基因片段(348 bp)成功插入p TG19-T载体,未出现碱基突变。用Bam HⅠ和HindⅢ对重组表达载体双酶切,得到约为350 bp和5 500 bp片段。SDS-PAGE电泳显示PCT重组蛋白以可溶性形式存在,Mr约14 000,经镍柱亲和层析法纯化后即可获得。western blot和PCT胶体金法结果呈阳性,显示融合蛋白含组氨酸标签(His-tag),成功表达出PCT重组蛋白。结论应用重组DNA技术成功构建PCT基因融合重组表达载体,通过蛋白质表达纯化技术获得PCT融合蛋白。     

尿液中大肠埃希菌实时荧光定量聚合酶链反应检测方法的建立

目的建立实时荧光定量聚合酶链反应（RQ—PCR）检测大肠埃希菌的方法,检测泌尿道感染患者尿液样本,评估应用RQ-PCR法在检测大肠埃希菌尿路感染的意义。方法选择大肠埃希菌β-右旋半乳糖苷酶基因作为检测靶基因设计引物,建立SYBRGREENIRQ—PCR检测体系。结果引物特异性好,标准曲线相关系数在0．990～0．996之间。熔解曲线显示产物特异性较强,无非目的条带和二聚体产生。在最低检测限（10^2拷贝／止）以上,能对大肠埃希菌样本进行检测,且重复性好。结论RQ—PCR是一种快速、敏感、特异、重复性好的定量检测大肠埃希菌质粒DNA方法,可用于定量检测临床患者尿液样本中大肠埃希菌含量。